Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda fenotip veya metabolik yolun altında yatan gen ekspresyon profillerini araştırmaktır. Bu, önce iki zıt nematod suşundan mRNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, S, SI, üç veya SFI yakalama dizilerini içeren CD NA'yı sentezlemek ve bunları bir mikrodiziye hibritleştirmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, mikrodiziyi S, SI, üç ve SCIFI floro dörtlüsü içeren anti yakalama dizileri ile hibritleştirmektir. Prosedürün son adımı, mikrodiziyi taramak ve sihirli araç yazılımı gibi biyoinformatik araçları kullanarak verileri analiz etmektir. Sonuç olarak, incelenen biyolojik fenomene aracılık eden aday genler tanımlanır ve gerçek zamanlı PCR gibi alternatif tekniklerle doğrulanabilir ve ölçülebilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü benekli nükleotidler kullanıcı tarafından görülemeyecektir, bu nedenle homojen bir hibridizasyon karışımını 23.000'den fazla üzerine yerleştirmek zordur. Benzersiz şekilde basılmış nükleotidler: Sağlıklı senkronize nematodlardan RNA toplayarak başlayın. İlk olarak, 15 mililitrelik tüplerde yeniden süspanse edilerek yıkanırlar ve peletlenmiş solucan peletleri, yedi mililitre 0.1 molar sodyum klorür ve yedi mililitre buz gibi, hacim başına %60 ağırlıkça sakaroz içinde yeniden süspanse edilir.

Buz üzerinde 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, solucanlar tekrar peletlenir. Artık bakterisiz solucanlar yüzecek, toplanacak, RNA'larda yıkanacak, serbest su ve peletlenecek. Yine, temiz, gevşek bir şekilde sıkıştırılmış pelet, 30 saniye boyunca maksimum hızda döndürülen bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

Aspire edilir ve daha sonra ilerlemeye hazır olana kadar dört santigrat derecede 10 hacim RNA'da saklanır. Toplam RNA örneklerini hazırlamak için, hazırlanan peletleri maksimum hızda santrifüjleyin, süpernatı atın ve pelete bir tutam moleküler öğütme reçinesi ekleyin. Daha sonra karışımı bir havaneli kullanarak sıvı nitrojen kullanarak dondurun.

Donmuş solucan süspansiyonunu, öğütme işleminden sonra tozu soğuk tutmak için gerektiği kadar sıvı nitrojen olan ince bir toz adına öğütün. Özü beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Beş dakika sonra, ekstraktı 700 mikrolitre R-L-T-B-M-E ve 472 mikrolitre toplam %100 etanol ile karıştırın.

RNA artık ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak biyolojik numune başına 60 mikrolitre izole edilmiş RNA'lık bir nihai hacme kadar izole edilebilir. Devam etmeden önce, DNAS ile muamele ederek potansiyel genomik DNA kontaminasyonunu giderin ve ardından ticari olarak temin edilebilen bir RNA temizleme kiti kullanın. 60 mikrolitrelik bir hacme atıfta bulunarak kiti tamamlayın.

Son olarak, RNA konsantrasyonunu belirleyin ve mikrodizi hibridizasyonundan önce glioksal numune yükleme, boya ve jel analizi ile muamele ederek RNA'nın bütünlüğünü değerlendirin Geleneksel yöntemler kullanılarak saflaştırılmış RNA, ticari olarak temin edilebilen bir kit ile bozulmuş şablondan saflaştırılan ve 60 mikrolitrelik bir hacme atıfta bulunulan ücretsiz DNA'ya ters çevrilir. Deniz zarafetini engelleyerek mikrodizi hibridizasyonuna başlayın. Sonikasyonlu somon sperm DNA'sı ile mikrodizi slaytları Bir saat sonra, tıkalı slaytları çift damıtılmış suda eğin ve döndürün.

Slaytları, bir silme mendili ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik tüplerde kurutun. Şimdi iki x form amid bazlı bir hibridizasyon tamponu hazırlayın. İlk olarak, kristallerini tamamen çözmek için 10 dakika boyunca 55 santigrat dereceye ısıtın.

Daha sonra 10.000 g'da bir dakika santrifüjleyin. Daha sonra, 25 mikrolitre CD NA'yı 25 mikrolitre hibridizasyon tamponu ile karıştırın ve karışımı hafifçe vurun. Şimdi karışımı hızlı bir şekilde döndürün ve 80 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, tüm CDNA örneğini slayta dokunmadan mikrodizi slaytına dikkatlice pipetleyin. Numuneyi mikrodizi lamı üzerine eşit şekilde yaymak için. Kapak astarı tamamen indirilmeden önce bir şırınga iğnesi kullanarak bir kapak kızağını sürgünün üzerine yavaşça indirin, tekrar yukarı çekin ve iğne ile tekrar indirin ve kapak kaymasının yavaşça yerine düşmesine izin verin.

Bu teknik hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirir. Şimdi slaytı yatay olarak 50 mililitrelik konik bir tüpe, sürgünün altına 50 mikrolitre çift damıtılmış suya yerleştirin ve ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. Slayt yıkandıktan kısa bir süre sonra ikinci bir hibridizasyon gerçekleştirilir.

SSC'de birden çok kez, ışığa duyarlı yakalama reaktifleri ve bir Antifa reaktifi içeren ikinci tampon, aynı teknik kullanılarak uygulanır ve ardından kısa bir inkübasyon, daha fazla yıkama ve kurutma yapılır. Slayt daha sonra taranabilir. Görüntüler, açık kaynaklı sihirli bir araç ile ücretsiz yazılım kullanılarak analiz edilebilir.

Kısaca proje sekmesi altında, yapı ifadesi profili sekmesi altında yeni bir proje oluşturun ve kaydedin, görüntü çiftini yükle'yi seçin ve kırmızı görüntü dosyasını kırmızı ve yeşil görüntü dosyasını yeşil olarak seçin. Ardından yapı ifadesi profili sekmesini seçin. GCAT web sitesinden alınan bir C elegance gen listesi dosyasını mikrodizi görüntüsünü adreslemek ve ızgaralamak için yüklemek için gen listesini yükle'yi seçin.

Derleme ifadesi profili sekmesini seçin ve ızgarayı düzenle seçeneğini belirleyin. Şimdi ızgarayı düzenleyin. Izgara sayısı için 48, her ızgara için 22 satır ve 22 sütun kullanarak ve noktaları soldan sağa ve yukarıdan aşağıya numaralandırmayı seçerek iletişim kutusunu ayarlayın.

Kontrast değişim yüzdesini artırın ve tek tek noktalar kolayca ayırt edilebilir hale gelene kadar ızgarayı yakınlaştırın. Sol panelde sol üst noktayı ayarla'yı seçerek ve ardından sol üst noktanın ortasına, ardından ızgara üzerindeki sağ üst noktaya ve alt satıra tıklayarak ızgaraları oluşturun. Soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru ilerleyen 48 ızgaranın her biri için bu ızgara prosedürünü tekrarlayın.

Ardından dosya sekmesini seçerek kaydedin ve mevcut ızgarayı bir kez kaydedildiği gibi kaydedin. Analizdeki ilgisiz noktaları ortadan kaldırmak için bitti sekmesini seçin. Yapı ifadesi profili sekmesini açın ve adresleme ızgarası seçeneğinin altında nokta işaretleme'yi seçin.

Şimdi herhangi bir çizgi noktasını veya arka plan floresansını işaretleyin ve mevcut bayrakları kaydet'i seçerek kaydedin. Dosya sekmesinde olduğu gibi, işaretlenen dosyalar bölümlere ayrılmalıdır. Son olarak, ifade sekmesi altında keşfet'i seçerek belirli bir faktör tarafından indüklenen veya bastırılan genleri analiz edin.

Keşif iletişim kutusunda, ince gen eşleştirme kriterlerini ayarlayın. İfadede iki kat artış veya azalma sayısı vardır. Yoğunluk x olarak bilinir ve X'in değeri ifade değişiminin kriteridir.

X, indüklenmiş genler için X'ten büyük maksimum değer ve bastırılmış genler için x'ten küçük minimum değer altında girilir. Bu deneyde, bir boya takas kontrolü gerçekleştirilir, üçüncü aşama ve dördüncü aşama larvalardan iki bağımsız toplam RNA izolasyonu, yeşil mutant ve kırmızı vahşi tip olarak hibritleştirilirken, gen ekspresyonu değişikliklerini doğrulamak için kırmızı mutant ve yeşil vahşi tip, aynı prosedürü kullanarak üç bağımsız toplam RNA izolasyonu yapar, CDNA'yı ticari olarak temin edilebilen bir kit ile sentezler, ve her CD NA örneği için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin ve kontrol olarak üç temizlik geni kullanarak üçleme yapın. Gösterim için, aşağıdaki sonuçlar VSM birinde indüklenen gen ekspresyonunu inceler.

AK 1468 mutantları, mikrodizi analizi yapılmadan önce, gelişmiş sinaptik ile karakterize edilen bir nematod suşu, ekstrakte edilen RNA'nın kalitesi jel elektroforezi kullanılarak kontrol edilir. Bir tedaviden önce ve sonra iki sağlam ribozomal alt birimin varlığı, mikroarray vahşi tipte iyi bir RNA örneğinin göstergesidir, CDNA kırmızı olarak etiketlenir ve VSM, bir mutant CD NA yeşil olarak etiketlenir. Mikrodizi başına analiz edilen 48 ızgaradan birinde, her küçük kare, her dizide tek bir basılı oligonükleotidi temsil eder, her benzersiz oligonükleotid temsil edilir.

Dördüncü evre larvalardan izole edilen transkriptlerin mikroarray analizi, ana sperm proteinlerini veya MSP'yi kodlayan genlerin VSM'de indüklendiğini gösterdiğinde, üçüncü aşama larvaların bir mutant mikrodizi analizi, mutantta aynı gen ailesi içindeki ekspresyon değişikliklerini de ortaya çıkarır. Test etme. Gerçek zamanlı PCR analizi ile mikrodiziden elde edilen tahminler, M ms P gen ailesi MS P 32'nin bir üyesinin VSM bir mutantında indüklendiğini ortaya koymaktadır. Veriler, aynı RNA koleksiyonundan gerçek zamanlı PCR'nin üç kopyasının ortalamasını temsil eder.

Bu videoyu izledikten sonra, özellikle bilim camiasının kullanabileceği birçok açık kaynaklı biyoinformatik yazılım programı olduğunu göz önünde bulundurarak, genom çapında analiz için biyoinformatik araçların nasıl ele alınacağını iyi anlamış olmalısınız.