Name: Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Keşfedin C. elegans gen ifade profillerini mikroarray ve gerçek zamanlı PCR ile. Bu biyoformatik yöntem aday genleri belirleyerek nematod genetik mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Weatherford Tamam Güneybatı Oklahoma State University&#39;de lisans öğrencileri tarafından yapıldı. Bu çalışma, NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT ve OCAST HR09-137S tarafından desteklenen oldu. Vsm1 (ok1468) mutant Oklahoma Gen Nakavt Konsorsiyumu tarafından izole edilmiştir. Yazarlar, Dan Stefanovic ve Tanner Wheeler, projenin yürütülmesi sırasında değerli yardım için teşekkür ederim.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, çeşitli biyolojik olayların altında yatan belirlenen gen ekspresyon profilleri için kullanılabilir, kolay, kullanıcı dostu protokol geliştirmiştir. Bu protokolde, toplam RNA ilk olarak izole ve RNA izolasyon yöntemi dramatik fenol ekstraksiyon atlayarak ve 5,6 kadar temizlemek için yakınlık reçine kullanılarak basitleştirilmiş oldu DNaz I. kullanılarak tedavi edildi . Kısaca, C. elegans derisinden köklerine ve hücre zarları, sıvı azot ve moleküler reçine ile taşlama ile dondurma nematod kırık açık . Ardından, çıkarılan RNA, cDNA sentezi önce DNaz I ile tedavi edildi. Sonraki adım belirsiz döllemeler en aza indirmek için eklendi; genomik DNA ile kontamine RNA örnekleri girişime tanıtmak ve birçok yanlış pozitif üretebilir. Sonra, vahşi tip ve VSM-1 (ok1468) mutant cDNAs Cy3 ve Cy5 yakalama dizileri ile etiketlenmiş ve C üzerine melezleşmiştir elegans mikroarray&#39;ler GCAT programı aracılığıyla elde edilmiştir. Bu sistem, benzer ürünlere göre daha daha duyarlı olup, iki renkli tasarımı, daha fazla zaman ve maliyet verimliliği 7,8, gerekli dizilerin sayısı azalır. Ayrıca, bu sistem diğer benzer sistemleri, özel ekipman gerektirmez, bu nedenle, bu yordamı herhangi bir standart laboratuvar ortamında 7 başarılı olabilir. Üçüncü olarak, floresan melezleşmiş dizi görüntüleri, açık kaynak kodlu yazılım MAGICTool kullanılarak analiz edildi ve gen ekspresyon profilleri oluşturuldu. MAGICTool lisans, doktora sonrası, tüm deneyim seviyesindeki kişiler tarafından kolay kullanılır bir kullanıcı dostu bir programdır. Ancak, optimal performans, geniş bellek kullanımını gerektirir. Son olarak, aday genler, gerçek zamanlı PCR ile valide mikroarray analizi kullanılarak elde edilmiştir. Genomik yaklaşımı biyolojik olgunun eğitim için etkili bir yöntem olmasına rağmen, dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk basılı oligonükleotid korunmuş dizileri alınırsa, bu mikroarray protokol özgüllüğü rağmen, bir aile içinde transkript birbirinden ayırt edilemez. Gerçek zamanlı PCR bir gen ailesi içinde benzerlikler dengeler ve hatta aynı genin belirli izoformları arasındaki farkı ayırt edebilir. Ancak, gerçek zamanlı PCR ile eşit bir organizmanın ömrü boyunca ifade doğrudur denetimlerini bulmak için bir meydan okumadır. Bu nedenle, sonuç bağlı olacaktır. Proteomik yaklaşım, bizim teknik bir alternatif. Bireysel proteinler 2D jel elektroforezi ve kütle spektrometresi ile özdeşleşmiş kullanılarak izole olabilir. Çalışmalarımız özellikle gelişmiş sinaptik yoğunluğu ile VSM-1 mutant nematod indüklenen Binbaşı Sperm Protein (MSP) ailesinin birçok üyesi olduğunu göstermektedir. MSP C&#39;ye kadar özeldir elegans ve oosit olgunlaşma ve yumurtlama için sorumludur. Chai 1 meyve sinekleri nöromüsküler kavşakta presinaptik bouton sayısını ve boyutunu düzenlenmesi büyük olasılıkla Binbaşı Sperm protein etki alanı içeren moleküller tarafından kontrol edildiğini göstermiştir . Tsuda ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalar, 2 Binbaşı Sperm protein etki reseptör tirozin kinaz sinyalizasyon kaskadlar tetikleme, Ephrine reseptörler için ligandlar olarak hizmet verebilir göstermiştir. Ayrıca, gerçek zamanlı PCR analizi, doğrulanmış ve mikroarray sonuçları, msp-32 msp ailesinin bir üyesi aşağı daralmış. Birlikte ele alındığında, burada sunulan iş merkezi bir nörobilim ikilem bir genom analiz gibi bilimsel çaba içinde lisans araştırma gücünü temsil eder.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Katalog # </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> RNA daha sonra </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Moleküler Taşlama Reçine </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Rnase ücretsiz Agaroz LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Jel Hazırlık / Tampon </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal Örnek Yükleniyor Boya </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNaz seti </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT Enzim ve 5X Reaksiyon Tamponu </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Dizi 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Arıtma Kiti </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Somon Sperm DNA makaslanmış </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS Çözüm </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA Sentezi Seti </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Yeşil Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

genetik İfade profilleri belirlenmesi c. elegans mikroarray ve real-time pcr

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Sinapslar hedef hücre sinyalizasyon hücre ve postsinaptik terminal presinaptik aktif bir bölge oluşur. Durumda kimyasal sinaps, mesajlar presinaptik terminaller salınan ve postsinaptik hücreleri üzerindeki reseptörler tarafından alınan nörotransmitterler tarafından yapılmaktadır. Caenorhabditis elegans Bizim daha önceki araştırma, olumsuz VSM-1 ekzositoz düzenleyen göstermiştir . Ayrıca, VSM-1 mutant sinaps analizi göstermiştir ki tamamen işlevsel bir VSM-1 artmıştır sinaptik bağlantı yoksun hayvanlar. Bu ön bulgulara dayanarak, hipotez olduğunu C. elegans VSM-1 sinaptogenez önemli bir rol oynayabilir. Bu hipotezi test etmek için, çift etiketli mikroarray analizi yapıldı ve gen ekspresyon profilleri belirlendi. İlk olarak, total RNA izole edildi, ters cDNA transkripsiyonu ve DNA mikrodizilerinin melezleşmiştir. Sonra,-siliko floresan prob hibridizasyon analizi en büyük sperm protein ailesi (MSP) üyeleri kodlayan birçok genin mutant gelişmiş sinaptogenez önemli indüksiyon saptandı. MSP C. sperm en önemli bileşeni elegans ve nematod oosit olgunlaşması ve ovulasyon sinyal görünür. Meyve sinekleri, Chai ve arkadaşları 1 MSP-benzeri moleküller, nöromüsküler kavşakta presinaptik bouton sayısını ve boyutunu düzenleyen olduğunu göstermiştir . Ayrıca, Tsuda ve arkadaşları tarafından yapılan analiz 2 MSP Efesliler reseptörleri ve tetik tirozin kinaz sinyal kaskadlar ligandlar olarak hareket edebilir önerdi. Son olarak, gerçek zamanlı PCR analizi MSP-32 kodlayan gen VSM-1 (ok1468) mutantlar indüklenen olduğunu doğruladı. Birlikte ele alındığında, laboratuvar tarafından yapılan araştırma, VSM-1 mutantlar sinyalizasyon MSP-32 aracılı olabilir sinaptik yoğunluğunda önemli bir artış olduğunu göstermiştir .

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için yapıldı<em&gt; C. elegans</em&gt; Ve gerçek-zamanlı PCR mikroarray verileri doğrulamak ve ölçmek için kullanılmıştır.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Sinapslar, sinyal veren hücredeki presinaptik aktif bölge ve hedef hücredeki postsinaptik terminalden oluşur. Kimyasal sinapslar söz konusu olduğunda, ...

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda fenotipin veya metabolik yolun altında yatan gen ekspresyon profillerini araştırmaktır. Bu işlem, öncelikle iki zıt nematod suşundan mRNA izole edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, SSI3 veya SFI yakalama dizilerini içeren cDNA sentezlemek ve bunları bir mikroarray ile hibridize etmektir.Prosedürün üçüncü adımı, mikro diziyi S SI üç ve SCIFI floroforları içeren anti yakalama dizileri ile hibritlemektir. Prosedürün son adımı ise mikro dizinin taranması ve magic tool yazılımı gibi biyoinformatik araçlar kullanılarak verilerin analiz edilmesidir. Nihayetinde, araştırılan biyolojik fenomeni yöneten aday genler belirlenir ve gerçek zamanlı PCR gibi alternatif tekniklerle valide edilip miktarları ölçülebilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, damlatılan nükleotidlerin kullanıcı tarafından görülmemesi nedeniyle zorluk yaşarlar; bu durum, homojen bir hibridizasyon karışımının 23.000'den fazla benzersiz şekilde basılmış nükleotid üzerine üst üste getirilmesini zorlaştırır. Sağlıklı, senkronize nematodlardan RNA toplayarak başlayın. Öncelikle, nematodlar yıkanıp 15 mL'lik tüplere yeniden süspande edilir ve peletlenir; solucan peletleri 7 mL 0,1 M sodyum klorür ve 7 mL buz gibi soğuk, %60 ağırlık/hacim sükroz içerisinde yeniden süspande edilir.Buz üzerinde 15 dakikalık inkübasyonun ardından, solucanlar tekrar pelletlenir. Artık bakteri içermeyen solucanlar yukarı yüzecek; bunlar toplanır, RNase'siz su ile yıkanır ve pelletlenir. Ardından, gevşekçe sıkışmış temiz pellet, maksimum hızda 30 saniye boyunca döndürülen bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır. aspire edilip dört derece Celsius'ta, işleme hazır olana kadar 10 hacim RNA later içerisinde saklanmıştır. Toplam RNA örneklerini hazırlamak için, hazırlanan peletleri maksimum hızda santrifüjleyin, süpernatanı atın ve pelete bir tutam moleküler öğütme reçinesi ekleyin. Ardından, karışımı bir havan eli kullanarak sıvı azotla dondurun.Donmuş solucan süspansiyonunu ince bir toz haline gelene kadar öğütün; öğütme işleminden sonra tozun soğuk kalmasını sağlamak için gerektiğinde sıvı azot ekleyin. Ekstraktı beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Beş dakika sonra, ekstraktı toplam 700 µL R-L-T-B-M-E ve 472 µL %100 ethanol ile karıştırın.RNA artık, biyolojik örnek başına 60 µL izole RNA nihai hacmi elde edecek şekilde, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak izole edilebilir. İşleme devam etmeden önce, DNAse I ile işlem yaptıktan sonra ticari bir RNA temizleme kiti kullanarak olası genomik DNA kontaminasyonunu giderin. Kit prosedürünü 60 µL hacme tamamlayarak sonuçlandırın.Son olarak, RNA konsantrasyonunu belirleyin ve mikroarray hibridizasyonu öncesinde glyoxal örnek yükleme boyası ile işlem ve jel analizi yaparak RNA bütünlüğünü değerlendirin. Konvansiyonel yöntemler kullanılarak saflaştırılmış RNA, komplementer DNA'ya ters transkribe edilir; bu DNA, ticari olarak mevcut bir kit ile degrade olmuş şablondan saflaştırılır ve 60 µL hacme getirilir. Mikroarray hibridizasyonuna, mikroarray lamlarını sonike edilmiş somon spermi DNA'sı ile bloke ederek başlayın. Bir saat sonra, bloke edilmiş lamları çift distile su ile yıkayın ve santrifüjleyin.Lamları, bir kim wipe ile desteklenmiş 50 mililitrelik konik tüpler içinde kurutun. Şimdi, iki x formamid bazlı bir hibridizasyon tamponu hazırlayın. Öncelikle, kristallerin tamamen çözünmesi için tamponu 10 dakika boyunca 55 °C'ye ısıtın.Ardından 10, 000 gs'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, 25 µL CD NA ile 25 µL hibridizasyon tamponunu karıştırın ve karışımı hafifçe vura vura çalkalayın. Şimdi karışımı kısa süreli santrifüjleyin (quick spin) ve 80 °C'de 10 dakika inkübe edin.İnkübasyon sonrası, lam yüzeyine temas etmeden tüm cDNA örneğini mikroarray lamı üzerine dikkatlice pipetleyin. Örneğin mikroarray lamı üzerine homojen şekilde yayılması için, bir şırınga iğnesi kullanarak üzerini kapatacak olan lameli yavaşça indirin; lamel tamamen inmeden önce tekrar yukarı çekin ve lamelin nazikçe yerine yerleşmesini sağlayarak iğne ile yeniden indirin.Bu teknik hava kabarcıklarının oluşumunu minimize eder. Şimdi lamı yatay olarak 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin, lamın altına 50 mikrolitre çift distile su ekleyin ve 37 derece Celsius'ta gece boyunca inkübe olmaya bırakın. Ertesi gün, lam yıkandıktan kısa bir süre sonra ikinci bir hibridizasyon gerçekleştirilir.SSC'de, ışığa duyarlı yakalama reaktifleri ve bir Antifa reaktifi içeren ikinci tampon çözelti, benzer bir teknikle birkaç kez uygulanır; bunu kısa bir inkübasyon, daha fazla yıkama ve kurutma işlemi takip eder. Ardından lam taranabilir. Görüntüler, açık kaynaklı magic tool içeren ücretsiz yazılım kullanılarak analiz edilebilir.Proje sekmesinde, ifade profili oluşturma sekmesi altında yeni bir proje oluşturun ve kaydedin; görüntü çiftini yükle seçeneğini belirleyip kırmızı görüntü dosyasını kırmızı, yeşil görüntü dosyasını ise yeşil olarak seçin. Ardından, ifade profili oluşturma sekmesini seçin. Mikroarray görüntüsünü adreslemek ve ızgaraya bölmek için GCAT web sitesinden alınan bir C elegance gen listesi dosyasını yüklemek amacıyla gen listesini yükle seçeneğini belirleyin.Build expression profile sekmesini seçin ve create edit grid seçeneğini oluşturun. Şimdi ızgarayı düzenleyin. Kurulum iletişim kutusunda ızgara sayısını 48, her bir ızgara için 22 satır ve 22 sütun olarak ayarlayın ve noktaları soldan sağa ve yukarıdan aşağıya numaralandırmayı seçin.Kontrast değişim yüzdesini artırın ve tekil noktalar kolayca ayırt edilebilene kadar ızgara üzerinde yakınlaştırma yapın. Sol panelden sol üstteki noktayı seçip ardından önce sol üstteki noktanın merkezine, sonra sağ üstteki noktaya ve birinci ızgaradaki alt sıraya tıklayarak ızgaraları oluşturun. Bu ızgaralama işlemini, soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru ilerleyerek 48 ızgaranın her biri için tekrarlayın.Ardından, dosya sekmesini seçip "mevcut ızgarayı şunun olarak kaydet" seçeneğine tıklayarak kaydedin. Analizden ilgisiz lekeleri çıkarmak için tamamlandı sekmesini seçin. İfade profili oluştur sekmesini açın ve adresleme ızgara seçeneğinin altından leke işaretlemeyi seçin.Şimdi, herhangi bir çizgi oluşmuş noktaları veya arka plan floresansını işaretleyin ve "save current flags" (mevcut işaretleri kaydet) seçeneğini belirleyerek kaydedin. "File" (dosya) sekmesi altında, işaretli dosyalar segmente edilmelidir. Son olarak, "expression" (ekspresyon) sekmesi altındaki "explore" (keşfet) seçeneğini belirleyerek, belirli bir faktör tarafından indüklenen veya baskılanan genleri analiz edin.Keşif iletişim kutusunda, ince gen eşleştirme kriterlerini ayarlayın. İfade düzeyindeki iki katlık artış veya azalış sayısıdır. Yoğunluk x olarak bilinir ve X değeri ifade değişimi için kriterdir.İndüklenen genler için maksimum değer X'ten büyük, baskılanan genler için ise minimum değer X'ten küçük olacak şekilde X girişi yapılır. Bu deneyde, bir boya değişimi (dye swap) kontrolü gerçekleştirilir; evre üç ve evre dört larvalarından elde edilen iki bağımsız toplam RNA izolasyonu, yeşil mutant ile kırmızı yabanıl tip veya kırmızı mutant ile yeşil yabanıl tip şeklinde hibritlenerek gen ekspresyon değişiklikleri doğrulanır. Aynı prosedür kullanılarak üç bağımsız toplam RNA izolasyonu yapın, ticari olarak mevcut bir kit ile cDNA sentezleyin ve her bir cDNA örneği için kontrol olarak üç housekeeping gen kullanarak üç tekrarlı gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. Gösterim amacıyla, aşağıdaki sonuçlar VSM 1'de indüklenen gen ekspresyonunu incelemektedir.Mikrodizilim analizi gerçekleştirilmeden önce, gelişmiş sinaptik özelliklerle karakterize edilen bir nematod suşu olan AK 1468 mutantlarından ekstrakte edilen RNA'nın kalitesi jel elektroforezi kullanılarak kontrol edilir. DNase I işlemi öncesi ve sonrasında iki sağlam ribozomal alt birimin varlığı, mikrodizilim için uygun bir RNA örneğine işaret eder; yabani tip cDNA kırmızıya, VSM 1 mutant cDNA ise yeşile etiketlenir. Mikrodizilim başına analiz edilen 48 ızgaradan birinde, her küçük kare basılmış tek bir oligonükleotidi temsil eder ve her dizilimde her bir benzersiz oligonükleotid temsil edilmektedir.Dördüncü evre larvalardan izole edilen transkriptlerin mikroarray analizi, ana sperm proteinlerini veya MSP'leri kodlayan genlerin VSM one mutantlarında indüklendiğini gösterdiğinde, üçüncü evre larvaların mikroarray analizi de mutantta aynı gen ailesi içinde ekspresyon değişiklikleri olduğunu ortaya koymaktadır. Mikroarray'den elde edilen öngörülerin real-time PCR analizi ile test edilmesi, M ms P gen ailesinin bir üyesi olan MS P 32'nin VSM one mutantlarında indüklendiğini göstermektedir. Veriler, aynı RNA koleksiyonundan elde edilen real-time PCR'ın üç tekrarının ortalamasını temsil etmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, özellikle bilimsel topluluğun erişimine açık birçok açık kaynaklı biyoinformatik yazılım programı olduğu göz önünde bulundurulduğunda, genom çapındaki analizler için biyoinformatik araçların nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

determining-genetic-expression-profiles-c-elegans-using-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Bu yazıda farklı larva dokularında tespit mRNA düzeyleri ve istilacı böcek türlerinin, zümrüt kül delici gelişim evreleri QRT-PCR kullanımı göstermektedir.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

Bu videoda, PCR taraması ile tek bir nematodun genetik bir belirteç için hızlı bir şekilde taranması için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Örnek protokolde, CRISPR tabanlı genom düzenlemeyi tarıyoruz.

Tek Solucan PCR: Genomik DNA'yı Çıkarmak ve Çoğaltmak için Bir Yöntem

Bu protokol, ultraviyole (UV) ışınlaması kullanılarak transgenik ekstrakromozomal dizilerin Caenorhabditis elegans genomuna entegrasyonu için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir prosedürü tanımlar. Ayrıca, bu protokol özellikle ekstrakromozomal dizileri yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

Burada, bir çerçeve geniş menzilli diyet kısıtlaması gen ekspresyonu ve ömrü ile ilgili mevcut. Biz iletişim kuralları bu paradigma altında gen ekspresyonu kantitatif görüntüleme ve geniş menzilli diyet kısıtlaması için açıklar. Daha fazla bilgi işleme özellikleri genetik devrelerin temel gıda algılamalı içinde söz konusu ortaya çıkarmak için hesaplama analizleri anahat.

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Bu protokol, C. elegans'ta RNAi kaynaklı susturma ve ilişkili kromatin modifikasyonlarının epigenetik kalıtımını incelemek için bir RNA girişimini ve ChIP testini açıklar.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Bu protokol, Caenorhabditis elegans'ta mayoz bölünme sırasında çaprazlama frekanslarını ve dağılımını ölçmek için bir yöntem sağlar. Kromozomların kökenini belirlemek için gerçek zamanlı PCR ile tek nükleotid polimorfizm genotiplemesi kullanıldı. 4 noktalı haritalama, her kromozomun sol kol, merkez ve sağ kol bölgelerinin çapraz dağılımlarını belirlemeye izin verdi. ...

Gerçek Zamanlı PCR Kullanılarak SNP Genotipleme ile Caenorhabditis elegans Mayozunda Çaprazlama Sıklığı ve Dağılımı

Keşfedin C. elegans gen ifade profillerini mikroarray ve gerçek zamanlı PCR ile. Bu biyoformatik yöntem aday genleri belirleyerek nematod genetik mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Daha fazla video keşfet