Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Bu video, yerel değişiklikleri gözlemlemek amacıyla yarı otomatik bir program kullanarak, toplu olarak nöritler olarak bilinen dendritlerin ve aksonların morfolojisini analiz etme prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, nörit segmentlerinin konumunu belirlemek için nöronların sekiz bitlik TIFF görüntülerini izlemek üzere Neuron J yazılımı kullanılır. Ardından, nöritler arasındaki bağlantısallıkla ilgili yapısal bilgileri tanımlamak için Neuron Studio yazılımı kullanılır.

Son olarak, sürü analizi ile nörit dal dallanma noktaları ve nörit uçlarının sayısı dahil olmak üzere hücrelerden morfolojik verileri çıkarmak için bonfire MATLAB programı çalıştırılır. Sonuçlar, nörotik ağacın alt bölgeleri üzerinde gerçekleştirilen sürü analizine dayanarak nörit morfolojisindeki yerel değişiklikleri göstermektedir. Bu tekniğin, elle yapılan sürü analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, programın yarı otomatik olmasıdır; bu durum analiz verimliliğini büyük ölçüde artırır ve analizin doğruluğunun doğrulanabilmesi için verilerin denetlenmesine olanak tanır.

Prosedürü, yaz boyunca Firestein laboratuvarında çalışan lisans öğrencisi Hirsch AWA uygulamalı olarak gösterecektir. Bonfire programını kullanarak nöritlerin sekiz bitlik tiff görüntülerinin morfolojik özelliklerini analiz edebilmek için, önce bonfire programı indirilmeli ve ardından tekil nöron görüntülerine erişilmelidir. Program ayarları, analiz etmek istediğiniz görüntülerin çözünürlüğüne göre düzenlenmelidir; bonfire programının parametreler bölümünde, "picks conversion" değişkeni için mevcut değeri, kendi görüntülerinizin çözünürlük değeriyle değiştirin.

bonfire'ın verileri analiz edebilmesi için dosyaların; bir ana klasör, bonfire MATLAB M dosyalarını içeren bir bonfire klasörü, farklı koşulların her birini içeren alt klasörler ve farklı koşul klasörlerinin içinde hücre görüntü dosyaları olacak şekilde belirli bir yapıda düzenlenmiş olması gerekir. Görüntüleri izleme (tracing) için hazırlayarak başlayın. Bu deneyde, dendritik morfolojideki değişiklikleri analiz etmek amacıyla yalnızca dendritler izlenecektir. Görüntüleri izleme için hazırlayarak başlayın.

Neuron J araç çubuğundaki aç (open) düğmesini seçerek görüntüyü açın ve izlemek istediğiniz görüntüyü seçin. Şimdi, tüm nöritleri görselleştirebilmek için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlamak amacıyla ekranı kapla (maximize) düğmesini seçerek görüntüyü yeniden boyutlandırın; Neuron J araç çubuğundan görüntü (image) seçeneğini, ardından parlaklığı/kontrastı ayarla (adjust brightness contrast) seçeneğini belirleyin. İzleme işlemine başlamak için Neuron J araç çubuğundaki iz ekle (add traces) düğmesini seçin. Hücre gövdesinin çevresini takip ederek izleme işlemini gerçekleştirin.

Ardından, neuron J araç çubuğundaki label tracings butonunu seçin ve tracing ID açılır menüsünden N birini seçin, neuron J öznitelikler penceresinde type zero six seçeneğini seçin ve Okay'e tıklayın. Neurite'leri izlemeye başlamak için, neuron J araç çubuğundaki add traces butonunu seçin ve ilgilenilen her bir neurite dalı boyunca bir iz ekleyin. Çizdiğiniz bölümlerin her bir dal noktasında durması ve her bir yan dalın o noktadan yeni bir iz olarak başlatılması en uygun yöntemdir.

Neuron J araç çubuğundaki izleri kaydet butonunu seçin ve az önce oluşturduğunuz izi orijinal görüntü dosyasıyla aynı klasöre kaydedin. Ardından, iz dosyalarını ve iz tanımlayıcı dosyalarını Neuron J'den dışa aktarın. Neuron J araç çubuğundaki izleri dışa aktar butonunu seçin. Şimdi Neuron J dışa aktarma iletişim kutusundaki her iz için ayrı sekme ile ayrılmış metin dosyaları seçeneğini işaretleyin ve Neuron J'nin dosya isimlerini ve kayıt konumunu belirlemesine izin vermek için tamam'ı seçin.

Neuron J araç çubuğundaki measure tracings düğmesini seçin, ardından Neuron J ölçüm penceresindeki display tracings measurements seçeneğini seçin ve run komutunu seçin. Neuron J tracings penceresinde Select file öğesini seçin, ardından save as seçeneğini belirleyerek dosyayı kaydedin. Dosya adı, orijinal görüntü dosyasının adıyla birebir aynı olmalı, ardından alt çizgi info gelmeli ve üç harfli bir dosya uzantısı içermemelidir. Bilgisayarınızın otomatik olarak XLS dosya uzantısı eklemediğini kontrol edin.

Eğer öyleyse, dosya uzantısı manuel olarak silinmelidir. İlk olarak, MATLAB'ı açıp komut penceresinin sağ üst köşesindeki üç nokta düğmesine tıklayarak bonfire load ile klasörleri yeniden düzenleyin. Klasör seçme penceresinde ana klasörünüzdeki bonfire klasörünü seçin, komut penceresine bonfire load yazın ve enter tuşuna basın.

Klasör gözat penceresinden analiz etmek istediğiniz koşul klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın. Bu işlem, her bir hücreye ait tüm verileri içeren hücre alt klasörleri oluşturarak klasör yapısını yeniden düzenleyecektir. Şimdi, dosya adı_premium swc dosyalarını oluşturmak için komut penceresine bonfire_NDF2sWC yazın ve enter tuşuna basın.

Klasör seçme penceresinde, bonfire yüklemesiyle az önce yeniden organize edilen aynı koşul klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın. Bu işlem, seçilen koşul için her hücre klasöründe bir WC dosyası oluşturacaktır. Her hücre klasörü beş dosya içerecektir.

Orijinal TIF görüntüsü, NDF dosyası, alt çizgi bilgisi, iz tanımlayıcı dosyası, bir TXT dosyası ve bir swc dosyası. Neuron Studio'yu kullanmadan önce, programın özelliklerini ve kısayollarını tanımanızı öneririz. Oldukça kapsamlı bir çevrimiçi kullanıcı kılavuzları bulunmaktadır ve klavye kısayollarını bilmek size büyük ölçüde zaman kazandıracaktır.

Başlamak için Neuron Studio programını açın ve Neuron Studio araç çubuğundan "file open" seçeneğini belirleyerek düzenlemek istediğiniz nörona ait TIF görüntüsünü bulup açın. "Run settings" seçeneğini belirleyin ve üç kutucuğun her birine bir değer girin.

Voksel boyutu penceresinde, dosya içe aktarma s wc seçeneğini belirleyin. Çalışmak istediğiniz dosyayla eşleşen uygun s WC dosyasını seçin. Görüntü dosyası artık izleme görüntüsüyle üst üste bindirilecektir.

Hücre soması, nöritleri birbirine bağlamak için kırmızı bir daire ile örtülmelidir. Sarı düğümlerle temsil edilen her dallanma noktasının yalnızca iki dal oluşturabilmesi için düğümleri birleştirmek üzere nörit aracını kullanın. Tüm izler soma ile sürekli olmalıdır.

Neuron Studio'dan verileri dışa aktarmak için dosya (file) menüsünden nöritleri kaydet (save neurites) seçeneğini belirleyin ve swc dosyalarındaki hataları kontrol etmek için varsayılan adla kaydedin; ardından bonfire trace komutunu yazın. Komut penceresine bakın ve enter tuşuna basın. Klasör gözatma penceresinde, az önce işlenen verileri içeren koşul klasörünü seçin ve klasördeki görsellerden herhangi birinde hata varsa tamam (okay) seçeneğine tıklayın.

Program, dot S WC dosyalarından morfolojik verileri çıkarmak için hatanın nerede olduğunu gösteren görüntüler oluşturacaktır. Komut penceresine bonfire yazın ve enter tuşuna basın. Klasör gözat penceresinden analiz etmek istediğiniz koşul klasörünü seçin ve ilgilendiğiniz her bir nöron için tamam seçeneğine tıklayın.

Bonfire analizi, analizde kullanılan omuz halkalarıyla birlikte nöronal morfolojinin bir grafiğini oluşturacaktır. Ek olarak, bonfire komutu, analizden elde edilen tüm morfolojik bilgileri içeren MAT dosyasını oluşturacaktır. Veri tipinin ön grafiklerini görüntülemek için bonfire sonuçlarını MATLAB komut penceresine girin, klasör gözatma penceresinden görüntülemek istediğiniz durum klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın.

Klasör seçme penceresi geçici olarak kapanacak ve ek koşulların seçilmesine izin vermek için yeniden açılacaktır. Koşullar seçildikten sonra, seçim işleminden çıkmak için iptal seçeneğini belirleyin. Bonfire sonucu, seçtiğiniz koşul klasörlerinden gelen verileri içeren özet grafiklar döndürecektir; morfolojik verileri Excel'e aktarmak için bonfire komut penceresine MATLAB Export yazın.

Klasör gözatma penceresinde dışa aktarmak istediğiniz verileri içeren koşul klasörünü seçin ve Tamam'a tıklayın. Bonfire dışa aktarma işlemi, morfolojik verilerin Excel dosyalarını oluşturacak ve bunları seçilen koşul klasörüne yerleştirecektir. Şimdi size, iki koşul içeren bir veri setinde Bonfire programı tarafından oluşturulan verilerin bir örneğini göstereceğiz.

Bunlar, her iki koşulun ters çevrilmiş örnek görüntüleridir. Bu görüntülerden, birinci koşulun ikinci koşula göre daha fazla dendrit içerdiği görülebilir. Bu fenomen, bonfire programı tarafından oluşturulan çeşitli grafiklerde de gözlemlenebilir.

bonfire programı analizlerini dendritlerin alt bölgeleri üzerinde gerçekleştirdiğinden, birinci durumdaki artmış dendritler kolayca tanımlanabilmektedir; toplam dendritik ağacın Sholl eğrisi çizildiğinde, birinci durumdaki nöronlar için hücre gövdesinden daha distalde daha fazla dendrit olduğu görülmektedir. Hücre başına ortalama dal dallanma noktası ve terminal nokta sayısının grafiğe aktarılması, birinci durumun ikinci duruma göre hem daha fazla dallanma noktasına hem de daha fazla terminal noktaya sahip olduğunu göstermektedir. Primer, sekonder, tersiyer veya daha yüksek dereceli dendritler için hücre başına düşen ortalama uzantı sayısı gösterilmiştir. Birinci durum için daha fazla tersiyer ve daha yüksek dereceli dendrit bulunmaktadır; kök, ara ve terminal dendritler için hücre başına düşen ortalama uzantı sayısının grafiğe aktarılması, birinci durumun ikinci duruma göre daha fazla ara veya terminal uzantıya sahip olduğunu göstermektedir.

Burada, segmentlerin birincil, ikincil veya üçüncül veya daha yüksek olarak gruplandırıldığı segment kimliğine özgü shoal analiz eğrileri gösterilmiştir. Birinci durum nöronları için üçüncül dendritlerdeki artış, hücre gövdesinin distalinde meydana gelir. Segmentlerin kök segmentler, ara segmentler veya terminal segmentler olarak gruplandırıldığı segment kimliğine özgü shoal analiz eğrileri gösterilmiştir.

Birinci durumda hem ara hem de terminal dendritlerdeki artış, hücre gövdesine distal bölgede meydana gelir. Bu videoyu izledikten sonra, nöromorfolojideki yerel değişimleri gözlemlemek amacıyla bonfire programı kullanılarak shoal analizinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.