Name: Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Öğrenin, E. coli mutator suşu kullanarak rastgele mutant kütüphanesi oluşturma ve fonksiyonel seçimle yeni enzimatik aktiviteler evrimleştirme yöntemini. Bu protokol endüstriyel ve biyomedikal uygulamalar için yeni biyokimyasal aktiviteler geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, K08 ödül CA116429-04 MC&#39;ye ve Şimdi Conquer Kanser hibe (endişe) temel # 8501 tarafından desteklenen

<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

Bu makale, klonlama veya PCR için gerek kalmadan büyük rastgele mutant kütüphanelerinin oluşturulmasına imkan mutagenez protokol sunar. Bu yöntem bir plazmid kodlama ilgi bir dizi hata eğilimli çoğaltma dayanmaktadır. Teoride, mutasyonların büyük ölçüde RNA / DNA anahtarı hemen akış aşağısında bulunan 100-300 bp sınırlı olmalıdır lideri iplikçik ara boyutunu ben 2,10 Pol tarafından üretilen. Plazmid ori artar (Şekil 3) uzaklık olarak sıklığı azalan ancak bu protokol sunulan koşullar altında, Pol I mutasyonların, tüm plazmid üzerinde meydana geldiği bulundu. Bu bulgu, geçiş veya ColE1 plazmid çoğaltma sırasında Pol III Pol I &quot;anahtarı&quot; en azından bizim deneysel koşulları 2 altında, daha önce rapor edilenden çok daha tedrici olduğunu ima eder ve Pol I ve Pol arasında işlevsel bir fazlalık gösteren daha önceki çalışmaların kabul eder III 11. Bizim orijinal protokol sıvı kültürleri (4) mutagenez nitelendirdi. Bu protokol, RNA / DNA anahtarı (Tablo 1) bitişik 1000 bp içinde 0.41 mutasyonlar / d &lt;1000, yani kb verir. Herhangi bir yeni medya katkısı olmadan 3 gün boyunca çalkalayıcı sıvı kültürü bırakarak Hypersaturation 0.70 mutasyonlar kb / ama sonuç çok kötü plazmid verim (% 1&#39;den daha az 1 gün ile karşılaştırıldığında; veriler gösterilmemiştir) mutasyon sıklığı yükseltir ( Tablo 1). Burada doğrudan 37 katı agar plazmid hedef dönüşümü kaplama dayalı basitleştirilmiş bir protokol mevcut ° C (Şekil 1). Bu prosedür mutagenez mutasyon / döngüsü (0.92 mutasyonlar / d &lt;1000 kb) en büyük frekans üretir ve büyük ölçüde iterasyon kolaylaştırır. Katı ortam kültürü değişen koşullara da mutasyon spektrumu (Tablo 2) etkiler. Doğrudan kaplama mutagenez işaretli (karşılaştırmak C → T vs G → A ve A → G vs T → C) sıvı kültüründe görülen tamamlayıcı baz çifti oyuncu değişikliği arasındaki asimetri azaltır. Öte yandan, doğrudan kaplama daha fazla indels (% 0,5 &#39;den az% 4 dan itibaren) üretilen ve G / C mutasyonlar (% 74) bir overrepresentation yol, 3-kat A → G mutasyonların sayısı azalmış. Genel olarak, burada sunulan doğrudan kaplama protokol daha fazla basitlik ve verimlilik artışı sıvı mutagenez tarafından üretilen biraz daha dengeli bir mutasyon yelpazenin faydaları daha ağır basar inanıyoruz. Plazmid hedef içinde, bizim yöntemi ile üretilen mutasyonlar istenen hedef dizisine sınırlı değildir. Ancak, evrim roman biyokimyasal faaliyetlerin nicel bir değişiklik daha ziyade niteliksel bir temsil olarak, hedef gen içinde mutasyonlar bağımlı olmalıdır. Böylece, degrade plakalar üzerinde mutantlar tarama ile plazmid mutagenez birleştirerek, yeni bir biyokimyasal özellikleri evrim için sistem (büyük kütüphaneler ve seçim durumu) güçlü istifade. Diğer uygulamalar mevcut enzimatik faaliyetleri optimize etmek veya bir genin belirli alanlarda rastgele rastgele mutagenez rastgele mutagenez aşağıdaki klonlama gerektirir. Bu durumda, bir PCR ürünü aksine bir plazmid kütüphane, amplifikasyon ve kısıtlama kolaylaştırarak klonlama verimliliğini artırır. Özetle, biz, sadeliği ve oluşturulan kütüphaneler çeşitliliğine sıyrılıyor belirli bir hedef gen için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Biz bu yöntem, yeni bir biyokimyasal faaliyetlerin verimli evrim için fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, bizim in vivo oluşturulan kütüphaneler, mevcut faaliyetleri siteye özgü mutagenez veya optimizasyon sağlayan, kolay klonlanmış olabilir .

<table><tbody><tr><td>karbenisilin</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>final 0.1mg/ml</td></tr><tr><td>tetrasiklin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>final 0.05mg/ml</td></tr><tr><td>kloramfenikol</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>final 0.03mg/ml</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Yumuşak Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>Kurum içi hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>Akridin Oranj</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam B emülsiyonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>100x100x15mm kare petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>100mm yuvarlak petri kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı 25x75x1mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2mm aralıklı tüpler</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Zippy mini prep kiti</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

proteinlerin yönetmen evolution mutagenez ve fonksiyonel seçim protokolleri e. coli</em

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Genetik çeşitliliğin verimli üretimi, DNA sentezi etiketlemek için tek bir moleküler imza oluşturmak için, ya da laboratuvarda proteinleri gelişmeye kullanılabilir, paha biçilmez bir moleküler aracı temsil eder. Burada, belirli bir hedef dizisi için büyük (&gt; 10 11) mutant kütüphaneler üretimi sağlayan bir protokol mevcut. Bu yöntem ColE1 plazmid DNA polimeraz düşük bir sadakat varyant bir kodlama istenen sırada çoğaltma I (LF-Pol I) dayanmaktadır. Plazmid hedef E. Mutator gerginlik dönüştü. , hedef gen konuma bağlı olarak 0.2 ve 1 mutasyonları / kb arasında verimli coli ve kaplama, katı ortam . Yüksek mutasyon mutagenez bu süreci yineleme frekansları elde edilir. Hiçbir klonlama veya PCR katılan mutagenez alternatif yöntemler ile karşılaştırıldığında, bizim protokol, sadeliği göze çarpıyor. Böylece, yöntem, plazmid ya da diğer Pol I şablonları mutasyon etiketlenmesi ya da orijinal hedef mevcut faaliyetlerinin gelişimi için sırasını alan büyük bölümlerini keşfetmek için ideal. PCR veya randomize oligonükleotid tabanlı yöntemler teklif de kütüphanede belirli bölümlerini sonraki klonlama yoluyla elde edilebilir sıkı mekansal kontrolü. Burada, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için nasıl gösteren protokolleri sağlamak ve E. ilaç tabanlı seçimleri nasıl kurmak için yeni biyokimyasal faaliyetler sergileyen mutantlar tanımlamak için coli.

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Genetik çeşitliliğin verimli bir şekilde oluşturulması, DNA sentezini işaretlemek ve benzersiz moleküler... oluşturmak için kullanılabilecek paha biçilemez bir moleküler araç teşkil eder.

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir hedef DNA dizisi için rastgele bir mutant kütüphanesi oluşturmak ve yarı kantitatif fonksiyonel seleksiyon kullanarak mutantları hızla belirleyip karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle hedef diziyi içeren tek bir replikasyon orijinine sahip bir plazmidin mutator suşuna transforme edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücreler plakalanıp gece boyunca inkübe edildikten sonra hasat edilir ve mutant kütüphanesini elde etmek için hedef plazmid izole edilir; ardından mutant kütüphanesi, protokolün ikinci bölümünde mutasyonları karakterize etmek amacıyla bir okuma suşuna transforme edilir. Bir gradyan büyüme plağı hazırlanır ve okuma suşunun bakteri kültürleri, yumuşak agar içeren ayrı bir Petri kabına yüklenir.Prosedürün son adımı, bu bakteri kültürlerini damgalama yoluyla gradyene aktarmaktır. Nihayetinde, belirli bir hedef dizinin fenotip profilindeki değişikliklerin, ilaç gradyeni üzerindeki büyüme farkları aracılığıyla gösterildiği sonuçlar elde edilebilir. Bu video, e coli'de proteinlerin yönlendirilmiş evrimi için bir yöntemi sunmaktadır.Bu süreç, rastgele besin kütüphanelerinin oluşturulmasındaki doğal evrimi ve ardından bu çeşitliliği kısıtlayan bir seçilimi taklit eder. Böylece, endüstriyel veya biyomedikal amaçlar için yeni biyokimyasal aktiviteler üretme yeteneğimizi artırır. Bu prosedür iki bileşenden oluşmaktadır: rastgele mutant kütüphanesinin oluşturulması ve fonksiyon kazanımı mutasyonlarını elde etmek için yapılan fonksiyonel seçim. Bu prosedürü laboratuvarımdan teknisyen Jennifer Allen uygulamayı gösterecektir.Bu protokole başlamadan önce, yazılı protokolde açıklandığı şekilde önceden hazırlanmış olan, DNA polimeraz birin düşük sadakatli bir varyantını veya düşük sadakatli pol I'i eksprese eden elektrokompetan JS 200 hücreleri hazır bulundurulmalıdır; bu hücreler, 37 °C'de düşük sadakatli pol I aktivitesinin baskın hale gelmesini sağlayan sıcaklığa duyarlı bir pol I aleli içerir. Hedef dizinin replikasyon orijinine bitişik olarak klonlandığı, coli 1 replikasyon orijini içeren bir hedef plazmit oluşturun; düşük sadakatli pol I, coli 1 plazmit replikasyonunu başlatır. Böylece mutajenezi başlatmak için mutasyonlar eklenmiş olur.2 mm'lik bir boşlukta 40 µL elektrokompetan hücre ile 30 ila 250 ng arasında hedef plazmit DNA'yı birleştirin. Karışımı elektroporatörde 1800 V'ta tek bir pulse ile elektropore edin. Her örnek için tekdüze iletim koşullarını sağlamak amacıyla zaman sabitini (TC) kontrol edin.İdeal olarak TC beş ila altı milisaniyedir. Hücre DNA karışımının, 37 °C'de 250 RPM hızında çalkalanarak bir mililitre LB besiyerinde 40 dakika boyunca toparlanmasına izin verin. Her iki plazmidi de seçmek için uygun antibiyotikler içeren, 37 °C'ye önceden ısıtılmış 100 milimetrelik bir LV agro Petri kabı temin edin; toparlanan hücreleri, bu örnekte gösterildiği gibi, belirgin ancak sayılamayacak kadar çok koloni olarak tanımlanan çimlenmeye yakın bir konsantrasyon elde etmek için uygun bir dilüsyonda ekimleyin.Gece boyu inkübasyonun ardından, Petri kaplarındaki bakteri kolonilerini LB besiyeri ile hasat edin. Hasat edilen hücrelerden plazmid DNA'yı izole edin; elde edilen plazmid DNA, rastgele mutant kütüphanesini oluşturur.Hedef plazmidi ve pol plazmidi lineerleştiren bir restriksiyon enzimi ile plazmid kütüphanesini keserek bir restriksiyon sindirimi gerçekleştirin. İzole edilen plazmid DNA'sının kalitesini ve miktarını onaylamak için analitik bir agaroz jel elektroforezi yapın. Plazmidler doğrulandıktan sonra, kütüphanenin bir mikrogramını pol plazmidi lineerleştiren ancak hedef plazmidi kesmeyen bir restriksiyon enzimi ile sindirin.Restriksiyon sindirimi tamamlandıktan sonra, kütüphaneyi bir DNA saflaştırma kiti kullanarak temizleyin. Son olarak, mutasyonları karakterize etmek için temiz kütüphaneyi bir okuma suşuna transforme edin. Gradyan hazırlığına başlamak için, kare petri kabının tabanının bir kenarı boyunca eşit aralıklarla 10 şerit işaretleyin.Çanağı, alt kısımdaki işaretli kenar yedi milimetre yükseltecek şekilde bir eğime yerleştirin. Uygun konsantrasyondaki seçici ajanla iyice karıştırılmış 25 mililitre ılık lb agarı eğimli çanağa dökün. Bu, gradyanın alt tabakasıdır.LB agarın petri kabını, kabın yükseltilmiş işaretli ucunda yaklaşık bir milimetre, alçaltılmış kısmında ise yaklaşık sekiz milimetre LB agar olacak şekilde kapladığından emin olun. Havalandırma için plakayı KU kapakla kapatın ve agarın 10 ila 15 dakika boyunca donmasını bekleyin. LB agarın alt tabakası sertleştikten sonra kabı düz bir yüzeye taşıyın.Ardından, ilk agar yüzeyini kaplamak için, seçici ajan içermeyen 25 mililitre sıcak lb agar dökün ve alt katmanın tamamının kaplandığından emin olun. Havalandırma için plakayı kapakla kapatın ve ardından bakterilerin damga transferini gerçekleştirmek için agarın 10 ila 15 dakika boyunca donmasını bekleyin. İlk olarak, okuma suşunun bakteri kültürlerini elde edin ve bunları 600 nanometrede 1,0'dan düşük bir optik yoğunluğa sahip olacak şekilde, özdeş hücre yoğunluklerine ulaşana kadar seyreltin.Ardından, 42 °C'ye dengelenmiş iki mililitre sıvı yumuşak agarı 100 mm'lik yuvarlak bir Petri kabının tabanına aktarın, 40 µL bakteri kültürünü yumuşak agarın içine pipetleyin ve ardından plakayı sallayarak karıştırın. Cam mikroskop lamının uzun kenarını yumuşak agar karışımıyla kaplayın. Daha sonra, lamın kaplı kenarını gradyan kabındaki alt işaretle hizalayın.Lamı agar yüzeyine dokundurun. Yumuşak agardan bir şeridin gradyan yüzeyine aktarılması için hafif bir dokunuş yeterlidir. Daha sonra lam, temizlenmek ve yeniden kullanılmak üzere kenara alınır.Bu işlemi tekrarlayın. Kalan numuneler ve deneysel kontroller her gradyan plağına dahil edilmelidir. Eğer birden fazla gradyan yürütülüyorsa, gradyan plağını ters çevrilmiş şekilde gece boyunca 37 °C'de inkübe edin; inkübasyon süreleri ve sıcaklıkları farklı okuma bakteri suşları için farklılık gösterebilir, ancak gece boyunca 37 °C'de tutulması genellikle görünür büyüme için yeterlidir.Son olarak, hücre büyümesini yazılı protokolde açıklandığı şekilde görüntüleyin ve analiz edin. Burada, ya mutasyona uğramamış P-G-F-U-V ya da dört tur mutajenezden geçirilmiş bir PG FPUV mutant kütüphanesi ile transforme edilmiş bir okuma suşunun görüntüleri yer almaktadır. Koyu veya soluk koloniler, GFP'yi inaktive eden mutasyonlar içeren plazmidleri göstermektedir.Bu şekil, hedef plazmidin nötral dizisi boyunca her 100 baz çiftlik aralıkta meydana gelen mutasyonların frekansını göstermektedir. Mutasyonların plazmid dizisinin tamamında meydana geldiğine, ancak replikasyon orijinine en yakın bölgede en yüksek frekansta olduğuna dikkat ediniz. Burada, mutantların büyümesi bir ilaç gradyanına karşı gösterilmiştir.Gradyanın üst kısmına doğru büyüme mesafesi, mutantlar arasındaki farklı ilaç direnç profilini göstermektedir. Bu örnekte, insan oksidatif demetilaz ABH two plazmit kütüphaneleri, ilaç seçilim gradyanları kullanılarak metil metan sülfonata karşı artmış direnç gösteren mutantlar için taranmıştır. Mutajenez protokolünün iki ve dört iterasyonunu temsil eden bu kütüphaneler, ebeveyn yabanıl tip ve boş vektör ile karşılaştırmalı olarak gösterilmiştir.Beyaz çizgi, tekil mutant kolonilerin izole edildiği eşik değerini belirtmektedir. Daha ileri fenotipik analizler için, daha önce düşük sadakatli P one mutajenezi ve astri ve m seçimi kullanılarak tanımlanan beta-laktamaz mutantları R 1 64 H ve E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, 0.4 µg/mL ve 4 µg/mL Cefotaxime gradyanı üzerinde gösterilmiştir. Cefotaxime'e karşı koruma, genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz aktivitesine işaret etmektedir.Yabani tip beta-laktamaz enziminin, boş vektör eksprese eden hücrelere kıyasla herhangi bir koruma sağlamadığını unutmayın. Bu nedenle, bu mutantlar bir adaptasyonu veya yeni bir biyokimyasal aktivitenin evrimini temsil etmektedir. Burada, bu yeni biyokimyasal aktivitelerin oluşturulması için mutajenez ve fonksiyonel seçilimin güçlü bir kombinasyonunu sunduk.Fonksiyonel seçim, ya ilaç seçimi ya da genetik komplementasyon yoluyla elde edilebilir ve geniş bir genetik çeşitlilik oluşturma yeteneğimizden yararlanır. Mevcut protein aktivitelerini optimize etmek veya bölgeye özgü mutajenez yapmak için patojenezin belirli bir sekansla sınırlandırılması gerekebilir. Bunlar klonlama yoluyla kolayca gerçekleştirilebilir.Ek olarak, imza saldırıları veya mutasyonel izler elde etmek amacıyla mutajenez, fonksiyonel seleksiyondan ayrıştırılabilir.

mutagenesis-functional-selection-protocols-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Bu makalenin amacı, RING tipi E3 ubikitin ligaseskapsamlı biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar için bir anahat sunmaktır. Ayrıntılı protokollere sahip bu çok aşamalı boru hattı, test edilen proteinin enzimatik aktivitesini doğrular ve aktivitenin işlevine nasıl bağdaştırılabildiğini gösterir.

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Öğrenin, E. coli mutator suşu kullanarak rastgele mutant kütüphanesi oluşturma ve fonksiyonel seçimle yeni enzimatik aktiviteler evrimleştirme yöntemini. Bu protokol endüstriyel ve biyomedikal uygulamalar için yeni biyokimyasal aktiviteler geliştirmeye yardımcı olur.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli

Daha fazla video keşfet