Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir hedef DNA dizisi için rastgele bir mutant kütüphanesi oluşturmak ve yarı kantitatif fonksiyonel seçim kullanarak mutantları hızlı bir şekilde tanımlamak ve karakterize etmektir. Bu, önce bir plazmitin bir coli ile, hedef diziyi içeren bir replikasyon kaynağı olan mutatör suşa dönüştürülmesiyle gerçekleştirilir. Hücreler gece boyunca kaplandıktan ve inkübe edildikten sonra, hasat edilirler ve mutant kütüphaneyi elde etmek için hedef plazmit izole edilir, mutant kütüphane daha sonra protokolün ikinci kısmındaki mutasyonları karakterize etmek için bir okuma suşuna dönüştürülür, Bir gradyan büyüme plakası oluşturulur ve okuma suşunun bakteri kültürleri, yumuşak aer içeren ayrı bir Petri kabına yüklenir.

Prosedürün son adımı, bu bakteri kültürlerinin gradyana damga transferidir. Sonuç olarak, bir ilaç gradyanındaki büyümedeki farklılıklar yoluyla belirli bir hedef dizinin fenotip profilindeki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu video, e coli'deki proteinlerin yönlendirilmiş evrimi için bir yöntem sunmaktadır.

Bu süreç, rastgele besin kütüphanelerinin oluşturulmasındaki doğal evrimi ve ardından bu çeşitliliği kısıtlayan bir seçimi taklit eder. Böylece, endüstriyel veya biyomedikal amaçlar için yeni biyokimyasal aktiviteler üretme yeteneğimizi geliştirir. Bu prosedürün iki bileşeni vardır, rastgele mutant kütüphanesinin oluşturulması ve bu prosedürü gösteren fonksiyon mutasyonlarının kazancını elde etmek için fonksiyonel seçim, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Jennifer Allen olacaktır.

Bu protokolün başlamasından önce, daha önce yazılı protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış olan, DNA polimeraz bir veya düşük sadakat kutbunun düşük sadakatli bir varyantını ifade eden elektro yetkin JS 200 hücreleri düşünüldü, bu hücreler, düşük sadakatli kutup bir aktivitenin 37 santigrat derece baskın olduğu şekilde, birinci kutbun sıcaklığa duyarlı bir aleli içerir, yapmak. Bir coli içeren bir hedef plazmit, replikasyonun orijinine bitişik olarak klonlanan hedef dizi ile bir replikasyon orijini, düşük sadakat kutbu bir coli, bir plazmit replikasyonunu başlatır. Böylece mutajenezi başlatmak için mutasyonların tanıtılması.

40 mikrolitre elektro-yetkin hücreyi ve 30 ila 250 nanogram hedef plazma DNA'sını iki milimetrelik bir boşlukta birleştirin. Elektroporasyon vet nabzı, elektrodaki karışım 1800 voltta. Her numune için tek tip asyon koşullarını sağlamak için zaman sabitini veya TC'yi kontrol edin.

İdeal olarak TC, beş ila altı milisaniyeye eşittir. Hücre DNA karışımının bir mililitre LB suyunda 37 ila Santigrat derecede 40 dakika boyunca 250 RPM'de çalkalanmasına izin verin. Her iki plazmid için seçmek üzere uygun antibiyotikler içeren 37 santigrat dereceye kadar 100 milimetrelik bir LV agro Petri kabı ön ısıtması elde edin, bu örnekte gösterildiği gibi farklı ancak sayılamayan bir koloni sayısı olarak tanımlanan yakın bir çim konsantrasyonu elde etmek için geri kazanılan hücreleri uygun bir seyreltmede kaplayın.

Gece boyunca inkübasyonun ardından, Petri kaplarının bakteri kolonilerini LB suyu ile hasat edin. Plazmiti, hasat edilen hücrelerden DNA'yı, elde edilen plazmiti izole edin. DNA, rastgele mutant kütüphanesini oluşturur.

Plazmit kitaplığını hem hedef plazmidi hem de kutbu doğrusallaştıran bir kısıtlama enzimi ile keserek bir kısıtlama sindirimi gerçekleştirin. Bir plazmit, kalite ve miktarı doğrulamak için izole edilmiş plazmit DNA üzerinde analitik bir aro jeli çalıştırır. Plazmitler doğrulandıktan sonra, kütüphanenin bir mikrogramını, kutup bir plazmiti doğrusallaştıran, ancak hedef plazmidi kesmeyen bir kısıtlama enzimi ile sindirin.

Kısıtlama özeti tamamlandıktan sonra, bir DNA saflaştırma kiti kullanarak kitaplığı temizleyin. Son olarak, mutasyonları karakterize etmek için temiz kütüphaneyi bir okuma suşuna dönüştürün. Degrade hazırlamaya başlamak için, kare petri kabının tabanının bir kenarı boyunca eşit aralıklarla yerleştirilmiş 10 şeridi işaretleyin.

Çanağı, alt işaretli kenar yedi milimetre yükseltilecek şekilde bir eğime yerleştirin. Uygun bir seçici madde konsantrasyonu ile iyice karıştırılmış 25 mililitre ılık lb agar'ı eğimli tabağa dökün. Bu, degradenin en alt katmanıdır.

LB agarın petri kabını, kabın yükseltilmiş işaretli ucu yaklaşık bir milimetre LB agar içerecek ve alçaltılmış kısım yaklaşık sekiz milimetre içerecek şekilde kapladığından emin olun. Havalandırma için plakayı KU kapağı ile örtün ve ağrının 10 ila 15 dakika sertleşmesine izin verin. LB agarın alt tabakası sertleştikten sonra, tabağı düz bir yüzeye taşıyın.

Ardından, ilk tarım yüzeyini kaplamak için seçici madde olmadan 25 mililitre ılık lb agar dökün ve tüm alt tabakayı kapladığınızdan emin olun. Havalandırma için plakayı kapak KU ile örtün ve ardından bakterilerin damga transferini gerçekleştirmek için ağrının 10 ila 15 dakika sertleşmesine izin verin. İlk olarak, okuma suşunun bakteri kültürlerini elde edin ve bunları, 600 nanometrede 1.0'dan daha az bir optik yoğunluğa sahip aynı hücre yoğunluklarına sahip olacak şekilde seyreltin.

Daha sonra, 42 santigrat dereceye dengelenmiş, 100 milimetrelik yuvarlak bir Petri kabının dibine iki mililitre sıvı yumuşak agar aktarın, 40 mikrolitre bakteri kültürünü daha yumuşak olana pipetleyin ve ardından plakayı sallayarak karıştırın. Cam mikroskop lamının uzun kenarını daha yumuşak bir karışımla kaplayın. Ardından, sürgünün kaplanmış kenarını degrade çanak üzerindeki alt işaretle hizalayın.

Slaytı agarın yüzeyine dokundurun. Yumuşak agarın bir şeridini gradyan yüzeyine aktarmak için yumuşak bir dokunuş yeterlidir. Slayt daha sonra temizlik ve yeniden kullanım için bir kenara bırakılır.

Bu işlemi tekrarlayın. Kalan numuneler, deneysel kontroller her bir gradyan çanağına dahil edilmelidir. Birden fazla gradyan çalıştırılıyorsa, gradyan çanağını gece boyunca 37 santigrat derece sıcaklıkta inkübe edin ve inkübasyon sıcaklıkları farklı okuma bakteri suşları için farklılık gösterebilir, ancak gece boyunca 37 santigrat derecede görünür büyüme için yeterlidir.

Son olarak, yazılı protokolde açıklandığı gibi hücre büyümesini görüntüleyin ve analiz edin. Gösterilen. Burada, sesi kapatılmamış P-G-F-U-V veya içinden geçirilen bir PG FPUV mutant kütüphanesi ile dönüştürülen bir okuma suşunun görüntüleri verilmiştir. Dört tur mutajenez koyu veya loş koloniler, GFP inaktive edici mutasyonlar içeren plazmidi gösterir.

Bu şekil, 100 baz çifti aralığında hedef plazmitin nötr dizisi boyunca mutasyonların sıklığını temsil eder. Mutasyonların tüm plazmit dizisi boyunca, ancak replikasyonun kökenine en yakın en yüksek frekansta meydana geldiğine dikkat edin. Burada, mutantların büyümesi bir ilaç gradyanına karşı gösterilmiştir.

Gradyanın tepesine doğru büyüyen mesafe, mutantlar arasındaki farklı ilaç direnç profilini gösterir. Bu örnekte, insan oksidatif demetilaz ABH ikisinin plazmit kütüphaneleri, ilaç seçim gradyanları kullanılarak metil metan sülfonata karşı artan dirence sahip mutantlar için tarandı. İki. Mutajenez protokolünün iki ve dört yinelemesini temsil eden bu tür kütüphaneler, ebeveyn vahşi türü ve boş vektör ile karşılaştırıldığında gösterilir.

Beyaz çizgi, üzerinde bireysel mutant kolonilerin izole edildiği eşiği gösterir. Daha ileri fenotipik analiz için, beta-laktamaz mutantları, R 1 64 H ve E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, daha önce düşük sadakatli P bir mutajenez ve astri ve m seçimi kullanılarak tanımlanmıştır, mililitre başına 0.4 mikrogram ve mililitre başına dört mikrogram üzerinde gösterilmiştir. Sefotaksime karşı sefotaksim gradyan koruması, genişletilmiş spektrumlu beta-laktamaz aktivitesinin göstergesidir.

Yabani tip beta-laktamaz enziminin, boş bir vektörü ifade eden hücrelere göre hiçbir koruma sağlamadığına dikkat edin. Bu nedenle, bu mutantlar adaptasyonu veya yeni bir biyokimyasal aktivitenin evrimini temsil eder. Burada, bu nesil yeni biyokimyasal aktiviteler için mutajenez ve fonksiyonel seleksiyonun güçlü bir kombinasyonunu sunduk.

Fonksiyonel bir seçim, ilaç seçimi veya genetik tamamlama yoluyla elde edilebilir ve büyük genetik çeşitlilik üretme yeteneğimizden yararlanır. Önceden var olan protein aktivitelerini optimize etmek veya bölgeye yönelik patogenez için patogenezin belirli bir sekansla sınırlandırılması gerekebilir. Bunlar klonlama ile kolayca yapılabilir.

Ek olarak, mutajenez, imza saldırıları veya mutasyonel ayak izleri elde etmek için işlevsel bir seçimden ayrılabilir.