Evrim Yöntemi yönettiği

Bu protokolün genel amacı, yönlendirilmiş evrim deneyleri için Saccharomyces Cerevisiae'de mutant kütüphanelerinin nasıl oluşturulacağını ve taranacağını göstermektir. Bu yöntem, montaj ve klonlamada örtüşen alanların nasıl atanacağı gibi, odaklanmış yönlendirilmiş evrim deneyleri için laboratuvar oluşturulmasında kullanılan temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir transformasyon adımında yüksek kalitede düzeylerin atanabilmesi nedeniyle basit ve sağlam olmasıdır.

Mutant kütüphanelerinin oluşturulması ve taranmasına yönelik bu protokol, fungal bir aril-alkol oksidaz veya AAO üzerinde gösterilecektir. Odaklanmış yönlendirilmiş evrim için bölgeler, öncelikle enzimin mevcut kristal yapısı veya homoloji modellerine dayalı hesaplama algoritmaları yardımıyla seçilir. AAO'nun iki bölgesi rastgele mutajenez ve rekombinasyon için hedeflenecektir: M1 bölgesi ve M2 bölgesi.

Hedef bölgeleri amplifiye etmek için mutajenik PCR uygulanacaktır. Mayada in vivo eklemlemeyi (splicing) teşvik etmek için, tanımlanan bölgelerin PCR reaksiyonları üst üste getirilerek, her biri yaklaşık 50 baz çifti olan segmentler arasında örtüşen bölgeler oluşturulacaktır. Her biri 46 nanogram DNA kalıbı, 90 nanomolar sens ve antisens primerler, 0,3 milimolar dNTP'ler, %3 DMSO, 1,5 milimolar magnezyum klorür, 0,5 milimolar manganez klorür ve mikrolitre başına 0,5 ünite Taq DNA polimeraz içeren 50 mikrolitre hacminde mutajenik PCR'lar hazırlayın.

Aşağıdaki PCR programını kullanın. 95 °C'de iki dakika, 95 °C'de 45 saniye, 50 °C'de 45 saniye ve 74 °C'de 45 saniye şeklinde 28 döngü ve ardından 74 °C'de 10 dakika. AAO geninin geri kalanı olan HF bölgesi, mutajenik segmentlerle örtüşen ilgili alanlar ve/veya lineerize vektör çıkıntıları dahil edilerek yüksek sadakatli (high fidelity) PCR ile amplifiye edilecektir.

Yüksek sadakatli (high-fidelity) PCR'ı; 10 nanogram DNA kalıbı, her birinden 250 nanomolar sense ve antisense primer, 0.8 milimolar DNTP'ler, %3 DMSO ve mikrolitre başına 02 ünite iProof ultra yüksek sadakatli DNA polimeraz içeren 50 mikrolitre son hacimde hazırlayın. Şu PCR programını uygulayın: 98 degrees Celsius'ta 30 saniye, ardından 28 döngü boyunca 98 degrees Celsius'ta 10 saniye, 55 degrees Celsius'ta 25 saniye ve 72 degrees Celsius'ta 45 saniye ve son olarak 72 degrees Celsius'ta 10 dakika.

Ardından tüm PCR fragmanları, üreticinin protokolüne uygun olarak ticari bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırılır. Bir sonraki adım, hedef genin beş prime ve üç prime uçlarıyla homolog olan yaklaşık 50 baz çiftlik flanke bölgeler oluşturmak için vektörü lineerize etmektir. 2 µg DNA, 7,5 unit BamH-one, 7,5 unit XHO-one, 20 µg BSA ve 2 µL 10x BamH-one tamponu içeren 20 µL'lik bir lineerizasyon reaksiyon karışımı hazırlayın.

Reaksiyon karışımını 37 °C'de iki saat 40 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, reaksiyonu 80 °C'de 20 dakika boyunca inaktive edin. Linearize edilmiş vektörü, kalıntı sirküler plazmid kontaminasyonunu önlemek amacıyla saflaştırmak için, sindirim reaksiyon karışımını yarı-preparatif düşük erime noktalı Agaroz jelinin mega-kuyucuğuna yükleyin.

Referans olarak, reaksiyon karışımının beş µL'sini bitişikteki kuyucuğa yükleyin. DNA elektroforezini, elektrotlar arasında 4 °C'de ve santimetrede beş volt gerilimle çalıştırın. Ardından, mega-kuyucuğa karşılık gelen agaroz jeli ayırın ve 1X TAE içerisinde 4 °C'de saklayın.

Moleküler ağırlık markörü ve raporlayıcı ile hattı boyayın. Bantları UV ışığı altında görüntüleyin ve lineerleştirilmiş vektörün yerleştiği konumu işaretleyin. UV ışığı olmadan ve boyanmış raporlayıcı hattındaki işaretlerin rehberliğinde, mega-kuyucuktaki fragman içerisinde lineerleştirilmiş vektörü tanımlayın ve kesin.

Lineerize edilmiş vektörü agaroza çıkarın ve üretici protokolüne uygun olarak ticari bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın. Ardından, saflaştırılmış lineerize vektör, PCR fragmanları ile karıştırılır ve bu DNA karışımı, üretici talimatlarına uygun olarak ticari bir kit kullanılarak kompetan maya hücrelerini transforme etmek için kullanılır. Transforme edilmiş hücreleri SC dropout plaklarına ekin ve 30 °C'de üç gün boyunca inkübe edin.

Bu analize hazırlanmak için, SC dropout plaklarından tekil koloniler seçin ve bunları kuyuk başına 50 µL minimal besiyeri içeren 96 kuyucuklu plakalara aktarın. Her plakadaki altıncı sütuna, iç standart olarak parental tipi inoküle edin. Negatif kontrol olarak, urasil ile desteklenmiş SC besiyeri ile doldurulmuş H-bir kuyucuğuna, plazmid içermeyen URA3 negatif ESI visceral hücreleri inoküle edin.

Plakaları kapaklarıyla kapatın, para film ile sarın ve nemli bir çalkalayıcıda 30 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. 48 saat sonra, her kuyucuğa 160 µL ekspresyon besiyeri ekleyin ve plakaları yeniden mühürleyin. 24 saat daha inkübe edin.

Plakaları santrifüj ettikten sonra, her plaktaki kuyucuklardan 20 µL süpernatanı bir replika plaka üzerine aktarmak için sıvı aktarımlı robotik çoklu istasyon kullanın. Her kuyucuğa 20 µL 2 mM P-metoksibenzil alkol ve 100 mM pH 6.0 sodyum fosfat tamponu ekleyin. Plakaları 96 kuyucuklu plaka karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Ardından, her bir replika plakasına 160 µL FOX reaktifi ekleyin ve karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırın. Plakaları bir plaka okuyucuda 560 nm'de okuyun. Renk gelişimi gerçekleşene kadar plakaları oda sıcaklığında inkübe edin.

Absorbansı tekrar ölçün. Relatif aktivite, her plaka için inkübasyon sonrası absorbans değeri ile başlangıçtaki ölçüm değeri arasındaki farkın parental tipe normalize edilmesiyle hesaplanır. Bu temsilci jel görüntüsü; ikinci şeritte lineerize edilmiş vektörü, üçüncü şeritte M1 PCR segmentini, dördüncü şeritte M2 PCR segmentini, beşinci şeritte HF PCR segmentini ve altıncı şeritte NHE 1 ile lineerize edilmiş in vivo yeniden birleştirilmiş vektörü göstermektedir.

Sıradaki jel; ikinci şeritte yeniden birleştirilmiş vektörün plazmid mini-prep'ini, üçüncü şeritte NHE I ile lineerize edilmiş plazmidi, dördüncü şeritte BamH I ve XHO I ile lineerize edilmiş plazmidi ve beşinci şeritte jel ekstraksiyonu ve temizlemesi ile elde edilen lineerize plazmidi göstermektedir. Mutasyon yükleri, farklı manzaralara sahip mutant kütüphanelerinden örnekleme yapılarak, parental enzim aktivitesinin %10'undan daha az olan klon sayısı hesaplanarak ve aktif ve aktif olmayan varyantlardan oluşan rastgele bir örneğin dizilemesiyle yapılan ek doğrulama ile ayarlanmıştır. Bu analizin saptama sınırının değerlendirilmesi, siyah dairelerle temsil edilen sorbitol varlığında analizin lineer olduğunu göstermiştir.

Beyaz karelerle temsil edilen sorbitolün yokluğunda, doğrusallık daha kalıcıydı ancak yanıt daha zayıftı. AAO konsantrasyonu ile absorbans arasında doğrusal bir korelasyon gözlemlendi. 2.000 klondan oluşan bir mutant kütüphanesi oluşturuldu ve bu analizle tarandı.

Gölgeli kare, P-metoksibenzil alkole karşı sekresyonu ve aktivitesi belirgin şekilde artmış AAO mutantlarını belirtmektedir. Uzmanlaşıldığında, uygun şekilde gerçekleştirilirse mutant kütüphaneleri yaklaşık dört saatte hazırlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, tek bir transformasyon adımında in vivo ekleme ve klonlama yapabilmek için her PCR ailesi ve lineerize vektör için uygun örtüşme bölgelerinin atanması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Benzer bir yaklaşım izlenerek, mutant kütüphaneleri ve/veya metabolik yollar oluşturmak amacıyla in vivo DNA örneklemesi, doyurma mutajenize kütüphanesi veya DNA montajı gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyomühendislik alanındaki araştırmacıların aktiviteleri, stabiliteleri keşfetmesinin ve hatta sonsuz çeşit etkileşim icat etmesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kütüphane oluşturma ve tarama için bu Saccharomyces Cerevisiae düzeneğinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız