Evrim Yöntemi yönettiği Saccharomyces cerevisiae: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama
April 1st, 2016
Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Bu protokolün genel amacı, yönlendirilmiş evrim deneyleri için Saccharomyces Cerevisiae'de mutant kütüphanelerin nasıl oluşturulacağını ve taranacağını göstermektir. Bu yöntem, montaj ve klonlamada çakışan alanların nasıl atanacağı gibi odaklanmış yönlendirilmiş evrim deneyleri için laboratuvar oluşturma kullanımındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı basitliği ve sağlamlığıdır, çünkü sadece bir dönüşüm adımında iyi kalitede seviyeler atanabilir.
Mutant kütüphaneleri oluşturmak ve taramak için bu protokol, bir mantar aril-alkol oksidaz veya AAO için gösterilecektir. Odaklanmış yönlendirilmiş evrim bölgeleri, ilk olarak enzimin mevcut kristal yapısına veya homoloji modellerine dayanan hesaplama algoritmalarının yardımıyla seçilir. Rastgele mutajenez ve rekombinasyon için AAO'nun iki bölgesi hedeflenecektir: M1 bölgesi ve M2 bölgesi.
Hedeflenen alanları çoğaltmak için mutajenik PCR yapılacaktır. Mayada in vivo uçbirleştirmeyi teşvik etmek için, tanımlanan bölgelerin PCR reaksiyonlarının üst üste bindirilmesiyle, her biri yaklaşık 50 baz çiftinin segmentleri arasında örtüşen alanlar oluşturulacaktır. Her biri 46 nanogram DNA şablonu, 90 nanomolar, her biri anlam ve antisens primerler, 0.3 milimolar DNTP, %3 DMSO, 1.5 milimolar magnezyum klorür, 05 milimolar manganez klorür ve mikrolitre başına 05 birim içeren 50 mikrolitre hacimli mutajenik PCR'ler hazırlayın.
Aşağıdaki PCR programını kullanın. İki dakika boyunca 95 santigrat derece, 45 saniye boyunca 95 santigrat derece, 45 saniye boyunca 50 santigrat derece ve 28 döngü için 45 saniye boyunca 74 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 74 santigrat derece. AAO geninin geri kalanı, HF bölgesi, mutajenik segmentlerle örtüşen karşılık gelen alanlar ve/veya doğrusallaştırılmış vektör çıkıntıları dahil olmak üzere yüksek kaliteli PCR ile amplifiye edilecektir.
Yüksek kaliteli PCR'yi 10 nanogram DNA şablonu, her biri 250 nanomolar anlam ve antisens primer, 0.8 milimolar DNTP, %3 DMSO ve mikrolitre başına 02 birim içeren 50 mikrolitrelik bir son hacimde hazırlayın. Aşağıdaki PCR programını kullanın. 30 saniye boyunca 98 santigrat derece, 10 saniye boyunca 98 santigrat derece, 25 saniye boyunca 55 santigrat derece ve 28 döngü için 45 saniye boyunca 72 santigrat derece ve 10 dakika boyunca 72 santigrat derece.
Tüm PCR fragmanları daha sonra üreticinin protokolüne göre ticari bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırılır. Bir sonraki adım, hedef genin beş asal ve üç asal ucuna homolog olan yaklaşık 50 baz çiftinden oluşan yan bölgeler oluşturmak için vektörü doğrusallaştırmaktır. 2 mikrogram DNA, 7.5 birim BamH-one, 7.5 ünite XHO-one, 20 mikrogram BSA ve iki mikrolitre 10x tampon BamH-one içeren 20 mikolitrelik bir doğrusallaştırma reaksiyonu karışımı hazırlayın.
Reaksiyon karışımını 37 santigrat derecede iki saat 40 dakika inkübe edin. Bundan sonra, reaksiyonu 20 dakika boyunca 80 santigrat derecede etkisiz hale getirin. Artık dairesel plazmit ile kontaminasyonu önlemek için doğrusallaştırılmış vektörü saflaştırmak için, sindirim reaksiyonu karışımını yarı hazırlayıcı düşük erime noktalı bir Agaroz jelinin mega kuyusuna yükleyin.
Reaksiyon karışımından beş mikrolitreyi bitişik kuyuya ve bir raportöre yükleyin. DNA elektroforezini elektrotlar arasında dört santigrat derece ve santimetre başına beş voltta çalıştırın. Daha sonra mega kuyuya karşılık gelen Agaroz jelini ayırın ve bir XTAE'de dört santigrat derecede saklayın.
Moleküler ağırlık merdiveni ve raportör ile şeridi boyayın. Bantları UV ışığı altında görselleştirin ve doğrusallaştırılmış vektörün yerleştirildiği konumu belirleyin. UV ışığının yokluğunda ve lekeli raportör şeridindeki çentiklerin rehberliğini kullanarak, mega kuyu parçasındaki doğrusallaştırılmış vektörü tanımlayın ve onu çıkarın.
Doğrusallaştırılmış vektörü Agaroz'dan çıkarın ve üreticinin protokolüne göre ticari bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın. Daha sonra, saflaştırılmış doğrusallaştırılmış vektör, PCR fragmanları ile karıştırılır ve bu DNA karışımı, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit kullanılarak yetkin maya hücrelerini dönüştürmek için kullanılır. Dönüştürülmüş hücreleri SC bırakma plakaları üzerine yerleştirin ve üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.
Bu teste hazırlanmak için, SC bırakma plakalarından tek tek koloniler seçin ve bunları kuyu başına 50 mikrolitre minimum ortam içeren 96 kuyu plakasına aktarın. Her plakada, altı numaralı sütunu dahili bir standart olarak ebeveyn tipi ile aşılayın. Negatif bir kontrol olarak, plazmid içermeyen URA3 negatif ESI viseral hücreleri ile urasil ile takviye edilmiş SC ortamları ile doldurulmuş iyi H-one'u aşılayın.
Plakaları kapaklarıyla kapatın, para filme sarın ve 30 santigrat derecede nemli bir çalkalayıcıda 48 saat inkübe edin. 48 saat sonra, her bir oyuğa 160 mikrolitre ekspresyon ortamı ekleyin ve plakaları tekrar kapatın. 24 saat daha kuluçkaya yatırın.
Plakaları santrifüjledikten sonra, her bir plakadaki kuyucuklardan 20 mikrolitre süpernatanı bir kopya plakaya aktarmak için sıvı işleme robotik çoklu istasyon kullanın. Her oyuğa 20 mikrolitre iki milimolar P-metoksibenzil alkol ve 100 milimolar sodyum fosfat tamponu ph 6.0 ekleyin. Plakaları 96 oyuklu bir plaka karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Ardından, her bir çoğaltma plakasına 160 mikrolitre FOX reagant ekleyin ve karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırın. Plakaları bir plaka okuyucuda 560 nanometrede okuyun. Renk gelişene kadar plakaları oda sıcaklığında inkübe edin.
Emilimi tekrar ölçün. Bağıl aktivite, inkübasyondan sonraki absorpsiyon değeri ile her bir plaka için ebeveyn tipine normalize edilen ilk ölçümün değeri arasındaki farktan hesaplanır. Bu temsili jel görüntüsü, ikinci şeritte doğrusallaştırılmış vektörü, üçüncü şeritte M1 PCR segmentini, dördüncü şeritte M2 PCR segmentini, beşinci şeritte HF PCR segmentini ve altıncı şeritte NHE bir ile doğrusallaştırılmış in vivo yeniden birleştirilmiş vektörü gösterir.
Bu sonraki jel, ikinci şeritte yeniden birleştirilen vektörün plazmid mini hazırlığını, üçüncü şeritte NHE ile doğrusallaştırılmış plazmiti, dördüncü şeritte BamH bir ve XHO ile doğrusallaştırılmış plazmidi ve beşinci şeritte jel ekstraksiyonu ve temizleme ile elde edilen doğrusallaştırılmış plazmiti gösterir. Mutasyon yükleri, farklı manzaralara sahip mutant kütüphaneler örneklenerek, ebeveyn enzim aktivitesinin %10'undan daha azına sahip klonların sayısı hesaplanarak ve aktif ve aktif olmayan varyantların rastgele bir örneğini dizileyerek daha fazla doğrulama yapılarak ayarlandı. Bu testin tespit sınırının bir değerlendirmesi, testin siyah dairelerle temsil edilen sorbitol varlığında doğrusal olduğunu gösterdi.
Beyaz karelerle temsil edilen sorbitolün yokluğunda, doğrusallık daha kalıcıydı, ancak yanıt daha zayıftı. AAO konsantrasyonu ile absorbans arasında doğrusal bir korelasyon gözlendi. Bu tahlil ile 2.000 klondan oluşan bir mutant kütüphane oluşturuldu ve tarandı.
Gölgeli kare, P-metoksibenzil alkole karşı önemli ölçüde geliştirilmiş salgı ve aktiviteye sahip AAO mutantlarını gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse mutant kütüphaneler yaklaşık dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tek bir dönüşümsel adımda in vivo birleştirme ve klonlama için her PCR ailesi ve doğrusallaştırılmış vektör için uygun örtüşen alanlar atamayı unutmamak önemlidir.
Benzer bir yaklaşımı izleyerek, mutant kütüphaneler ve/veya metabolik yollar oluşturmak için in vivo DNA örneklemesi, doygunluk mutajenez kütüphanesi veya DNA montajı gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, biyomühendislik alanındaki araştırmacıların faaliyetleri, istikrarları keşfetmeleri ve hatta sonsuz etkileşim türleri icat etmeleri için yol açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bu Saccharomyces Cerevisiae cihazını kütüphane yapımı ve taraması için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, yönlendirilmiş evrim deneyleri için Saccharomyces cerevisiae'de mutant kütüphanelerin yapımını ve taranmasını özetlemektedir. Etkili mutagenez ve rekombinasyonu sağlayan basit bir yaklaşımı vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Genetik Mühendisliği
- Mikrobiyoloji
Arka Plan
- Yönlendirilmiş evrim, arzu edilen özelliklere sahip proteinler geliştirmek için kullanılan bir yöntemdir.
- Saccharomyces cerevisiae, bu deneyler için bir model organizma olarak kullanılır.
- Rastgele mutagenez ve rekombinasyon bu süreçteki temel tekniklerdir.
- Hesaplamalı algoritmalar, mutagenez için hedef bölgelerin seçilmesine yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Mutant kütüphaneleri oluşturma ve tarama protokolünü göstermek.
- Yönlendirilmiş evrimde montaj ve klonlama için örtüşen alanları belirlemek.
- Mantar aril-alkol oksidazının (AAO) belirli bölgelerini iyileştirmek için hedeflemek.
Kullanılan Yöntemler
- Hesaplamalı algoritmalar kullanılarak hedef bölgelerin seçilmesi.
- AAO'nun M1 ve M2 bölgelerinin rastgele mutagenezi.
- Tek transformasyon adımı ile mutant kütüphanelerin taranması.
- Elde edilen mutantların kalitesi değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Saccharomyces cerevisiae'de mutant kütüphanelerin başarılı bir şekilde yapılandırılması.
- Arzu edilen özelliklere sahip etkili mutantların tanımlanması.
- Protokolün güvenilirliğinin gösterilmesi.
- AAO için yönlendirilmiş evrim sürecine ilişkin bilgiler.
Sonuçlar
- Protokol, yönlendirilmiş evrim çalışmaları için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Belirli bölgelere hedeflemek, mutagenezin verimliliğini artırır.
- Bu yaklaşım, AAO'nun ötesinde çeşitli proteinlere uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Directed evolution in yeast enables rapid generation of functional enzyme variants for biotechnological applications, reducing reliance on in vitro steps and accelerating protein engineering timelines. This approach supports target validation by linking genetic modifications to measurable activity improvements in a eukaryotic host. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, secretion-linked activity readouts relevant to industrial enzyme production.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-guided regions (M1, M2) to clarify functional contributions to enzyme activity.
- Operational Value: Uses overlapping ~50 bp homology arms for seamless in vivo reassembly, minimizing cloning steps and transformation burden.
- Scientific Value: Screens mutant libraries in yeast supernatants using a Fenton-based assay, directly correlating genotype with secreted enzyme function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Employs a high-throughput, sensitive assay based on P-methoxybenzyl alcohol oxidation to quantify aryl-alcohol oxidase activity in 96-well format.
- Operational Value: Normalizes activity to parental type and uses internal controls (parental strain, negative control) to ensure assay robustness across plates.
- Scientific Value: Detects improved secretion and activity, enabling identification of variants with enhanced performance under screening conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates linearity of assay response with enzyme concentration, supporting reliable quantification across mutant libraries.
- Operational Value: Confirms assay performance in presence/absence of sorbitol, defining working range for accurate hit selection.
- Scientific Value: Validates hits through sequencing of active and non-active clones, linking phenotype to genotype for downstream characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates library construction and functional screening into a discovery workflow from target region selection to hit identification, enabling iterative enzyme optimization campaigns.
- Discovery Biology: Uses computational algorithms to select mutagenesis sites based on AAO structure, focusing evolution on functionally relevant regions.
- Screening: Delivers quantitative, supernatant-based activity readouts that support reproducible, plate-to-plate comparison of mutant function.
- Analytics: Measures relative activity via absorbance shift at 560 nm, normalized to parental strain, enabling objective variant ranking.
- Translational Research: Secretion-linked screening in yeast provides early insight into expressibility and function, relevant for biologics and industrial enzyme development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other eukaryotic genes, avoiding repeated optimization of PCR, recombination, and screening steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking targeted mutagenesis to measurable changes in enzyme activity and secretion.
- Operational Value: Achieves library construction and screening in ~4 hours post-transformation, enabling rapid design-build-test cycles.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enriching libraries with functional variants and minimizing false negatives through sensitive detection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying mutants with improved activity, guiding investment toward promising enzyme candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular biology, PCR optimization, and agarose gel purification for linearized vector preparation.
- Dependent on thermocyclers, gel electrophoresis systems, plate readers, and liquid-handling robots for supernatant transfer and reagent addition.
- Necessitates standardization of overlapping regions (~50 bp) and transformation efficiency to ensure consistent in vivo reassembly across projects.
- Adaptation to other genes may require re-evaluation of homology arm length, mutagenic conditions, and assay compatibility with target enzyme activity.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on substrate choice and buffer conditions; optimization may be needed for enzymes with low activity or alternative reaction mechanisms.
