Name: Evrim Yöntemi yönettiği Saccharomyces cerevisiae: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Keşfedin Saccharomyces cerevisiae'de mutant kütüphane oluşturma ve tarama yöntemini. Hesaplamalı algoritmalarla hedef bölgeler seçilerek tek dönüşüm adımında etkili evrim yönlendirme deneyleri yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu projesi Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; Maliyet-Eylem CM1303-Sistem Biyokatalizi; ve Ulusal Projeler Dewry [BIO201343407-R] ve Cambios [RTC-2014-1777-3] tarafından desteklenmiştir.

1. Mutant Kütüphanesi İnşaatı <ol><li> Seçim bölgeler, mevcut kristal yapı ya da homoloji model 18 göre bilgisayar algoritmaları yardımıyla geçişin maruz bırakılması. <ol><li> Burada, rastgele mutagenez ve rekombinasyon (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), yüksek sadakat PCR ile gen (844 bp) geri kalan yükseltme sırasında (Şekil 1) için Pleurotus eryngii gelen AAO iki bölgesini hedef. Not: Birkaç segmentler bağımsız veya kombine şekilde 16 geçişin ele alınabilir. </li></ol></li><li> mutajenik PCR ile hedeflenen bölgelere yükseltin. tanımlı bölgelerin PCR reaksiyonları atma kesimleri arasında alanları (~ 50 bp her) üst üste oluşturun. <ol><li> DNA şablonu ihtiva eden 50 ul (0.92 ng / | il), 90 nM oligo sens (kademeli bir MI ve kademeli bir M-II AAO-BP RMLN) içindeki bir nihai hacimde segmentler mutajenik PCR Hazırlama 90 nmntisense primeri (kademeli bir M-II için kademeli bir MI ve RMLC için AAO-92C), 0.3 mM dNTP (0.075 mM),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO), 1.5 mM MgCl2, 0.05 mM MnCl2 ve 0.05 U / ul Taq DNA polimerazı. Primerler dizileri Şekil 1&#39;de ayrıntılı olarak verilmiştir. </li><li> Aşağıdaki PCR programı kullanarak: 2 dakika boyunca (1 döngü) 95 ° C; 45 saniye, 45 saniye, 50 ° C, 45 sn için 74 ° C (28 döngü) 95 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 74 ° C. </li></ol></li><li> ultra-yüksek sadakat polimeraz olmayan mutajenik bölgeleri yükseltmek ve mutajenik segmentleri ve / veya doğrusallaştırılmış vektör çıkıntılar üst üste gelen alanları bulunmaktadır. <ol><li> ihtiva eden 50 ul&#39;lik bir son hacim içinde, reaksiyon karışımları hazırlayın: DNA numunesi (0.2 ng / | il), 250 nM oligo sens HFF, 250 nM oligo antisens HFR, 0.8 mM dNTP (0.2 mM her biri),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO) ve DNA polimerazı iproof 0.02 U / ul. Astarlar dizileri ayrıntılı olarak &lt;strong&gt; Şekil 1. </li><li> Aşağıdaki PCR programı kullanın: 30 sn (1 döngü) için 98 ° C; 10 saniye, 25 saniye boyunca 55 ° C, 45 saniye için 72 ° C (28 döngü) 98 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 72 ° C. Not: 1.2 açıklanan koşullara ve 43 bp (plazmid-M1 bölge) 1.3 örtüştüğü ile; 46 bp (M1 bölge HF bölge); 47 bp (HF bölge M2 bölge) ve 61 bp (M2 Bölge- plazmid) maya in vivo ekleme de lehine (Şekil 1) tasarlanmıştır. </li><li> imalatçının protokolüne göre, ticari bir jel özütleme kiti (mutajenik ve mutajenik) bütün PCR fragmanları arındırın. </li></ol></li><li> Yaklaşık 50 bp&#39;lik komşu bölgeleri hedef genin 5&#39;- ve 3&#39;-ucuna homolog olan oluşturulur, öyle ki vektör linearize. <ol><li> 2 ug DNA, 7.5 U Bam HI, 7.5 U Xho I, Tampon Ba 20 ug BSA ve 2 ul içeren bir doğrusallaştırma reaksiyon karışımı hazırlayın20 ul nihai hacim içinde m HI 10x. </li><li> 2 saat ve 40 dakika boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyon karışımı inkübe edin. Daha sonra, 20 dakika boyunca 80 ° C &#39;de inaktivasyonu devam edin. </li></ol></li><li> Kalan dairesel plazmid (Şekil 2) ile kirlenmesini önlemek için agaroz jel ekstraksiyon tarafından lineerleştirilebilir vektörü arındırın. <ol><li> de bir muhabir bitişik reaksiyon karışımı ayrıca bir alikosu (5 ul) (v, w% 0.75), bir yarı-preparatif düşük erime noktalı agaroz jel mega kuyuya sindirim Reaksiyon karışımı yükleyin. </li><li> Run DNA elektroforezi (elektrotlar arasında 5 V / cm, 4 ᵒC) ve mega-kuyuya gelen agaroz jel ayırmak ve 1x TAE 4 ᵒC sıcaklıkta saklayın. </li><li> molekül ağırlığı merdiven ve raportör ile sokağın Leke. UV ışık altında bantları gözünüzde canlandırın. Nick pozisyon Lineerleştirilmiş vektör yerleştirir. Not: saflaştırılmıştır lineer vektör kalitesi great.Thanks olduğucal faktör maya başarılı rekombinasyon ve montaj, yarı hazırlayıcı DNA elektroforezi için jel boyama kaçının. Boyalar ve jel ekstraksiyonu için, UV&#39;ye maruz kalmadan kullanılması, in vivo rekombinasyon verimliliği ödün, DNA vektörünün stabilitesini etkileyebilir. Toksik EtBr boyalar alternatif olarak, jel Kırmızı ve SYBR boyalar genel olarak jel boyama için kullanılır. </li><li> UV ışık yokluğunda, bu izole edilebilir ve böylece lekeli raportör şeritte sıyrık yol göstericiliği kullanılarak Mega oyuklu fragmanında lineer vektör tanımlar. </li><li> agarozdan lineer vektör çıkarın ve üreticinin protokolüne uygun olarak, ticari bir jel özütleme kiti ile saflaştırılması. Not: antibiyotik ve oksotrofi işaretleri kullanan yüksek kopya epizomal mekik vektörleri: Bu maya GAL1 promoterinin kontrolü altında, urasil bağımsız ve ampisilin dirençli pJRoC30 vektör kullanılabilir Bu örnekte. </li></ol></li><li> eşmolar MI hazırlanmasıPCR parçalarının soğutun ve 2 de lineer vektör ile karıştırarak: doğrusallaştırılmış plazmidin en az 100 ng, 1 oranında (eşmolar kütüphanesi açık / vektör test farklı oranlarda iyi bir dönüşüm verimi elde etmek için). <ol><li> konsantrasyon ve saflığı belirlemek için PCR parçaları ve 260 nm ve 280 nm &#39;de lineer vektör absorbansı ölçülür. </li></ol></li><li> Bir ticari maya dönüştürme kiti kullanılarak DNA karışımı maya yetkin hücrelerini dönüştürmek, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzeme Tablo). <ol><li> Bağımlı S. - Burada bir yoksun proteaz ve URA3 kullanın cerevisiae suşu, BJ5465. (Aşağıya bakınız), tarama sırasında bir iç standart olarak ebeveyn daireselleşmiş vektörle hücrelerini dönüştürmek. Buna ek olarak, PCR parçalarının yokluğunda lineer vektör dönüştürerek arka plan kontrol edin. Not: ilk düşük salgılanmasını tespit durumunda, faydalanmaBJ5465 gibi cerevisiae proteaz eksikliği olan suşlarıdır kültür yüzey aktif protein birikimi geliştirmek için. Hedef enzimin hiperglikosilasyon glikosilasyon eksikliği cinslerinin kullanımını maruz (örneğin, sadece daha küçük manoz oligomerleri bağlama kapasitesine sahip Δ kre2), uygun bir seçenek olabilir. </li></ol></li><li> Plaka dönüştürdü SC bırakma plakalar üzerinde hücre ve üç gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe. Plakası (urasil ile desteklenmiş SC bırakma tabakalarına) URA3 - S. taranması için bir negatif kontrol olarak plazmid eksik S. cerevisiae hücreleri (aşağıya bakınız). </li></ol> Testi Tarama 2. Yüksek Verimli (Şekil 3) <ol><li> bir pipetleme robotu yardımıyla göz başına 50 | il minimum ortam maddesi ile (2.000 klon kütüphanesinin analiz 23 levha) steril 96 oyuklu plakalar bir uygun sayıda doldurun. </li><li> plakalar dışında SC-açılan bireysel koloniler seçin ve 96-kuyucuğu aktarabilirsiniz. <ol><li> Her plaka olarak, ebeveyn bir iç standart olarak tip ve iyi URA3 ile H1 ile sütun numarasını 6 aşılamak - S. Bir negatif kontrol olarak hiçbir plasmid ile (urasil ile takviye SC ortamı içinde) cerevisiae hücreleri. Not: Kuyu H1 urasil ile desteklenmiş bırakma medya ile özel olarak doldurulur. hücre içermeyen boş bir de ihtiva eden ortam ayrıca bir sterilite kontrolü olarak hazırlanabilir. </li></ol></li><li> onların kapaklı tabak kapatın ve Parafilm onları sarın. Nemli bir çalkalayıcıda, 30 ° C&#39;de 48 saat, 225 rpm ve 80% bağıl nem için inkübe edin. </li><li> Parafilm kaldır pipetleme robotu yardımıyla her bir oyuğa sentezleme ortamı 160 ul, plakalar yeniden kapatın ve 24 saat daha inkübe. Not: Başka bir yerde 19 bildirildiği gibi Minimal orta ve ifade ortamı hazırlanır. Salgılama seviyeleri t, ve buna bağlı olarak çalışma altında genin bağlı olarak değişebilirO zaman tüm oyuklara hücre büyümesini senkronize etmek için her bir durumda, optimize edilmelidir kuluçkalama. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 2,800 x g plakaları (ana plakalar). </li><li> Aktarım robot çok istasyonlu işleme bir sıvı kullanarak çoğaltma plakasına ana plakadaki kuyulardan süpernatan 20 ul. Not: enzim salgılanmasını desteklemek amacıyla yaygın maya heterolog ekspresyonu (kullanılan sinyal peptidleri hedef proteinin doğal sinyal peptidi yerine tavsiye edilir, örneğin, α faktörü prepro-lideri, S. K 1. Öldürücü toksini lideri cerevisiae veya her iki peptit 13) daha uyumlu versiyonlarıdır. Seçenek olarak ise, doğal sinyal peptid sadece maya içinde salgılanması için açığa çıkabilir. </li><li> Pipetleme robot yardımı ile 100 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 6.0 içinde 2 mM p -methoxybenzylalcohol 20 ul ekle. 96-biz kısaca plakaları karıştırınve kap mikseri ll, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe. </li><li> Pipetleme robot ile, her çoğaltma plakasına FOX reaktifi 160 ul ve de FOX karışımının karıştırıcı (nihai konsantrasyon kısaca karıştırılmıştır: 100 uM ksilenol turuncu, 250 uM Fe (NH4) 2 (SO4) 2 ve 25 mM H 2 SO 4). <ol><li> Bu tür organik yardımcı solventlerin (DMSO, etanol, metanol) veya sorbitol 17 olarak duyarlılığını artırmak için bir reaktif için çeşitli katkı maddeleri ekleyin. Burada, 100 mm (Şekil 4) bir son konsantrasyona kadar sorbitol eklenerek cevap yükseltmek. </li></ol></li><li> Bir plaka okuyucusu üzerinde 560 nm&#39;de plakaları (uç noktası modu, t = 0) okuyun. </li><li> Renk gelişene kadar oda sıcaklığında inkübe ve tekrar (t 1) emilimini ölçmek. <ol><li> kuluçkadan sonra Abs değeri arasındaki farktan göreceli aktivitesini hesaplamak ve ilk ölçüm o pare normalizeHer bir plaka için ntal tipi (¨t 1 - t = 0). </li></ol></li><li> yanlış pozitif ekarte etmek iki ardışık yeniden gösterimleri için en iyi mutant hit Konu. Not: Genellikle, yeniden gösterimleri plazmid 19 yaş maya hücrelerinin dönüşümü, ardından, Escherichia coli içinde maya, amplifikasyon ve arıtma için plazmid izolasyon bulunmaktadır. Seçilen her bir klon pentaplicate yeniden elenir. </li></ol>

<ol><li>Jäckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts+by+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li>
<li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li>
<li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+enzyme+universe%3A+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li>
<li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+selection+of+the+host+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).</li>
<li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering%3A+lessons+from+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution%3A+an+efficient+tool+to+improve+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li>
<li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li>
<li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li>
<li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+assembler%2C+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).</li>
<li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li>
<li>Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Ruiz%2C+E+%22Cascade+Biocatalysis%3A+integrating+stereoselective+and+environmentally+friendly+reactions%22">Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions</a>. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).</li>
<li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+aryl-alcohol+oxidase%3A+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+%28MORPHING%29+for+directed+enzyme+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919(2014).</li>
<li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li>
<li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+for+designing+smart+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li>
<li>Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li>
<li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li>
<li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li>
<li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pocket+manual+of+directed+evolution%3A+Tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+of+Microbial+Enzymes%3A+Production%2C+Biocatalysis+and+Industrial+Applications%22%5BJournal%5D)">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, ipuçlarını çoğu S. yönlendirilmiş evrim tarafından enzimleri mühendisi laboratuarımızda istihdam özetledik cerevisiae (örnek olarak AAO kullanarak) onlar sadece burada açıklanan ortak bir yaklaşım izlenerek diğer ökaryotik enzim sistemleri ile kullanım için adapte edilebilir, böylece. Kütüphane oluşturulması açısından, biçim vermek ve 16 değiştirilmemiş proteinin geri kalan bölgeleri, bırakarak küçük protein uzanır rasgele mutasyonlar rekombine hızlı t...

Yönetmen moleküler evrim enzimleri 1, 2 tasarlamak için bir, sağlam, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Doğal olmayan olarak, yeni reaksiyonlarda, yeni yüzeylerde hareket rastgele mutasyon, rekombinasyon ve tarama, enzimlerin geliştirilmiş versiyonları oluşturulabilir yinelenen mermi ile ortamlarda, hatta yeni metabolik hedeflere 3-5 ulaşmak için hücreyi yardımcı olmak. Yönlendirilmiş evrim kullanılan bilgisayarlar arasında, bira mayası Saccharomyces cerevisiae prokaryotik meslektaşları 6,7 aksi bulunmayan karmaşık ökaryotik proteinlerin fonksiyonel ifade çözümler bir repertuar sunuyor. Hücre biyolojisi çalışmalarında etraflıca kullanılan bu küçük ökaryot modeli yönlendirilmiş evrim 8 tarafından enzimleri mühendisi önemli özellikleri bütün bunlar post-translasyonel modifikasyonlar, manipülasyon ve dönüşüm verimliliği kolaylığı açısından birçok avantajı vardır. Ayrıca, yüksek frekanslıS. homolog DNA rekombinasyon onun etkin proof-okuma aygıtı bağlanmış cerevisiae karmaşık yapay yolların 9-12 tek enzimlerin farklı sistemlerin evrimi teşvik, in vivo kütüphane oluşturma ve gen montaj olanakları geniş bir yelpazeye açar. Laboratuvarımız maya farklı linyinaz moleküler evrim (doğal ahşap çürüme sırasında lignin parçalanması ile ilgili oksiredüktazlan) 13-14 için araçlar ve stratejiler tasarlanması son on harcadı. Bu iletişimde, biz hazırlamak ve S. ekran mutant kütüphaneleri için ayrıntılı bir protokol mevcut Model flavooxidase, -aril alkol oksidazı cerevisiae (AAO 15) -, kolayca diğer enzimlere tercüme edilebilir. Maya hücre aparatı 16, bir yardım: (Homolog in vivo Gruplama tarafından mutajenik Organize Rekombinasyon Süreci Morphing) protokolü odaklanmış yönlendirilmiş evrim yöntemini içerirKültür suyu 17 salgılanan AAO aktivitesi tespit etmek için Fenton tepkimesi göre da çok hassas bir tarama deneyi.

<table><tbody><tr><td><Güçlü>1. Kültür ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galaktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Rafinoz pentahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Urasil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Amino Asitsiz Maya Azot Bazı</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Urasil içermeyen Maya Sentetik Bırakma Ortamı Takviyeleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</ güçlü><</td><td>güçlü>Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td>güçlü<güçlü>2. PCR Reaksiyonları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Karışımı</td><td>Agilent genomik</td><td>200415-51</td><td>her biri 25</td></tr><tr><td>mM iProof Yüksek Kaliteli DNA polimeraz</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Manganez (II) klorür tetrahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N & ordm; 13446-34-9 MW 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>Hata için eğilimli PCR</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>3. Plazmid doğrusallaştırma</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI kısıtlama enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI kısıtlama enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>I değil kısıtlama enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Jel Kırmızı</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA boyama için</td></tr> <<tr><td>güçlü > İsim <</td><td>strong > Company <</td> <td>strong > Katalog Numarası</td> <td> Yorumlar< / strong</td></tr> <tr><td>> 4. FOX tahlilleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum demir (II) sülfat hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N & ordm; 7783-85-9 MW 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alkol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N & ordm; 105-13-5 MW 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N & ordm; 50-70-4 MW 182.17</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit% 30</td> <td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standart eğrisi</td></tr><tr><td>Ksilenol Turuncu disodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N & ordm; 1611-35-4 MW 716.62</td></tr> <tr><td>< güçlü > Ad< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr><tr><td>< güçlü>5. Agaroz jel maddeleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N & ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Jel Kırmızı</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA analiz boyası</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Merdiven</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA MW standart</td></tr><tr><td>Yükleme Boyası 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime sıcaklığı agaroz</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N & ordm; 39346-81-1</td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr><tr><td>< güçlü >6. Kitler ve hücreler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae suşu BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Genotip ile proteaz eksikliği olan suşu: MAT & alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Mavi yetkin hücreler</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>Plazmid saflaştırma ve amplifikasyon için</td></tr><tr><td>NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme Kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA jel ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plazmid Kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Sütun miniprep Kiti</td></tr><tr><td>Maya Dönüşüm Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Dahil DNA taşıyıcı (Somon testisleri)</td></tr><tr><td>Zymoprep maya plazmid miniprep I</td><td>Zymo araştırması</td><td>D2001</td><td>Mayadan plazmid ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Ad</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>7. Plakalar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Berrak, steril olmayan, polistiren (aktivite ölçümleri için)</td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Berrak, steril, polistiren (mikrofermantasyonlar için)</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka kapağı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Berrak, steril, polistiren (mikrofermantasyonlar için)</td></tr></tbody></table>

evrim yöntemi yönettiği<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt;: mutant kütüphane oluşturma ve tarama

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

In vivo yüksek frekans homolog DNA rekombinasyon bağlanmış inşaat, klonlama ve mutant kütüphanelerin ifadesini içeren bir süreç biyoteknolojik uygulamalar için enzimler tasarlarken Saccharomyces cerevisiae yönlendirilmiş evrim çok çekici avantajlar sunuyor. Burada, toplam etkinliğini arttırmak için bir mantar aril-alkol oksidaz (AAO) örneğine dayalı olarak maya ve ekran mutant kütüphaneleri oluşturmak için bir protokol mevcut. İki protein kesimleri rastgele mutagenezi ile ve in vivo DNA yeniden birleştirmesinden odaklı yönelik evrim tabi tutuldu. Her bir segment kuşatan 50 bp çıkıntıları tam kendiliğinden kopyalanan plazmidin sebebiyet veren bir doğrusallaştırılmış vektörde AAO-füzyon geninin, doğru yeniden birleştirme sağladı. Fonksiyonel AAO türevleri ile zenginleştirilmiş mutant kütüphaneler S. tarandı Fenton tepkimesi göre hassas bir yüksek verimli bir deney ile cerevisiae süpernatanlar. genel prosesS. kütüphane inşaat cerevisiae ilave PCR reaksiyonları, in vitro DNA rekombinasyon ve ligasyon adımlarından kaçınmak, burada açıklanan kolaylıkla diğer ökaryotik genlerin gelişmeye uygulanabilir.

P. AAO eryngii lignin saldıran başlamak için H 2 O 2 ile mantar peroksidazlar sağlayan bir hücre dışı flavooxidase olduğunu. AAO iki segment etkinliğini ve S ifadesini arttırmak için geçişin tarafından odaklanmakta-yönlendirilmiş evrim tabi tutuldu cerevisiae 19. S. tarafından barındırdığı yabancı enzimlerin bağımsız olarak cerevisiae, maya mutant kütüphaneler inşa fragmanları ve doğrusallaştırılmış ve...

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Bu protokolün genel amacı, yönlendirilmiş evrim deneyleri için Saccharomyces Cerevisiae'de mutant kütüphanelerinin nasıl oluşturulacağını ve taranacağını göstermektir. Bu yöntem, montaj ve klonlamada örtüşen alanların nasıl atanacağı gibi, odaklanmış yönlendirilmiş evrim deneyleri için laboratuvar oluşturulmasında kullanılan temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir transformasyon adımında yüksek kalitede düzeylerin atanabilmesi nedeniyle basit ve sağlam olmasıdır.Mutant kütüphanelerinin oluşturulması ve taranmasına yönelik bu protokol, fungal bir aril-alkol oksidaz veya AAO üzerinde gösterilecektir. Odaklanmış yönlendirilmiş evrim için bölgeler, öncelikle enzimin mevcut kristal yapısı veya homoloji modellerine dayalı hesaplama algoritmaları yardımıyla seçilir. AAO'nun iki bölgesi rastgele mutajenez ve rekombinasyon için hedeflenecektir: M1 bölgesi ve M2 bölgesi.Hedef bölgeleri amplifiye etmek için mutajenik PCR uygulanacaktır. Mayada in vivo eklemlemeyi (splicing) teşvik etmek için, tanımlanan bölgelerin PCR reaksiyonları üst üste getirilerek, her biri yaklaşık 50 baz çifti olan segmentler arasında örtüşen bölgeler oluşturulacaktır. Her

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, belirli bir hedef dizisi için, rastgele bir mutant kütüphane oluşturmak için basit bir protokol göstermektedir. Escherichia coli, in vivo olarak yapılan bu yöntem, yeni enzimatik faaliyetleri gelişmeye fonksiyonel seçimleri ile birleştiğinde nasıl kullanılabileceğini göstermek.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Termostabilite mühendisliği alanında belirli bir yeni yönlendirilmiş evrim yöntem bacteriolytic enzimler için geliştirilen ve sonuç olarak doğrulanmıştır. Yükseltilmiş sıcaklıkta inkübasyon sonrasında yabani-tip protein ile karşılaştırıldığında rasgele mutagenez sadece bir yuvarlak, gelişmiş bir bacteriolytic enzim, PlyC 29C3, iki kez etkinlik kalıntı daha fazla görüntülenen sonra.

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Biz Maya fizyon basit bastırıcı ekran protokolünde mevcut. Bu yöntem etkili, alkil-Alerjik ve kez tek bir genomik locus meydana gelen mutasyonlar için seçici değildir.  Protokol bir mutasyon veya bir uyuşturucu nedeniyle büyüme kusurları sıvı kültüründe hafifletmek bastırıcılarının yalıtmak için uygundur.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Protein-protein etkileşimleri gibi biyomoleküllerin etkileşimleri, biyolojik fonksiyonların moleküler temelidir. Özellikle ilgili etkileşimden yoksun olan etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar izole edilebilirse, bu etkileşimin işlev(ler)ini anlamaya büyük ölçüde yardımcı olacaklardır. Bu makale, etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmenin etkili bir yolunu sunmaktadır.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Keşfedin Saccharomyces cerevisiae'de mutant kütüphane oluşturma ve tarama yöntemini. Hesaplamalı algoritmalarla hedef bölgeler seçilerek tek dönüşüm adımında etkili evrim yönlendirme deneyleri yapılır.

Evrim Yöntemi yönettiği

Daha fazla video keşfet