Name: Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin hareket sırasında memeli nöronlarının fizyolojik yanıtlarını in vivo kaydetme ve bunları morfoloji ile nörokimya açısından karakterize etme yöntemini. Bu teknik sinaptik bağlantıları koruyarak geleneksel hücre kültürüne göre avantaj sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Anthony Taş, in vivo hücre içi kayıt ve hücre içi boyama tekniği ilk geliştirme ile ilgili yardım için Brown ve David Maxwell yılında ilk eğitim için teşekkür ederim . M. Gümüş Ben collocalization makro yardım için teşekkür ederim. Birçok bilim adamı kiminle, R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar dahil olmak üzere, bu tekniğin gelişimi sağlanan anlayış işbirliği var. Bu teknik, NIH hibe DE10132 DE15386 ve RR017971 önemli desteği ile geliştirildi.

1. Hayvan Hazırlık <ol><li> Pentobarbital sodyum (50mg/kg 'dan IP) ve bir ısıtma yastığı yer sıçan anestezisi. Hayvan kesme makineleri ile arka kafatası örten deri Tıraş. Hayvan ayak parmakları palpebral refleks yokluğu gibi sıkışmak yanı sıra zaman, bir geri çekilme refleksi ve seslendirme olmaması için cerrahi anestezi düzeyi seviyesi testi ile elde edilmiş olduğunu sağlamak için kontrol edin. Anestezi düzeyi her 15 dakikada bir kontrol edin ve sodyum pentobarbital 15mg/kg her 45 dakikada bir enjeksiyonu tarafından anesthetisa cerrahi bir düzeyde tutmak. </li><li> Aseptik teknik kullanın ve inguinal bölge, karın ve uyluk oluşan kırışık bir kesi hemen distalinde ve femoral vene kanül (1 mm çapında, Clay Adams) ve femoral arterden eklemek. Submandibular bölgede orta hat kesi yapmak, infrahyoid kasları yansıtmaktadır. Trakea küçük bir kesi yapın ve havalandırma sağlamak için bir kanül (2 mm çap) yerleştirin. Place.Monitor sistemik arteryel kanül ile diyastolik ve sistolik kan basıncı sabitlemek için cannual trachael etrafında bir sütür Tye. Şimdi geri çekilme ve palpebral refleks izlemeye ek olarak anestezi düzeyini ölçmek için kan basıncı monitör. Venöz kanül ile gerektiğinde ek anesteziklere. </li><li> Sıçan stereotaksik bir çerçevenin içine yerleştirin ve beyincik maruz kraniotomi gerçekleştirmek. Kemirgen ventilatör trakeal kanül takın. Nemlendirilmiş hava ile 100/min hızında 2 cm 3 hacmi ile hayvan havalandırınız. Akciğer çökmesini engellemek için 1 cm H 2 O bir pozitif ekspirasyon sonu basınç sağlanmalıdır. Her 15 dakikada atelektazi önlemek için akciğerlere hyperinflate. Sonra ısıtılmış mineral yağ (30 ° C) ile beynin yüzeyini kaplayan. Doğrudan parietal ve interparietal kemikler arasındaki birleşme altında bulunan büyük venöz sinüs önlemek için dikkatli olun. </li><li> Elektromanyetik bir vibratör ile birleştiğinde bir çubuk siyanoakrilat tutkal sürün ve çene diastema çubuk eklemek. Vibratör ya da A / D ve bilgisayar çıktılarını ya da sinyal üreteci Mandibula kullanarak komut sinyalleri taşıyın. </li><li> Kraniotomi bitişik cilt altında bir siliver-gümüş klorür topraklama elektrot yerleştirin. </li></ol> 2. Elektrot hazırlama <ol><li> Yatay bir mikroelektrot çektirmenin veya kuvars Alüminosilikattan cam kullanarak Mikroelektronlar Üretiyor. </li><li> 0.25m KCl ile 0,5 M Tris HCl tamponu (pH 7.6) veya serum fizyolojik içinde% 2 tetramethlyrhodamine (pH 6) çözünmüş% 5-10 biotinamide mikroelektrot doldurun. Elektrot empedansı bir elektrot test cihazı ile kontrol edin. 60-80M Ω empedans ile geniş çaplı aksonlar kaydetmek için elektrotlar yapmak, küçük akson ve internöronlar 80-150MΩ empedansı ile elektrotlar. </li><li> Elektrometre başkanı aşamaya mikroelektrot yerleştirin. , Hayvanın başının arkasında pozisyonda sabit küçük bir teleskop (20X kapalı bir dürbün ağı ile) ile elektrot gözünüzde canlandırın. Elektrotlar stereotaxically büyük bir hassasiyetle yerleştirilmiş sağlar çünkü teleskop kullanarak önemlidir. </li></ol> 3. Elektrofizyolojik kayıt ve hücre içi boyama <ol><li> Pia mater küçük bir açılış yapmak ve elektrot beyin dokunduğunda bir geri besleme sinyali üretilir, böylece kapasitans geribildirim telâfi. Bu beynin yüzeyine doğru konum sağlar. </li><li> Tekrarlanan mandibular deplasman üretmek ve bir step motor ile beyin içine elektrod ilerlemek. </li><li> DC potansiyel ani damla nöronal impalements tanır ve devam eden sinaptik aktivite intrasomatic nöronal impalements belirlemek. Kapasitans karşılama elektrot vızıltı ya da nadiren başarılı bir hücreye nüfuz dokunarak. Çünkü elektrotlar yüksek empedans, nöronal yanıtları nadiren penetrasyon için önce gözlenir. </li><li> Nöronal yanıt rampa basılı tutun ve sinüzoidal çene hareketi ile karakterize bir nöron Impale ve penetrasyon stabil sayılır sonra, 5 Harita nöronun alıcı alanında iletken olmayan bir prob ile başının etrafında deri ve intra oral kavite problama tahta bir sopa gibi. Çalışma ile ilgili ise, nöron, kas kasılması ve zararlı uyaranlara gibi diğer işlevsel ilgili uyaranlara yanıt incelemek 6. Primer afferent nosiseptif nöronal reseptörler nosiseptif uyaranlara cevap. Genel anesthesetics pentobarbital sodyum gibi primer afferent nöronların aksonal iletim engellemek değil, sinaptik iletim deprese yok. Böylece birincil afferent nöron akson aksonal iletim korunur. </li><li> 15 70nA dakika olmak üzere toplam enjeksiyon süre akımı (DC, 1-4NA) enjekte edilir. Mevcut enjeksiyon sırasında elektrot penetrasyon Monitör ve membran potansiyeli-30mV daha olumlu hale gelirse durdurma.</li></ol> 4. Doku işleme <ol><li> (% 0.9 NaCl 38 durulama vasküler pentobarbital doz aşımı (140mg/kg IV) ve serpmek hayvan Euthanize ° C heparin 500 adet ve 1 ml% 2% 4 0.1M fosfat tamponu (pH 7.4) paraformaldehid takip xylocaine . </li><li> Ya da frontal, sagittal veya yatay düzlemde bir vibratome kullanarak 50-100μm beyin ve o bölümü çıkarın. Secions 25 ° C PBS içinde serbest dalgalı toplanır. </li><li> % 1-2 normal keçi serumu kuluçka ve% 1 Triton X 0.01m PBS-100 avidin biotin kompleksi inkübasyon (1:50 Elite Vectastain) tarafından takip DAB için beyin işleyin. H 2 O 2 ile nikel-DAB kullanarak bölümleri tepki. Texas Kırmızı, 4 geceleme PBS içinde avidin-biotin kompleksi (1:50) inkübe bölümleri ° C ve 4 ° C gecede PBST% 4 Texas Red avidin DCS kuluçkaya yatmaktadır. Işlemek için 23 ° C'de bir floresan Nissl leke (NeuroTrace) 20min bölümler Counterstain </li><li> Nöron rodamin enjekte edildi, bir floresan mikroskobu (Ex-545nm) ile doğrudan enjekte nöron görselleştirmek. </li></ol> 5. Retrograd etiketleme, immünhistokimya, konfokal görüntüleme, kantitatif ko analiz yöntemi birleştiren Bu tekniğin diğer yöntemler ile birleştirerek başarı iyi bir hücre içi etiketleme üzerine büyük ölçüde bağımlı. <ol><li> Bu yöntem kolaylıkla retrograd nöronal etiketleme ile kombine edilebilir görüntülendi. 7-10 Bunu yapmak için, hayvan anestezi ve aseptik teknik kullanılarak, horseradish peroksidaz (% 20 horseradish peroksidaz Sigma VI, Sigma) gibi nöronal tracer enjekte ve% 1 buğday mikrop gibi masseter kası gibi periferik hedef bölgeye horseradish peroksidaz (Sigma) aggultinated. Bu nöronal tracer periferik aksonları içine alınır ve motonöron somata aksonal taşıma araçları ile taşınan olacaktır. Masseter kası için, izleyicinin 15μl steril 10 mikrolitrelik mikroenjektör kullanarak kas içine enjekte edilir. Hayvanlar daha sonra anestezi kurtarıldı ve daha sonra kurtarma için kafesler yerleştirilir kadar bir ısıtma yastığı yerleştirilir ve takip edilmektedir. 24 saat sonra, hayvanları uyutmak ve nöronlar karakterize fizyolojik ve hücre onlara leke. Sonra HRP olarak tetramethylbenzidine (TMB), kobalt sabitleyici ve yoğun olarak ve tungstat Sodyum siyanür kullanarak varlığı için yukarıda ve süreç doku kesitlerinde anlatıldığı gibi hayvan serpmek. % 1 sodyum Yeri bölümleri 0.1M PBS (pH 6.5) ve 0.0007% 15 mutlak etanol ve aseton içinde çözünmüş TMB çözünmüş tungstat ° C, 20 dk. Ardından 1.0 ml% 0.3, 60 dakika süreyle inkübasyon çözüm 100 ml H 2 O 2 ekleyerek doku bölümleri tepki . % 0.05 diaminobenzidin (pH 7.4),% 0.02 kobalt, ve% 0.01 0.1M 10 dakika süreyle PBS (pH 7.4) H 2 O 2 0.1M PBS (pH 6.5) yer doku ve durulayın. 37 ° C Açıklandığı gibi biotinamide enjekte nöron görünüm için doku Süreci ve etiketli duyusal nöron ve çeşitli motor nöronlar arasındaki ilişkilerin görselleştirmek. </li><li> Burada gösterilen tekniği de kolayca immnocytochemistry ile kombine edilebilir. 6. Bir örnek olarak, immunocytochemically sinaptofizin için doğru etiketli nöronların içinde sinaps (Şekil 3) bulmak için beyin süreci. Bunu yapmak için, 2 gün, 4 ° C ve daha sonra 23 1s için anti-fare FITC (1:400) inkübe ° C için fare anti-sinaptofizin antikor (1:10,000) beyin bölümleri inkübe </li><li> Floresan işaretleri ile etiketlenmiş veya floresan görüntüleme için işlenmiş Nöronlar konfokal görüntüleme için idealdir. Şekil 3, bir akson bouton aracılığıyla konfokal mikroskobu ile elde edilen optik bölümünde bir örnektir. (Şekil 3). Etiketli nöron (Şekil 4) ile birden fazla optik bölümleri satın alarak etiketli nöronların animasyonlar oluşturun . </li><li> Bu yöntem ile etiketlenmiş Nöronlar, kantitatif ko analiz için kullanılabilir. Bunu yapmak için, NIH Image ile birlikte kamuya açık bir yazılım makro (http://phy.ucsf.edu/ ° idl / colocalization.htm bulundu) kullanın. Sinaptofizin immünhistokimya ile hücre içi etiketleme birleştirerek tek bir akson terminalleri içinde sinaptofizin Localize 6 </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Bu yöntemi kullanarak elde edilebilir temsilcisi sonuçları genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu tek beyin sapı nöron elektrofizyolojik açıkça görülebileceği gibi, alt çenenin hareketi sırasında kaydedilen ve hareketi sırasında, bu nöronun yanıt (Şekil 1 sola, açık mavi alt) modüle oldu. Bu nöron elektrofizyolojik karakterizasyonu sonra biotinamide ile enjekte edilir ve daha sonra görünüm için işlendi. Yeniden inşa nöron (Şekil 1 orta, yeşil) gerçek olabiliranatomik bir dönüm noktası Ted, bu durumda trigeminal motor çekirdeğinin (kırmızı anahat) atanmış. Nöron ve yeniden yapılanma hareketi sırasında nöronal yanıt dayanarak bu ikincil kas mili afferent nöron olarak tanımlanabilir. Şekil 2 çene yer değiştirme sırasında bir nöronun fizyolojik yanıt temsili bir örnek göstermektedir. Nöronun tepkisi ani ateş frekans olarak temsil edilmektedir. Nöronal yanıt mandibular yerinden bu özel nöron mandibular konumu ile ilgili duyusal feedback sağlar belirten yakından taklit eder. Şekil 3 Not sinaptofizin için boyama ve Nissl bir leke ile birlikte bir intraselüler lekeli akson yüksek bir büyütme görüntü. Akson bouton içinde sinaptofizin (sarı) ko unutmayın. Şekil 4 fizyolojik karakterize ve intraselüler etiketli, tek bir nöronun bir animasyon. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Genel Bakış yöntemi. Üst sol: mandibular deplasman. Tek nöron (sarı) Orta Hücre içi kayıt (yeşil). Bu nöron morfolojisi, hücre içi kayıt ve enjeksiyondan sonra yeniden inşa edildi. Kırmızı anahat trigeminal motor çekirdeğinin yeri gösterir. Sol alt çene hareketi sırasında, bu nöronun fizyolojik yanıt. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 çenenin hareketi sırasında in vivo olarak kaydedilen tek bir kas duyusal nöron Temsilcisi fizyolojik yanıt. Çene deplasman nöronal yanıt benzerliği dikkat edin. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 problama kas sırasında yanıt intraselüler lekeli duyusal nöronun sinaptik BOUTONS (kırmızı şişlikler) Terminal aksonal arborization. Sinaptofizin için sonraki immünositokimyasal işleme aksonal bouton içinde sinaptofizin lokalizasyonu (sarı) gösterir. Yeşil floresan Nissl leke. Şekil 4, akson fizyolojik yanıt mandibuler hareketi sırasında in vivo kaydedildi kas mili primer afferent nöron akson Animasyon sonra intraselüler boyanmış ve görselleştirme için işlenmiş. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">Şekil 4 yüksek çözünürlüklü video</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">Şekil 4 orta çözünürlüklü video</a>

<ol><li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li>
<li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li>
<li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li>
<li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li>
<li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li>
<li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat%3A+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li>
<li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li>
<li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li>
<li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li>
<li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li>
</ol>

(1985 revize Ulusal Sağlık Enstitüsü, Yayın No 86-23), Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu&#39;nda belirtilen ana hatlarına ve yönetmelik hükümleri uyarınca ve Maryland Üniversitesi Hayvan Bakım hayvanlar üzerinde deneyler yapılan ve Komite kullanın.

Burada gösterilen yöntem tek nöron fonksiyonu ile ilgili önemli bilgi sağlar ve nasıl bireysel nöronların yanıt nöronal devreleri katkıda güçlü bir tekniktir. 9 Bu bilgi sensorimotor fonksiyon anlamak için esastır. Bu tekniğin en büyük gücü, çok sayıda fizyoloji, morfoloji ve sinaptik morfolojisi ve dağıtım da dahil olmak üzere bir nöron ile ilgili parametrelerin belirlenmesi sağlar. Retrograd nöronal etiketleme nöronal devreleri gibi ek bilgi gibi diğer teknikleri ile kombine edildiğinde bu yöntemin karakter...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif ya da ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> elektromanyetik vibratör </td><td> Ling Dinamik Sistemler </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> sinyal üreteci </td><td> Geri Beslemeli Sistemlerin </td><td> PFG605 </td><td> Trapezoidal çıkış sinyali üretme yeteneğine sahip </td></tr><tr><td> elektrot cam </td><td> Sutter Aletleri </td><td> AF100-68-10 </td><td> filamanlı </td></tr><tr><td> elektrot çektirmenin </td><td> Sutter Aletleri </td><td> Model P-2000 veya P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> SP-1120 </td><td> 4 saklanan ° C </td></tr><tr><td> Texas Red avidin DCS </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> Moleküler Probları </td><td> D-3308 </td><td> 3000 molekül ağırlığı, lisin tamir edilebilir </td></tr><tr><td> fare anti-sinaptofizin antikor </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> floresan Nissl leke </td><td> Neurotrace, Moleküler Probları </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> elektrot test </td><td> Winston Elektronik </td><td> BL-1000-B </td><td> elektrot empedansı ölçmek için </td></tr><tr><td> elektrometre </td><td> Akson Aletleri </td><td> Axoprobe 1A, Axoclamp 2B </td><td></td></tr></tbody></table>

hareketi tarafından modülasyonlu nöronlar fizyolojik, morfolojik ve nörokimyasal karakterizasyonu

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Bireysel nöronlarda ve nöron devreleri fonksiyonu rol duyusal ve motor fonksiyonların nöronal mekanizmaları anlamak için esastır. Bir hayvan hareketi sırasında statik 1,2 veya kayıt ekstrasellüler nöronal aktivitenin ise sensorimotor mekanizmaları çoğu soruşturma nöron veya inceleme güveniyor. 3,4 sensorimotor fonksiyonu için temel bir arka plan bu çalışmalar varken, onlar da işlevsel bilgi değerlendirmek yok bir hareket sırasında ortaya çıkan ya da nöronun tam anatomi, fizyoloji ve nörokimyasal fenotip karakterize yeteneği sınırlıdır. Bir in vivo hareketi sırasında bireysel nöronların geniş karakterizasyonu olanak veren bir teknik burada gösterilir. Bu teknik, primer afferent nöronların çalışma değil, aynı zamanda motor nöronlar ve sensorimotor internöronlar karakterize etmek için kullanılabilir. Başlangıçta tek bir nöronun yanıt nöron için açık alanın belirlenmesi takip mandibula çeşitli hareketler sırasında elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak kaydedilir. Nöronal tracer sonra intraselüler nöron içine enjekte edilir ve beynin nöron, ışık, elektron veya konfokal mikroskobu (Şekil 1) ile görülebilmesi şekilde işlenir. Nöronal morfoloji, nöron (Şekil 2,3) fizyolojik yanıt ile ilişkili olduğu ve böylece karakterize nöron ayrıntılı morfoloji sonra yeniden. Bu iletişimde, bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması için önemli anahtar detaylar ve ipuçları verilmektedir. Bu yöntem diğer tekniklerle birleştirerek değerli ek bilgiler altında çalışma nöron tespit edilebilir. Retrograd nöronal etiketleme nöronlar belirlemek için kullanılabilir etiketli nöron sinaps; nöron devresi böylece ayrıntılı olarak belirlenmesi. İmmünositokimya etiketli nöron içinde nörotransmitterlerin incelemek ve etiketli nöron sinaps nöronların kimyasal fenotipleri belirlemek için bu yöntem ile kombine edilebilir. Etiketli nöron da etiketli nöron ultrastrüktürel özellikleri ve mikrodevreler belirlemek için elektron mikroskobu için işlenebilir. Genel olarak bu tekniği iyice böylece sensorimotor fonksiyonu nöron rolünü içine önemli fikir izin in vivo hareket sırasında nöronlar karakterize etmek için güçlü bir yöntemdir.

Hareketi sırasında memeli nöronlar in vivo fizyolojik tepki ölçmek ve nöronal morfoloji, nörokimyasal fenotip ve sinaptik mikrodevreler nöron fizyoloji ilişkilendirmek için bir teknik tarif edilir.

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Bireysel nöronların rolü ve nöronal devrelerdeki işlevleri, duyusal ve motor süreçlerin nöronal mekanizmalarını anlamak için temel teşkil etmektedir...

Bu prosedürün genel amacı, hareket sırasında tekil nöronların fizyolojik yanıtlarını kaydetmek ve ardından bu nöronların morfolojisini ve nörokimyasını karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle hayvanın anestezi altına alınması ve cerrahi olarak hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hareket sırasında tekil nöronların hücre içi yanıtlarının elektrofizyolojik olarak kaydedilmesidir.Hayvan perfüze edildikten ve beyin işlendikten sonra, son adım fizyolojik yanıtın ve nöronal morfolojinin görselleştirilmesi ve analiz edilmesidir. Nihayetinde; hücre içi nöronal kayıt, immünokimya ve analiz teknikleri, hareket sırasında tekil nöronların membran potansiyelindeki modülasyonları göstermek için birleştirilir. Bu tekniğin hücre kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronal bağlantıların ve sinaptik girdilerin korunması, nöronların ex autotomize edilmemesi ve yapay ortamlara yerleştirilmemesidir. Deneyden bir gün önce, motor nöronları retrograd olarak işaretlemek için periferal hedef bölgelere horseradish peroxidase gibi bir nöronal izleyici enjekte edilir.Ertesi gün sıçanı anesteziye alın ve bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin, aseptik teknik kullanarak hayvan tıraş makinesi ile posterior kafatasının üzerindeki deriyi tıraş edin. İç uyluk boyunca bir insizyon yapın ve ek anestezi için femoral vene bir kanül yerleştirin. Kan basıncını izlemek için femoral artere başka bir kanül yerleştirin.Son olarak, trakeaya bir kanül yerleştirin. Ardından, sıçanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Parietal ve interparietal kemiklerin birleşme noktasının hemen altında bulunan geniş venöz sinüse zarar vermemeye dikkat ederek, serebellumu açığa çıkarmak için kraniyotomi gerçekleştirin.Ardından, beynin yüzeyini ısıtılmış mineral yağ ile örtün. Şimdi mandibulayı, elektromanyetik bir vibratöre bağlı bir çubuğa yapıştırın. Mandibulanın hareketi, bir sinyal üretecinden vibratöre gönderilen komut sinyalleri ile kontrol edilir.Ardından, kraniyotomiye komşu deri altına bir topraklama elektrodu yerleştirin. Hücre içi elektrotları hazırlamak için, mikro elektrotları IDE veya tetraetil amonyum bromür boya çözeltisi ile doldurun. Elektrot empedansı, geniş çaplı aksonlar için 60 ila 80 mega ohm, küçük aferen aksonlar ve inter nöronlar için ise 80 ila 150 mega ohm arasındadır.Ardından, hayvanın başının arkasına sabitlenmiş küçük bir teleskop kullanarak mikro elektrodu elektrometrenin kafa aşamasına yerleştirin. Mikro elektrodu, teleskobun 20 x kapalı retikülü aracılığıyla görüntüleyin. Hedef alan, inferior kollikülüsün inferior sınırının yaklaşık 0,5 milimetre caudal kısmındadır.Şimdi, beynin yüzeyinin doğru şekilde konumlandırılmasını sağlamak için pia materde küçük bir açıklık oluşturun. Elektrot beyne değdiğinde bir geri bildirim sinyali üretilecek şekilde kapasitans geri bildirimini fazla ayarlayın. Elektrodu beyne girene kadar ilerletin.Bir sonraki adım, alt çenenin tekrarlı yer değiştirmesini aktive etmektir. Ardından bir step motor kullanarak elektrodu beynin içine ilerletin. DC potansiyelinde ani bir düşüş ve devam eden sinaptik aktivite ile bir nöron delinmesi belirtildiğinde, elektrodu ilerletmeyi durdurun.Penetrasyonun stabil olduğu düşünüldüğünde, ramp-and-hold (artırma-bekletme) ve sinüzoidal çene hareketlerini başlatın. Nöronal yanıtı kaydedin ve nöronu yanıtına göre karakterize edin. Ardından, nöronun reseptif alanını haritalamak için, baş çevresindeki cildi ve ağız içi boşluğu keşfetmek amacıyla küt uçlu bir prob kullanın.Nöronun kas kasılması veya zararlı uyaranlar gibi diğer stimülasyonlara verdiği yanıtı inceleyin. Kayıtlar tamamlandığında, toplamda 15 ila 70 nano amp dakika enjeksiyon sağlayacak şekilde bir ila dört nano amp DC akım enjekte edin. Elektrot penetrasyonunu izleyin ve akım enjeksiyonunu durdurun.Membran potansiyeli -30 milivolt'tan daha pozitif hale gelirse, bir sonraki adım beyin dokusunun dilimlenmesidir. Hayvanı ötanize edip perfüzyonu gerçekleştirdikten sonra beyni çıkarın. Ardından frontal, sagital veya yatay düzlemde 50 ila 100 mikron kalınlığında kesitler alın.Etiketli duyusal nöron ile çeşitli motor nöronlar arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için, dokuya bağlı olarak dokuyu H-R-P-D-A-B veya Texas red için işleyin; ek analizler floresan veya konfokal mikroskopla veya kantitatif kolokalizasyon yazılımı kullanılarak yapılabilir. İsteğe bağlı olarak, etiketli nöronlar içindeki sinapsların yerini kesin olarak belirlemek için sinaptofizine yönelik immünokimyasal işlemler gerçekleştirilebilir. Bu şekil, elektrofizyolojik karakterizasyondan sonra IDE enjekte edilmiş bir beyin sapı nöronunu göstermektedir.Hareket sırasındaki nöronal yanıta dayanarak, bu nöron ikincil bir kas iğciği afferent nöronu olarak tanımlanabilir. Kahverengi ana hat, trigeminal motor çekirdeğin konumunu göstermektedir. Bu şekil, çene deplasmanı sırasında bir duyusal nöronun fizyolojik yanıtını göstermektedir.Nöronun yanıtı, anlık ateşleme frekansı olarak temsil edilmiştir. Yanıtın mandibula yer değiştirmesini yakından taklit ettiği, bunun da bu özel nöronun mandibula pozisyonuyla ilgili duyusal geri bildirim sağladığına işaret ettiği unutulmamalıdır. Bu şekil, kas sondalaması sırasında yanıt veren bir duyusal nöronu göstermektedir.İmmünokimyasal işlemenin ardından nöron ide ile boyandı. Kırmızı şişkinlikler şeklinde görünen sinaptik batonlar, sarı sinaptofizin ile ko-lokalize olarak görülmektedir. Yeşil, floresan bir işaretleyici boyadır.Bu şekil, bir kas iğciği primer afferent nöronuna ait bir aksonun animasyonudur. Animasyonu oluşturmak için etiketlenmiş nöronun birden fazla optik kesiti kullanılmıştır. Bu prosedürü takiben; nöronun ultrastrüktürel özellikleri, nörotransmitterlerin sinaptik butonlarla kolokalizasyonu ve nöronal bağlantı hakkında ek soruları yanıtlamak için elektron mikroskobu, konfokal mikroskopi ve anterograd veya retrograd nöronal etiketleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz uzun bir süre boyunca floresan mikroskobu ile yaşam nöronlar mitokondri görüntüleme sağlayan bir protokol açıklar. Uzun süre üzerinden Görüntüleme mitochondrially hedef floresan protein ve laboratuvarımızda tasarlanmış ve inşa edilmiştir ucuz bir sahne top inkübatör kullanımı lentivirüs aracılı ifade aracılığıyla gerçekleştirilir.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Nöronal morfogenezine ve göç doğru beyin gelişimi altında yatan çok önemli olaylardır. Burada, genetik olarak kültürlenmiş nöronlar ve serebellar granül morfolojisi ve nöronların göç özelliklerinin değerlendirilmesi için gelişmekte olan beyincik işlemek için yöntemleri tarif eder.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Bu protokol, Parkinson hastalığında biliş ve motor kontrolünü ölçmek için yaygın olarak kullanılan geleneksel klinik görevlerin bölümlerini dijitalleştirme imkanı sunar. Biyofizik ritimleri sinir sistemlerinin farklı fonksiyonel düzeylerinden, gönüllü, spontan, otomatik otonjik olarak değişen ortak kayıtlı iken klinik görevler dijilleştirilir.

Parkinson hastalığında motor ve bilişsel fonksiyonun dinamik dijital Biomarkers

Bozulmuş mitokondriyal taşıma ve morfolojisi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda rol oynamaktadır. Sunulan protokol, kalıtsal spastik paraplejide mitokondriyal taşıma ve morfolojiyi değerlendirmek için indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı ön beyin nöronlarını kullanır. Bu protokol, aksonların boyunca mitokondriyal ticaretinin karakterizasyonuna ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesini kolaylaştıracak morfolojilerinin analizine olanak sağlamaktadır.

Kalıtsal Spastik Paraplejide İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda Mitokondriyal Taşıma ve Morfolojinin Analizi

Göz hareket izleme (ya da göz izleme), uzayda gözleri dinlenmeye nerede ortaya koyuyor, ne zaman ve ne kadar süreyle. Burada, biz, sözlü veya başka bir açık raporlar gerektirmeden, birden fazla katılımcı popülasyonları bellek bütünlüğünü göz izleme araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Bellek Eye Movement Kontrolü

Ağırlıksız ve hypergravity beyin hem de hemodinamik ve elektrofizyolojik süreçlerin etkisi EEG ve NIRS teknikleri parabolik uçuş sırasında takip edilecek. Daha karmaşık bir deney, orta ve uzun vadeli uzay uçuşu sırasında yürütmek için planlanan bir fizibilite çalışması.

Beyin Kortikal Fonksiyon ve değiştirildi Yerçekimi Koşullar sırasında Nörobilişsel Performansı arasındaki uyum,

Burada, biz, sıçan ya da fare nocifensive davranışı göstermek olduğu en düşük sıcaklık belirlemek için hızlı, güvenilir ve basit bir prosedür...

Diyabetik Sıçanlarda Termal Nosiseptif Eşik Hızlı Belirlenmesinde

Öğrenin hareket sırasında memeli nöronlarının fizyolojik yanıtlarını in vivo kaydetme ve bunları morfoloji ile nörokimya açısından karakterize etme yöntemini. Bu teknik sinaptik bağlantıları koruyarak geleneksel hücre kültürüne göre avantaj sağlar.

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet