Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, hareket sırasında tekil nöronların fizyolojik yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra bu nöronların morfolojisini ve nörokimyasını karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle hayvanın anestezi altına alınması ve cerrahi olarak hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hareket sırasında tekil nöronların hücre içi yanıtlarının elektrofizyolojik olarak kaydedilmesidir.

Hayvanın perfüzyonu ve beynin işlenmesinin ardından son adım, fizyolojik yanıtın ve nöronal morfolojinin görselleştirilmesi ve analiz edilmesidir. Nihayetinde; hücre içi nöronal kayıt, immünokimya ve analiz teknikleri birleşerek, hareket sırasında tekil nöronların membran potansiyelindeki modülasyonları ortaya koyar. Bu tekniğin hücre kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronal bağlantıların ve sinaptik girdilerin korunması, nöronların ex autotomize edilmemesi ve yapay ortamlara yerleştirilmemesidir. Deneyden bir gün önce, motor nöronları retrograd olarak işaretlemek için periferik hedef bölgelere horse radish peroxidase gibi bir nöronal izleyici enjekte edilir.

Ertesi gün sıçanı anestezi altına alın ve bir ısıtma pedine yerleştirin, aseptik teknik kullanarak hayvan tıraş makinesi ile posterior kafatasının üzerindeki deri bölgesini tıraşlayın. İç uyluk boyunca bir insizyon yapın ve ek anestezi için femoral vene bir kanül yerleştirin. Kan basıncını izlemek için femoral artere başka bir kanül yerleştirin.

Son olarak, trakeaya bir kanül yerleştirin. Ardından, sıçanı bir stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Parietal ve interparietal kemiklerin birleşim yerinin hemen altında bulunan büyük venöz sinüse zarar vermemeye dikkat ederek, serebellumu açığa çıkarmak için kraniyotomi gerçekleştirin.

Ardından, beynin yüzeyini ısıtılmış mineral yağ ile kaplayın. Şimdi mandibula kısmını, elektromanyetik bir vibratöre bağlı bir çubuğa yapıştırın. Mandibulanın hareketi, bir sinyal jeneratöründen vibratöre gönderilen komut sinyalleri ile kontrol edilir.

Ardından, kraniyotominin yanındaki deri altına bir topraklama elektrodu yerleştirin. Hücre içi elektrotları hazırlamak için, mikro elektrotları bir IDE veya tetraetil amonyum bromür boya çözeltisi ile doldurun. Elektrot empedansı, geniş çaplı aksonlar için 60 ila 80 mega ohm ve küçük aferent aksonlar ile internöronlar için 80 ila 150 mega ohmdur.

Ardından, hayvanın başının arkasında sabitlenmiş küçük bir teleskop kullanarak mikro elektrodu elektrometrenin kafa aşamasına yerleştirin. Mikro elektrodu, teleskopun 20 x kapalı retikülü aracılığıyla görüntüleyin. Hedef alan, inferior colliculus'un alt sınırının yaklaşık 0,5 milimetre caudalindedir.

Şimdi, beyin yüzeyinin doğru konumlandırılmasını sağlamak için pia mater üzerinde küçük bir açıklık oluşturun. Elektrot beyne temas ettiğinde bir geri bildirim sinyali üretilecek şekilde kapasitans geri bildirimini aşırı kompanse edin. Elektrodu beyne girene kadar ilerletin.

Bir sonraki adım, alt çenenin tekrarlayan yer değiştirmesini aktive etmektir. Ardından, bir step motor kullanarak elektrodu beyne doğru ilerletin. DC potansiyelindeki ani düşüş ve devam eden sinaptik aktivite ile bir nöron delinmesi belirtildiğinde, elektrodun ilerletilmesini durdurun.

Penetrasyonun stabil olduğu düşünüldüğünde, ramp ve hold ile sinüzoidal çene hareketlerini başlatın. Nöronal yanıtı kaydedin ve nöronu yanıtına göre karakterize edin. Ardından, nöronun reseptif alanını haritalamak için kafa çevresindeki deri ve ağız içi boşluğu keşfetmek amacıyla küt uçlu bir prob kullanın.

Nöronun kas kasılması veya zararlı uyaranlar gibi diğer stimülasyonlara verdiği yanıtı inceleyin. Kayıtlar tamamlandığında, toplamda 15 ila 70 nano amp dakika enjeksiyon sağlayacak şekilde bir ila dört nano amp DC akım enjekte edin. Elektrot penetrasyonunu izleyin ve akım enjeksiyonunu durdurun.

Membran potansiyeli -30 milivolttan daha pozitif hale gelirse, bir sonraki adım beyin dokusunun kesitlenmesidir. Hayvanı ötanazi yapıp perfüze ettikten sonra beyni çıkarın. Ardından frontal, sagital veya horizontal düzlemde 50 ila 100 mikronluk kesitler alın.

Etiketli duyusal nöron ile çeşitli motor nöronlar arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için, dokuya bağlı olarak dokuyu H-R-P-D-A-B veya Texas red için hazırlayın; ek analizler floresan veya konfokal mikroskopla ya da kantitatif kolokalizasyon yazılımı kullanılarak yapılabilir. İsteğe bağlı olarak, etiketli nöronlar içindeki sinapsların yerini doğru şekilde belirlemek için sinaptofizin için immünokimyasal işlem uygulanabilir. Bu şekil, elektrofizyolojik karakterizasyon sonrası IDE enjekte edilmiş bir beyin sapı nöronunu göstermektedir.

Hareket sırasındaki nöronal yanıta dayanarak, bu nöron sekonder bir kas iğci afferent nöronu olarak tanımlanabilir. Kahverengi çerçeve, trigeminal motor çekirdeğin konumunu belirtmektedir. Bu şekil, çene deplasmanı sırasında bir duyusal nöronun fizyolojik yanıtını göstermektedir.

Nöronun yanıtı, anlık ateşleme frekansı olarak temsil edilmiştir. Yanıtın mandibula yer değiştirmesini yakından taklit ettiğine, bunun da bu spesifik nöronun mandibula pozisyonu ile ilgili duyusal geri bildirim sağladığına dikkat edin. Bu şekil, kas sondalaması sırasında yanıt veren bir duyusal nöronu göstermektedir.

İmmünokimyasal işlem sonrası nöron ide ile boyanmıştır. Kırmızı şişkinlikler şeklinde görünen sinaptik batonlar, sarı sinaptofizin ile ko-lokalize halde görülmektedir. Yeşil, floresan bir işaretleyici boyadır.

Bu şekil, bir kas iğciği primer aferent nöronundan alınan bir aksonun animasyonudur. Animasyonu oluşturmak için işaretlenmiş nöronun birden fazla optik kesiti kullanılmıştır. Bu prosedürün ardından, nöronun ultrastrüktürel özellikleri, nörotransmitterlerin sinaptik butonlarla kolokalizasyonu ve nöronal bağlantı hakkında ek soruları yanıtlamak için elektron mikroskobu, konfokal mikroskopi ve anterograd veya retrograd nöronal işaretleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.