Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Hareketi sırasında memeli nöronlar in vivo fizyolojik tepki ölçmek ve nöronal morfoloji, nörokimyasal fenotip ve sinaptik mikrodevreler nöron fizyoloji ilişkilendirmek için bir teknik tarif edilir.

Bu prosedürün genel amacı, hareket sırasında tek nöronların fizyolojik tepkisini kaydetmek ve bu nöronların morfolojisini ve nörokimyasını daha fazla karakterize etmektir. Bu, önce hayvanın uyuşturulması ve cerrahi olarak hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hareket sırasında tek nöronların hücre içi tepkisini elektrofizyolojik olarak kaydetmektir.

Hayvanı perfüze ettikten ve beyni işledikten sonra, son adım fizyolojik tepkiyi ve nöronal morfolojiyi görselleştirmek ve analiz etmektir. Sonuç olarak, hücre içi nöronal kayıt, immünokimya ve analiz teknikleri, hareket sırasında tek nöronların zar potansiyelindeki modülasyonları göstermek için birleşir. Bu tekniğin hücre kültürü gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, nöronal bağlantıların ve sinaptik girdilerin korunması ve nöronların eski ototomize edilmemesi veya yapay ortama yerleştirilmemesidir Bir gün önce, deney, motor nöronları retrograd etiketlemek için periferik hedef bölgelere at turpu, peroksidaz gibi bir nöronal izleyici enjekte eder.

Ertesi gün fareyi uyuşturun ve bir ısıtma yastığına yerleştirin, cildi tıraş edin, aseptik teknik kullanarak arka kafatasının üzerine hayvan makası ile yerleştirin. İç uyluk boyunca bir kesi yapın, ek anestezi için femoral damara bir kanül yerleştirin. Kan basıncını izlemek için femoral artere başka bir kanül yerleştirin.

Son olarak, soluk borusuna bir kanül yerleştirin. Ardından, fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Beyinciği ortaya çıkarmak için bir kraniyotomi yapın, parietal ve inter parietal kemikler arasındaki bağlantının hemen altında bulunan büyük venöz sinüsün kaçınmasına dikkat edin.

Daha sonra, beynin yüzeyini ısıtılmış mineral yağ ile kaplayın. Şimdi mandibulayı bir elektromanyetik vibratöre bağlı bir çubuğa yapıştırın. Mandibulanın hareketi, bir sinyal üretecinden vibratöre giden komut sinyalleri ile kontrol edilir.

Daha sonra, kraniyotominin bitişiğindeki cildin altına bir topraklama elektrodu yerleştirin. Hücre içi elektrotlara hazırlanmak için, pullen dolgu mikro elektrotları bir IDE veya tetraetil çubuk Domin boya çözeltisi testleri ile doldurun. Bu elektrot empedansı, büyük çaplı aksonlar için 60 ila 80 mega ohm ve küçük afferent aksonlar ve inter nöronlar için 80 ila 150 mega ohm'dur.

Ardından, mikro elektrodu, hayvanın başının arkasındaki konuma sabitlenmiş küçük bir teleskop kullanarak elektrometrenin baş aşamasına yerleştirin. Mikro elektrodu teleskobun 20 x kapalı kırmızısından görselleştirin. Hedef alan, inferior colliculus'un inferior sınırına yaklaşık 0,5 milimetredir.

Şimdi beyin yüzeyinin doğru bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak için pia materinde küçük bir açıklık açın. Kapasitans geri beslemesini aşırı telafi edin, böylece elektrot beyne dokunduğunda bir geri besleme sinyali üretilir. Elektrodu beyne girene kadar ilerletin.

Bir sonraki adım, mandibulanın tekrar tekrar yer değiştirmesini aktive etmektir. Daha sonra bir step motor kullanarak elektrodu beyne ilerletin. Bir nöronal impalment, dc potansiyelinde ani bir düşüş ve devam eden sinaptik aktivite ile gösterildiğinde, elektrodu ilerletmeyi durdurun.

Penetrasyonun stabil olduğu kabul edildiğinde, rampa ve tutma ve sinüzoidal çene hareketlerini başlatın. Nöronal yanıtı kaydedin ve yanıtına göre nöronu karakterize edin. Daha sonra, nöronun alıcı alanını haritalamak için, başın etrafındaki cildi ve ağız içi boşluğu keşfetmek için künt bir prob kullanın.

Nöronun kas kasılması veya zararlı uyaranlar gibi diğer uyaranlara verdiği tepkiyi keşfedin. Kayıtlar tamamlandığında, toplam 15 ila 70 nano amper dakikalık bir enjeksiyon için bir ila dört nano amper, DC akımı enjekte edin. Elektrot penetrasyonunu izleyin ve akım enjeksiyonunu durdurun.

Membran potansiyeli eksi 30 milivolttan daha pozitif hale gelirse, bir sonraki adım beyin dokusunu kesitlere ayırmaktır. Hayvanı ötenazi ve perfüze ettikten sonra beyni çıkarın. Daha sonra ön, sagital veya yatay düzlemde 50 ila 100 mikronluk kesitler kesin.

Etiketli duyusal nöron ile çeşitli motor nöronlar arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için, dokuya bağlı olarak dokuyu H-R-P-D-AB veya Texas kırmızısı için işleyin, floresan veya konfokal mikroskop ile ek analizler yapılabilir veya kantitatif kolokalizasyon yazılımı kullanılarak. İstenildiği gibi, sinaptofizin etiketli nöronlar içindeki sinapsları doğru bir şekilde konumlandırması için immünokimyasal işlem yapılabilir. Bu şekil, elektrofizyolojik karakterizasyondan sonra IDE enjekte edilen bir beyin sapı nöronunu göstermektedir.

Hareket sırasındaki nöronal tepkiye bağlı olarak, bu nöron ikincil bir kas iğci afferent nöron olarak tanımlanabilir. Kahverengi anahat, trigeminal motor çekirdeğinin yerini gösterir. Bu şekil, çene yer değiştirmesi sırasında bir duyusal nöronun fizyolojik tepkisini göstermektedir.

Nöronun tepkisi, anlık ateşleme frekansı olarak temsil edilir. Yanıtın mandibular yer değiştirmeyi yakından taklit ettiğini, bu özel nöronun mandibular pozisyonla ilgili duyusal geri bildirim sağladığını gösterdiğine dikkat edin. Bu şekil, kas sondalaması sırasında yanıt veren bir duyusal nöronu göstermektedir.

Nöron, immünokimyasal işlemi takiben ide ile boyandı. Kırmızı şişlikler şeklinde görünen sinaptik batonlar, sarı sinaptofizin ile birlikte lokalize olarak görülür. Yeşil, floresan bir füze lekesidir.

Bu şekil, bir kas iğcikliği birincil afferent nöronundan bir aksonun animasyonudur. Animasyonu oluşturmak için etiketli nöronun çoklu optik bölümleri kullanıldı. Bu prosedürü takiben, nörotransmiterlerin sinaptik bns ve nöronal bağlantı ile nöron kolokalizasyonunun ultra yapısal özellikleri hakkında ek soruları yanıtlamak için elektromikroskopi, konfokal mikroskopi ve ön derece veya retrograd nöronal etiketleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.