Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, hareket sırasında tekil nöronların fizyolojik yanıtlarını kaydetmek ve ardından bu nöronların morfolojisini ve nörokimyasını karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle hayvanın anestezi altına alınması ve cerrahi olarak hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hareket sırasında tekil nöronların hücre içi yanıtlarının elektrofizyolojik olarak kaydedilmesidir.

Hayvan perfüze edildikten ve beyin işlendikten sonra, son adım fizyolojik yanıtın ve nöronal morfolojinin görselleştirilmesi ve analiz edilmesidir. Nihayetinde; hücre içi nöronal kayıt, immünokimya ve analiz teknikleri, hareket sırasında tekil nöronların membran potansiyelindeki modülasyonları göstermek için birleştirilir. Bu tekniğin hücre kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronal bağlantıların ve sinaptik girdilerin korunması, nöronların ex autotomize edilmemesi ve yapay ortamlara yerleştirilmemesidir. Deneyden bir gün önce, motor nöronları retrograd olarak işaretlemek için periferal hedef bölgelere horseradish peroxidase gibi bir nöronal izleyici enjekte edilir.

Ertesi gün sıçanı anesteziye alın ve bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin, aseptik teknik kullanarak hayvan tıraş makinesi ile posterior kafatasının üzerindeki deriyi tıraş edin. İç uyluk boyunca bir insizyon yapın ve ek anestezi için femoral vene bir kanül yerleştirin. Kan basıncını izlemek için femoral artere başka bir kanül yerleştirin.

Son olarak, trakeaya bir kanül yerleştirin. Ardından, sıçanı stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Parietal ve interparietal kemiklerin birleşme noktasının hemen altında bulunan geniş venöz sinüse zarar vermemeye dikkat ederek, serebellumu açığa çıkarmak için kraniyotomi gerçekleştirin.

Ardından, beynin yüzeyini ısıtılmış mineral yağ ile örtün. Şimdi mandibulayı, elektromanyetik bir vibratöre bağlı bir çubuğa yapıştırın. Mandibulanın hareketi, bir sinyal üretecinden vibratöre gönderilen komut sinyalleri ile kontrol edilir.

Ardından, kraniyotomiye komşu deri altına bir topraklama elektrodu yerleştirin. Hücre içi elektrotları hazırlamak için, mikro elektrotları IDE veya tetraetil amonyum bromür boya çözeltisi ile doldurun. Elektrot empedansı, geniş çaplı aksonlar için 60 ila 80 mega ohm, küçük aferen aksonlar ve inter nöronlar için ise 80 ila 150 mega ohm arasındadır.

Ardından, hayvanın başının arkasına sabitlenmiş küçük bir teleskop kullanarak mikro elektrodu elektrometrenin kafa aşamasına yerleştirin. Mikro elektrodu, teleskobun 20 x kapalı retikülü aracılığıyla görüntüleyin. Hedef alan, inferior kollikülüsün inferior sınırının yaklaşık 0,5 milimetre caudal kısmındadır.

Şimdi, beynin yüzeyinin doğru şekilde konumlandırılmasını sağlamak için pia materde küçük bir açıklık oluşturun. Elektrot beyne değdiğinde bir geri bildirim sinyali üretilecek şekilde kapasitans geri bildirimini fazla ayarlayın. Elektrodu beyne girene kadar ilerletin.

Bir sonraki adım, alt çenenin tekrarlı yer değiştirmesini aktive etmektir. Ardından bir step motor kullanarak elektrodu beynin içine ilerletin. DC potansiyelinde ani bir düşüş ve devam eden sinaptik aktivite ile bir nöron delinmesi belirtildiğinde, elektrodu ilerletmeyi durdurun.

Penetrasyonun stabil olduğu düşünüldüğünde, ramp-and-hold (artırma-bekletme) ve sinüzoidal çene hareketlerini başlatın. Nöronal yanıtı kaydedin ve nöronu yanıtına göre karakterize edin. Ardından, nöronun reseptif alanını haritalamak için, baş çevresindeki cildi ve ağız içi boşluğu keşfetmek amacıyla küt uçlu bir prob kullanın.

Nöronun kas kasılması veya zararlı uyaranlar gibi diğer stimülasyonlara verdiği yanıtı inceleyin. Kayıtlar tamamlandığında, toplamda 15 ila 70 nano amp dakika enjeksiyon sağlayacak şekilde bir ila dört nano amp DC akım enjekte edin. Elektrot penetrasyonunu izleyin ve akım enjeksiyonunu durdurun.

Membran potansiyeli -30 milivolt'tan daha pozitif hale gelirse, bir sonraki adım beyin dokusunun dilimlenmesidir. Hayvanı ötanize edip perfüzyonu gerçekleştirdikten sonra beyni çıkarın. Ardından frontal, sagital veya yatay düzlemde 50 ila 100 mikron kalınlığında kesitler alın.

Etiketli duyusal nöron ile çeşitli motor nöronlar arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için, dokuya bağlı olarak dokuyu H-R-P-D-A-B veya Texas red için işleyin; ek analizler floresan veya konfokal mikroskopla veya kantitatif kolokalizasyon yazılımı kullanılarak yapılabilir. İsteğe bağlı olarak, etiketli nöronlar içindeki sinapsların yerini kesin olarak belirlemek için sinaptofizine yönelik immünokimyasal işlemler gerçekleştirilebilir. Bu şekil, elektrofizyolojik karakterizasyondan sonra IDE enjekte edilmiş bir beyin sapı nöronunu göstermektedir.

Hareket sırasındaki nöronal yanıta dayanarak, bu nöron ikincil bir kas iğciği afferent nöronu olarak tanımlanabilir. Kahverengi ana hat, trigeminal motor çekirdeğin konumunu göstermektedir. Bu şekil, çene deplasmanı sırasında bir duyusal nöronun fizyolojik yanıtını göstermektedir.

Nöronun yanıtı, anlık ateşleme frekansı olarak temsil edilmiştir. Yanıtın mandibula yer değiştirmesini yakından taklit ettiği, bunun da bu özel nöronun mandibula pozisyonuyla ilgili duyusal geri bildirim sağladığına işaret ettiği unutulmamalıdır. Bu şekil, kas sondalaması sırasında yanıt veren bir duyusal nöronu göstermektedir.

İmmünokimyasal işlemenin ardından nöron ide ile boyandı. Kırmızı şişkinlikler şeklinde görünen sinaptik batonlar, sarı sinaptofizin ile ko-lokalize olarak görülmektedir. Yeşil, floresan bir işaretleyici boyadır.

Bu şekil, bir kas iğciği primer afferent nöronuna ait bir aksonun animasyonudur. Animasyonu oluşturmak için etiketlenmiş nöronun birden fazla optik kesiti kullanılmıştır. Bu prosedürü takiben; nöronun ultrastrüktürel özellikleri, nörotransmitterlerin sinaptik butonlarla kolokalizasyonu ve nöronal bağlantı hakkında ek soruları yanıtlamak için elektron mikroskobu, konfokal mikroskopi ve anterograd veya retrograd nöronal etiketleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.