September 29th, 2017
Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.
Bu görüntüleme ve analiz tekniğinin genel amacı, belirli bilgileri karmaşık bir sinyalden izole etmektir. Spesifik olarak, bu protokol, sinire özgü mitokondrinin epidermis içindeki diğer mitokondrilerle nasıl görselleştirileceğini ve ölçüleceğini açıklar. Bu yöntem, sağlıklı bireylerin intraepidermal sinir liflerindeki mitokondrinin nörolojik komplikasyonları olan hastaların sinire özgü mitokondrilerine kıyasla nasıl olduğu gibi nöroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık bir sinyal almamız ve ondan belirli bilgileri çıkarmamızdır. Bu protokol, bu pipetlerdeki sinyal gibi belirli bir sinyali etraflarındaki sinyallerden izole etmemize yardımcı olur. Önce bu şemaya göre 96 oyuklu bir plakayı etiketleyerek cilt biyopsilerinin floresan immünohistokimya boyaması için hazırlanın.
Daha sonra, ikincil antikorların üst sıranın her bir oyuğuna spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için 150 mikrolitre stok sinyal arttırıcı solüsyon pipetleyin. 96 oyuklu plakanın ikinci ve üçüncü sıralarındaki her bir oyuğa 150 mikrolitre 1x fosfat tamponlu salin ekleyerek durulama kuyuları hazırlayın. Daha sonra dördüncü sıradaki kuyucuklara 150 mikrolitre %5 BSA bloke etme solüsyonu ekleyin.
Primer antikorlar PGP9.5 ve PDH'yi 1.500 mikrolitre% 1 BSA durulama solüsyonu içinde seyreltin ve beşinci sıradaki her bir oyuğa 150 mikrolitre ekleyin. Bölümleri birinci sıradaki sinyal arttırıcı solüsyona aktarmak için bir aşılama döngüsü kullanın. Bölümler beşinci sıradaki birincil antikor çözeltisine girdikten sonra, buharlaşmayı önlemek için plakayı laboratuvar filmi ile sıkıca sarın ve ardından numuneleri oda sıcaklığında düz bir külbütör üzerinde bir saat boyunca çalkalayın.
Gece boyunca dört santigrat derecede sallanarak kuluçkaya yatırın. Prosedürün ikinci gününe, 96 oyuklu plakanın altıncı, yedi ve sekizinci sıralarındaki kuyucuklara 150 mikrolitre %1 BSA durulama solüsyonu pipetleyerek başlayın. Florofor konjuge ikincil antikorları 1.500 mikrolitre% 1 BSA'ya ekleyin.
Daha sonra 150 mikrolitre ikincil antikor solüsyonunu dokuzuncu sıranın her bir oyuğuna pipetleyin. Altı, yedi ve sekizinci kuyulardan geçerek bölümleri durulayın. Bölümler dokuzuncu sıradaki ikincil antikor çözeltisine girdikten sonra, plakayı parafilm içine sarın ve floresan sinyallerini korumak için alüminyum folyo ile örtün.
Daha önce olduğu gibi sallanarak kuluçkaya yatırın. Üçüncü günde, 150 mikrolitre steril filtrelenmiş 1x PBS'yi 10, 11 ve 12. sıralara pipetleyin. Numuneleri 10. sıraya aktarın, ardından plakayı alüminyum folyo ile kaplayın.
Oda sıcaklığında sallanarak bir saat durulayın. Ardından, slaytın üzerine 50 mikrolitre filtrelenmiş 1x PBS pipetleyerek bölümleri monte etmek için bir mikroskop lamı hazırlayın. Durulamalar tamamlandıktan sonra, 12. satırdan bir bölümü sürgün üzerine aktarın ve ardından doğrudan bölümün üzerine DAPI içeren bir ila iki damla montaj reaktifi ekleyin.
Bölümün üzerine yavaşça 50 milimetre x 24 milimetre 1.5 mikroskop cam lamel yerleştirin. Slaytları saklamadan veya görüntülemeden önce montaj ortamını sertleştirmek için slaytları gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında yerleştirin. Ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskopta 40X yağa daldırma objektifini seçin.
Çekirdekleri, sinir liflerini ve mitokondriyi görüntülemek için uygun lazerleri ve dedektörleri seçin. Aşağıdaki tarama parametrelerini, 12 bit yoğunluk çözünürlüğünü, iki kare ortalaması ile 500 Hertz tarama hızını ve 2.2 yakınlaştırmayı mikroskop yazılımına girin. 1024 x 1024 tarama çözünürlüğü seçerek mikroskop yazılımını optimize edilmiş yanal çözünürlük için ayarlayın.
210 nanometre Z adım boyutuna sahip bir hava ünitesinin konfokal açıklığını seçerek eksenel çözünürlüğü ve optik kesitlemeyi optimize edin. Her sinyali ayrı ayrı tarayın ve aşırı ve düşük doymuş pikselleri çıkarmak için dedektör voltajını ve ofsetini ayarlayın. Sinir sinyali için canlı bir taramayı etkinleştirin ve doku kesiti içindeki sinir sinyalini kapsayan mikroskop yazılımında üst ve alt odak düzlemlerini bulmak ve ayarlamak için Z odak kontrolünü ayarlayın.
Floresan sinyal karışmasını ortadan kaldırmak için son Z serisini sıralı tarama ile tarayın. Orijinal görüntünün yinelenen bir görüntüsü üzerinde bir seçim aracı kullanarak epidermisin etrafına bir bölge çizerek epidermisi stratum corneum ve dermisten izole edin. Ardından görüntüyü seçime göre kırpın.
Yayılma işlevini hesaplama özelliğini kullanarak yeşil ve kırmızı floresan konfokal sinyaller için nokta yayılma işlevlerini hesaplayın. Ardından, yağ için orta kırılma indisi parametrelerini 1.515'e ve 40X yağ objektifi için sayısal açıklığı 1.25'e ayarlayın. Dedektör iğne deliğini bir hava ünitesine ayarlayın ve bir lazer uyarma dalga boyu seçin.
Yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinin dekonvülasyonu için %100 güvenirliğe, 10 döngülük yineleme sınırına ve yeşil ve kırmızı PSF'lere ayarlanmış yinelemeli geri yükleme kullanın. Pürüzsüz özelliğin işaretini kaldırmayı, eşikleme için mutlak yoğunluğu, 3.000 alt eşiği ve 65.535 üst eşiği seçerek dekonvolvasyonlu sinir sinyallerinin etrafında bir yüzey oluşturmak için yüzey oluşturma aracını kullanın. Yüzeyleri 10 vokselin üzerinde tutun.
Tek sinir olmayan yüzeyleri seçmek için sinir yüzeyindeki düzenle sekmesini kullanarak sinir olmayan yüzeyleri çıkarın veya birden fazla sinir olmayan yüzeyi seçmek için Kontrol tuşunu basılı tutun. Delete (Sil) düğmesine basarak seçilen sinir dışı yüzeyleri silin. Sinir yüzeyindeki düzenle sekmesini kullanın ve maske özelliklerinde tümünü maskele düğmesine basın.
Yeni pencerede, kanal seçimi altında çözülmüş beşinci kanal mitokondrisini seçin ve ardından maskeyi uygulamadan önce yinelenen kanalı kontrol edin. Sabit iç/dış için radyo düğmesine basın ve dış yüzeyi 0.0'a ayarlayın ve OKS düğmesine basın. Son olarak, pürüzsüz özelliğin işaretini kaldır'ı seçerek ve eşikleme için arka plan çıkarmayı kullanarak maskelenmiş dekonvolvasyonlu mitokondriyal sinyallerin etrafında bir yüzey oluşturmak için yüzey oluşturma aracını kullanarak mitokondriye özgü yüzeyler oluşturun.
En büyük kürenin çapını 1.50 mikrometreye, alt eşiği 2.000'e ve üst eşiği maksimum 65.535'e ayarlayın. Yüzeyleri 1.0 vokselin üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. Bu temsili 3D konfokal mikroskopi görüntüsü, sinire özgü yeşil floresan sinyalini göstermektedir.
Sinir sinyali için camgöbeği ile gösterilen bir 3D yüzey oluşturulur. Daha sonra sinire özgü mitokondriyal sinyal, sinir yüzeyi bir maskeleme aracı olarak kullanılarak epidermal mitokondriyal sinyallerin geri kalanından izole edilir. Elde edilen sinire özgü mitokondriyal kırmızı floresan sinyali, camgöbeği ile gösterilen sinir yüzeyi içindeki mitokondri etrafında macenta olarak gösterilen yüzeyler oluşturmak için kullanılır.
Bu da sinir liflerindeki mitokondrinin detaylı bir şekilde görülmesini sağlar. Burada, mitokondriyal yüzey verileri, hacimlerine göre çeşitli kıvrımların her birinde bulunan mitokondri yüzdesini görselleştirmek için bir boyut frekans histogramı olarak sunulur. Bu prosedürü denerken, bölümler boyunca eşit ve tutarlı bir boyama sağlamak için dokunun solüsyonlara tamamen daldırıldığından emin olmak için boyama işlemi sırasında dokuya özen göstermek önemlidir.
Bu videoyu izledikten sonra, insan intraepidermal sinir lifleri içindeki mitokondriyi nasıl görselleştireceğinizi ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ayrıntılı protokolümüz, nöropati gibi mitokondriyal temelli nörolojik hastalıkların patogenezinin altında yatan mekanizmaları anlamak amacıyla diğer araştırmacılara insan derisi biyopsilerini nasıl boyayacaklarını, görüntüleyeceklerini, işleyeceklerini ve analiz edeceklerini öğretmek için tasarlanmıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Bu protokol, üç boyutlu görüntüleme ve analiz kullanarak sinir-spesifik mitokondriyi görselleştirme ve kantitatif analiz için bir teknik açıklamaktadır. Araştırmacıların karmaşık arka planlardan belirli mitokondriyal sinyalleri izole etmelerini sağlar, bu da nörolojik durumları anlamak için çok önemlidir.
This protocol enables precise isolation and quantification of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers, addressing a critical need in neurology research to de-risk target validation by providing disease-relevant, quantitative mitochondrial phenotypes. The method supports mechanistic de-risking in preclinical models by allowing direct comparison of mitochondrial characteristics between healthy and neurologically affected tissues, thereby improving predictive confidence in target selection for neurodegenerative disorders.
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically enabling mechanistic de-risking of mitochondrial targets in neurodegenerative disease programs.