Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Bu görüntüleme ve analiz tekniğinin genel amacı, karmaşık bir sinyalden belirli bilgileri izole etmektir. Spesifik olarak bu protokol, epidermis içindeki diğer mitokondrilerle birlikte sinire özgü mitokondrilerin nasıl görselleştirileceğini ve nicelleştirileceğini açıklamaktadır. Bu yöntem, sağlıklı bireylerin intraepidermal sinir liflerindeki mitokondrilerin, nörolojik komplikasyonları olan hastaların sinire özgü mitokondrileri ile nasıl karşılaştırıldığı gibi nöroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık bir sinyali alıp ondan spesifik bilgileri ayıklayabilmemizdir. Bu protokol, bu pipetlerdeki sinyal gibi spesifik bir sinyali, etrafındaki sinyallerden izole etmemize yardımcı olur. Öncelikle bir 96 kuyucuklu plakayı bu şemaya göre etiketleyerek deri biyopsilerinin floresan immünohistokimyasal boyamasına hazırlık yapın.

Ardından, sekonder antikorların spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için üst sıradaki her bir kuyucuğa 150 µL stok sinyal artırıcı çözelti pipetleyin. 96 kuyucuklu plakadaki ikinci ve üçüncü sıraların her bir kuyucuğuna 150 µL 1x fosfat tamponlu salin ekleyerek durulama kuyucuklarını hazırlayın. Daha sonra dördüncü sıradaki kuyucuklara 150 µL %5 BSA bloklama çözeltisi ekleyin.

PGP9.5 ve PDH primer antikorlarını 1.500 µL %1'lik BSA durulama çözeltisinde seyreltin ve beşinci sıradaki her bir kuyucuğa 150 µL ekleyin. Kesitleri birinci sıradaki sinyal artırıcı çözeltiye aktarmak için bir ekim loop'u kullanın. Kesitler beşinci sıradaki primer antikor çözeltisine yerleştirildiğinde, buharlaşmayı önlemek için plakayı laboratuvar filmiyle sıkıca sarın ve ardından örnekleri oda sıcaklığında, düz bir rocker üzerinde bir saat boyunca çalkalayın.

Dört santigrat derecede, gece boyunca sallanır halde inkübe edin. Prosedürün ikinci gününe, 96 kuyucuklu plakanın altıncı, yedinci ve sekizinci sıradaki kuyucuklara 150 µL %1 BSA durulama çözeltisi pipetleyerek başlayın. Florofor konjugatlı sekonder antikorları 1.500 µL %1 BSA içerisine ekleyin.

Ardından, dokuzuncu sıranın her bir kuyucuğuna 150 µL sekonder antikor solüsyonu pipetleyin. Kesitleri altıncı, yedinci ve sekizinci kuyucuklardan geçirerek durulayın. Kesitler dokuzuncu sıradaki sekonder antikor solüsyonuna ulaştığında, floresan sinyalleri korumak için plakayı parafilm ile sarın ve alüminyum folyo ile kaplayın.

Daha önce olduğu gibi sallayarak inkübe edin. Üçüncü günde, 10, 11 ve 12. sıralara 150 µL steril filtre edilmiş 1x PBS pipetleyin. Numuneleri 10. sıraya aktarın ve ardından plakayı alüminyum folyo ile kapatın.

Sallama eşliğinde oda sıcaklığında bir saat boyunca yıkayın. Ardından, lam üzerine 50 µL filtrelenmiş 1x PBS pipetleyerek kesitlerin montajı için bir mikroskop lamı hazırlayın. Yıkama işlemleri tamamlandığında, 12. sıradan bir kesiti lama aktarın ve ardından kesitin doğrudan üzerine DAPI içeren montaj reaktifinden bir ila iki damla ekleyin.

Kesitin üzerine nazikçe 50 milimetre x 24 milimetre 1,5 mikroskop cam lameli yerleştirin. Lamları saklamadan veya görüntülemeden önce, montaj ortamının kuruması için oda sıcaklığında, karanlıkta bir gece bekletin. Ters bir lazer taramalı konfokal mikroskopta 40X yağ daldırma objektifini seçin.

Çekirdekleri, sinir liflerini ve mitokondrileri görüntülemek için uygun lazerleri ve dedektörleri seçin. Mikroskop yazılımına şu tarama parametrelerini girin: 12-bit yoğunluk çözünürlüğü, iki kare ortalamalı 500 Hertz tarama hızı ve 2,2 yakınlaştırma. 1024 x 1024 tarama çözünürlüğünü seçerek mikroskop yazılımını optimize edilmiş lateral çözünürlük için ayarlayın.

Bir hava birimi boyutunda konfokal açıklık ve 210 nanometre Z adım boyutu seçerek aksiyel çözünürlüğü ve optik kesitlemeyi optimize edin. Her sinyali ayrı ayrı tarayın; aşırı veya yetersiz doygunluğa sahip pikselleri gidermek için detektör voltajını ve ofsetini ayarlayın. Sinir sinyali için canlı taramayı etkinleştirin ve doku kesiti içindeki sinir sinyalini kapsayan üst ve alt odak düzlemlerini bulup belirlemek için mikroskop yazılımındaki Z odak kontrolünü ayarlayın.

Floresans sinyal çapraz etkileşimini (crosstalk) önlemek için son Z serisini ardışık tarama ile tarayın. Orijinal görüntünün kopyalanmış bir görüntüsü üzerinde seçim aracını kullanarak epidermis etrafında bir bölge çizerek, epidermisi stratum corneum ve dermisten ayırın. Ardından görüntüyü seçilen bölgeye göre kırpın.

Yayılma fonksiyonunu hesapla özelliğini kullanarak yeşil ve kırmızı floresan konfokal sinyalleri için nokta yayılma fonksiyonlarını hesaplayın. Ardından, ortam kırılma indisi parametresini yağ için 1.515 ve 40X yağ immersiyon objektifinin sayısal açıklığını 1.25 olarak ayarlayın. Detektör iğne deliğini bir hava birimi olarak ayarlayın ve bir lazer uyarım dalga boyu seçin.

%100 güven düzeyine ayarlanmış iteratif restorasyon, 10 döngülük iterasyon limiti ve yeşil ile kırmızı floresan sinyallerinin dekonvolüsyonu için yeşil ve kırmızı PSF'leri kullanın. Dekonvolüe edilmiş sinir sinyallerinin çevresinde bir yüzey oluşturmak için yüzey oluşturma aracını kullanırken; yumuşatılmış özellik seçeneğinin işaretini kaldırın, eşikleme için mutlak yoğunluğu seçin, alt eşik değerini 3, 000 ve üst eşik değerini 65, 535 olarak belirleyin. Yüzeyleri 10 vokselin üzerinde tutun.

Sinir yüzeyi sekmesindeki düzenleme sekmesini kullanarak tekil sinir dışı yüzeyleri seçin veya birden fazla sinir dışı yüzeyi seçmek için Kontrol tuşuna basılı tutun. Seçilen sinir dışı yüzeyleri Sil düğmesine basarak silin. Sinir yüzeyindeki düzenleme sekmesini kullanın ve maske özelliklerindeki tümünü maskele düğmesine basın.

Yeni pencerede, kanal seçimi altındaki kanal beş mitokondri deconvolved seçeneğini belirleyin ve ardından maskeyi uygulamadan önce kanalı kopya seçeneğini işaretleyin. Sabit iç/dış radyo düğmesine basın, yüzey dışındaki belirlenen voksel değerini 0.0 olarak işaretleyin ve Tamam düğmesine basın. Son olarak, pürüzsüz özelliği işaretlemeden seçerek ve eşikleme için arka plan çıkarma yöntemini kullanarak, maskelenmiş deconvolved mitokondriyal sinyallerin etrafında bir yüzey oluşturmak için yüzey oluşturma aracını kullanarak mitokondriye özgü yüzeyler oluşturun.

En büyük kürenin çapını 1,50 µm, alt eşiği 2.000 ve üst eşiği maksimum 65.535 olarak ayarlayın. Yüzeylerin 1,0 vokselin üzerinde olduğundan emin olun. Bu temsili 3D konfokal mikroskopi görüntüsü, sinire özgü yeşil floresan sinyalini göstermektedir.

Sinir sinyali için siyan renginde gösterilen bir 3B yüzey oluşturulur. Ardından, sinir yüzeyi bir maskeleme aracı olarak kullanılarak, sinire özgü mitokondriyal sinyal, epidermal mitokondriyal sinyallerin geri kalanından ayrıştırılır. Elde edilen sinire özgü mitokondriyal kırmızı floresan sinyali, siyan renginde gösterilen sinir yüzeyi içindeki mitokondrilerin etrafında macenta renginde gösterilen yüzeyleri oluşturmak için kullanılır.

Bu, sinir liflerindeki mitokondrilerin ayrıntılı olarak görülmesini sağlar. Burada, mitokondriyal yüzey verileri, her bir farklı kıvrımda hacimlerine göre mevcut olan mitokondrilerin yüzdesini görselleştirmek için bir boyut frekans histogramı olarak sunulmuştur. Bu prosedür uygulanırken, kesitler boyunca eşit ve tutarlı bir boyama sağlamak için dokunun çözeltilere tamamen daldırıldığından emin olmak amacıyla boyama işlemi sırasında dokunun özenle korunması önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan intraepidermal sinir lifleri içindeki mitokondrilerin nasıl görselleştirileceği ve nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Detaylı protokolümüz, nöropati gibi mitokondri temelli nörolojik hastalıkların patogenezinin altında yatan mekanizmaları anlamak amacıyla, diğer araştırmacılara insan deri biyopsilerinin nasıl boyanacağını, görüntüleneceğini, işleneceğini ve analiz edileceğini öğretmek için tasarlanmıştır.