Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi
29 Eylül 2017
Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.
Bu görüntüleme ve analiz tekniğinin genel amacı, belirli bilgileri karmaşık bir sinyalden izole etmektir. Spesifik olarak, bu protokol, sinire özgü mitokondrinin epidermis içindeki diğer mitokondrilerle nasıl görselleştirileceğini ve ölçüleceğini açıklar. Bu yöntem, sağlıklı bireylerin intraepidermal sinir liflerindeki mitokondrinin nörolojik komplikasyonları olan hastaların sinire özgü mitokondrilerine kıyasla nasıl olduğu gibi nöroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık bir sinyal almamız ve ondan belirli bilgileri çıkarmamızdır. Bu protokol, bu pipetlerdeki sinyal gibi belirli bir sinyali etraflarındaki sinyallerden izole etmemize yardımcı olur. Önce bu şemaya göre 96 oyuklu bir plakayı etiketleyerek cilt biyopsilerinin floresan immünohistokimya boyaması için hazırlanın.
Daha sonra, ikincil antikorların üst sıranın her bir oyuğuna spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için 150 mikrolitre stok sinyal arttırıcı solüsyon pipetleyin. 96 oyuklu plakanın ikinci ve üçüncü sıralarındaki her bir oyuğa 150 mikrolitre 1x fosfat tamponlu salin ekleyerek durulama kuyuları hazırlayın. Daha sonra dördüncü sıradaki kuyucuklara 150 mikrolitre %5 BSA bloke etme solüsyonu ekleyin.
Primer antikorlar PGP9.5 ve PDH'yi 1.500 mikrolitre% 1 BSA durulama solüsyonu içinde seyreltin ve beşinci sıradaki her bir oyuğa 150 mikrolitre ekleyin. Bölümleri birinci sıradaki sinyal arttırıcı solüsyona aktarmak için bir aşılama döngüsü kullanın. Bölümler beşinci sıradaki birincil antikor çözeltisine girdikten sonra, buharlaşmayı önlemek için plakayı laboratuvar filmi ile sıkıca sarın ve ardından numuneleri oda sıcaklığında düz bir külbütör üzerinde bir saat boyunca çalkalayın.
Gece boyunca dört santigrat derecede sallanarak kuluçkaya yatırın. Prosedürün ikinci gününe, 96 oyuklu plakanın altıncı, yedi ve sekizinci sıralarındaki kuyucuklara 150 mikrolitre %1 BSA durulama solüsyonu pipetleyerek başlayın. Florofor konjuge ikincil antikorları 1.500 mikrolitre% 1 BSA'ya ekleyin.
Daha sonra 150 mikrolitre ikincil antikor solüsyonunu dokuzuncu sıranın her bir oyuğuna pipetleyin. Altı, yedi ve sekizinci kuyulardan geçerek bölümleri durulayın. Bölümler dokuzuncu sıradaki ikincil antikor çözeltisine girdikten sonra, plakayı parafilm içine sarın ve floresan sinyallerini korumak için alüminyum folyo ile örtün.
Daha önce olduğu gibi sallanarak kuluçkaya yatırın. Üçüncü günde, 150 mikrolitre steril filtrelenmiş 1x PBS'yi 10, 11 ve 12. sıralara pipetleyin. Numuneleri 10. sıraya aktarın, ardından plakayı alüminyum folyo ile kaplayın.
Oda sıcaklığında sallanarak bir saat durulayın. Ardından, slaytın üzerine 50 mikrolitre filtrelenmiş 1x PBS pipetleyerek bölümleri monte etmek için bir mikroskop lamı hazırlayın. Durulamalar tamamlandıktan sonra, 12. satırdan bir bölümü sürgün üzerine aktarın ve ardından doğrudan bölümün üzerine DAPI içeren bir ila iki damla montaj reaktifi ekleyin.
Bölümün üzerine yavaşça 50 milimetre x 24 milimetre 1.5 mikroskop cam lamel yerleştirin. Slaytları saklamadan veya görüntülemeden önce montaj ortamını sertleştirmek için slaytları gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında yerleştirin. Ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskopta 40X yağa daldırma objektifini seçin.
Çekirdekleri, sinir liflerini ve mitokondriyi görüntülemek için uygun lazerleri ve dedektörleri seçin. Aşağıdaki tarama parametrelerini, 12 bit yoğunluk çözünürlüğünü, iki kare ortalaması ile 500 Hertz tarama hızını ve 2.2 yakınlaştırmayı mikroskop yazılımına girin. 1024 x 1024 tarama çözünürlüğü seçerek mikroskop yazılımını optimize edilmiş yanal çözünürlük için ayarlayın.
210 nanometre Z adım boyutuna sahip bir hava ünitesinin konfokal açıklığını seçerek eksenel çözünürlüğü ve optik kesitlemeyi optimize edin. Her sinyali ayrı ayrı tarayın ve aşırı ve düşük doymuş pikselleri çıkarmak için dedektör voltajını ve ofsetini ayarlayın. Sinir sinyali için canlı bir taramayı etkinleştirin ve doku kesiti içindeki sinir sinyalini kapsayan mikroskop yazılımında üst ve alt odak düzlemlerini bulmak ve ayarlamak için Z odak kontrolünü ayarlayın.
Floresan sinyal karışmasını ortadan kaldırmak için son Z serisini sıralı tarama ile tarayın. Orijinal görüntünün yinelenen bir görüntüsü üzerinde bir seçim aracı kullanarak epidermisin etrafına bir bölge çizerek epidermisi stratum corneum ve dermisten izole edin. Ardından görüntüyü seçime göre kırpın.
Yayılma işlevini hesaplama özelliğini kullanarak yeşil ve kırmızı floresan konfokal sinyaller için nokta yayılma işlevlerini hesaplayın. Ardından, yağ için orta kırılma indisi parametrelerini 1.515'e ve 40X yağ objektifi için sayısal açıklığı 1.25'e ayarlayın. Dedektör iğne deliğini bir hava ünitesine ayarlayın ve bir lazer uyarma dalga boyu seçin.
Yeşil ve kırmızı floresan sinyallerinin dekonvülasyonu için %100 güvenirliğe, 10 döngülük yineleme sınırına ve yeşil ve kırmızı PSF'lere ayarlanmış yinelemeli geri yükleme kullanın. Pürüzsüz özelliğin işaretini kaldırmayı, eşikleme için mutlak yoğunluğu, 3.000 alt eşiği ve 65.535 üst eşiği seçerek dekonvolvasyonlu sinir sinyallerinin etrafında bir yüzey oluşturmak için yüzey oluşturma aracını kullanın. Yüzeyleri 10 vokselin üzerinde tutun.
Tek sinir olmayan yüzeyleri seçmek için sinir yüzeyindeki düzenle sekmesini kullanarak sinir olmayan yüzeyleri çıkarın veya birden fazla sinir olmayan yüzeyi seçmek için Kontrol tuşunu basılı tutun. Delete (Sil) düğmesine basarak seçilen sinir dışı yüzeyleri silin. Sinir yüzeyindeki düzenle sekmesini kullanın ve maske özelliklerinde tümünü maskele düğmesine basın.
Yeni pencerede, kanal seçimi altında çözülmüş beşinci kanal mitokondrisini seçin ve ardından maskeyi uygulamadan önce yinelenen kanalı kontrol edin. Sabit iç/dış için radyo düğmesine basın ve dış yüzeyi 0.0'a ayarlayın ve OKS düğmesine basın. Son olarak, pürüzsüz özelliğin işaretini kaldır'ı seçerek ve eşikleme için arka plan çıkarmayı kullanarak maskelenmiş dekonvolvasyonlu mitokondriyal sinyallerin etrafında bir yüzey oluşturmak için yüzey oluşturma aracını kullanarak mitokondriye özgü yüzeyler oluşturun.
En büyük kürenin çapını 1.50 mikrometreye, alt eşiği 2.000'e ve üst eşiği maksimum 65.535'e ayarlayın. Yüzeyleri 1.0 vokselin üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. Bu temsili 3D konfokal mikroskopi görüntüsü, sinire özgü yeşil floresan sinyalini göstermektedir.
Sinir sinyali için camgöbeği ile gösterilen bir 3D yüzey oluşturulur. Daha sonra sinire özgü mitokondriyal sinyal, sinir yüzeyi bir maskeleme aracı olarak kullanılarak epidermal mitokondriyal sinyallerin geri kalanından izole edilir. Elde edilen sinire özgü mitokondriyal kırmızı floresan sinyali, camgöbeği ile gösterilen sinir yüzeyi içindeki mitokondri etrafında macenta olarak gösterilen yüzeyler oluşturmak için kullanılır.
Bu da sinir liflerindeki mitokondrinin detaylı bir şekilde görülmesini sağlar. Burada, mitokondriyal yüzey verileri, hacimlerine göre çeşitli kıvrımların her birinde bulunan mitokondri yüzdesini görselleştirmek için bir boyut frekans histogramı olarak sunulur. Bu prosedürü denerken, bölümler boyunca eşit ve tutarlı bir boyama sağlamak için dokunun solüsyonlara tamamen daldırıldığından emin olmak için boyama işlemi sırasında dokuya özen göstermek önemlidir.
Bu videoyu izledikten sonra, insan intraepidermal sinir lifleri içindeki mitokondriyi nasıl görselleştireceğinizi ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ayrıntılı protokolümüz, nöropati gibi mitokondriyal temelli nörolojik hastalıkların patogenezinin altında yatan mekanizmaları anlamak amacıyla diğer araştırmacılara insan derisi biyopsilerini nasıl boyayacaklarını, görüntüleyeceklerini, işleyeceklerini ve analiz edeceklerini öğretmek için tasarlanmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, üç boyutlu görüntüleme ve analiz kullanarak sinir-spesifik mitokondriyi görselleştirme ve kantitatif analiz için bir teknik açıklamaktadır. Araştırmacıların karmaşık arka planlardan belirli mitokondriyal sinyalleri izole etmelerini sağlar, bu da nörolojik durumları anlamak için çok önemlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Floresan Görüntüleme
Arka Plan
- Mitokondri, hücresel enerji metabolizmasında kritik bir rol oynar.
- Sinir liflerindeki mitokondriyal işlevin anlaşılması, nörolojik hastalıklara dair içgörüler sağlayabilir.
- Floresan immünohistokimya, hücresel yapıları görselleştirmek için önemli bir tekniktir.
- Bu yöntem, sağlıklı ve patolojik mitokondriyal davranış arasında ayrım yapabilir.
Çalışmanın Amacı
- Epidermiste sinir-spesifik mitokondriyi görselleştirmek.
- Sağlıklı bireyler ve nörolojik komplikasyonları olan hastalar arasında mitokondriyal özellikleri karşılaştırmak.
- Hücre fonksiyonunda mitokondriyal rollerin anlaşılmasını artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Deri biyopsilerinin floresan immünohistokimya boyaması.
- Veri analizi için üç boyutlu görüntüleme teknikleri.
- Karmaşık floresan arka planlardan belirli mitokondriyal sinyallerin izole edilmesi.
- Mitokondri dağılımı ve özelliklerinin kantitatif analizi.
Ana Sonuçlar
- Epidermal numunelerde sinir-spesifik mitokondrilerin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Sağlıklı ve etkilenen bireyler arasında mitokondriyal özelliklerdeki farklılıkların belirlenmesi.
- Belirli sinyallerin izole edilmesinde 3B görüntülemenin etkinliğinin gösterilmesi.
- Nörolojik sağlık ve hastalıktaki mitokondri rollerine dair içgörüler.
Sonuçlar
- Bu protokol, sinir liflerindeki mitokondriyal işlevi incelemek için değerli bir araç sağlar.
- Belirli sinyallerin izole edilme kabiliyeti, karmaşık biyolojik sistemlerin anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecekteki araştırmalar, bu bulgulara dayanarak nörolojik tedavi hedeflerini keşfetmek için ilerleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise isolation and quantification of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers, addressing a critical need in neurology research to de-risk target validation by providing disease-relevant, quantitative mitochondrial phenotypes. The method supports mechanistic de-risking in preclinical models by allowing direct comparison of mitochondrial characteristics between healthy and neurologically affected tissues, thereby improving predictive confidence in target selection for neurodegenerative disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating nerve-specific mitochondrial signals from complex epidermal backgrounds, clarifying pathway involvement in mitochondrial dysfunction.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible workflow for functional target validation using disease-altered mitochondrial morphology as a biomarker.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying mitochondrial size frequency distributions, enabling objective assessment of target engagement and biological de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based readouts (e.g., mitochondrial volume, surface data) suitable for high-content screening platforms assessing compound effects on nerve-specific mitochondria.
- Reproducibility: Defines consistent parameters for staining, acquisition, and analysis, ensuring assay standardization across laboratories and timepoints for reliable compound evaluation.
- Scalability: The 3D imaging and analysis pipeline can be adapted to multi-well formats, supporting scalable screening of therapeutic candidates in disease-relevant human tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly examines mitochondria in human sensory nerve fibers, providing a translationally accurate model for neuropathy and other mitochondrial-based neurologic diseases.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal assessment of mitochondrial alterations in the same tissue system used for target identification.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by linking mitochondrial phenotypes to neurological complications, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically enabling mechanistic de-risking of mitochondrial targets in neurodegenerative disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating nerve-specific mitochondria to clarify their role in axonal integrity and energy metabolism in sensory neurons.
- Screening: Delivers quantitative, standardized outputs (e.g., mitochondrial size frequency histograms) that allow comparison of compound-treated versus control conditions in human tissue.
- Analytics: Generates 3D surface data and threshold-based measurements that enable statistical analysis of mitochondrial distribution and morphology across experimental groups.
- Translational Research: Uses human skin biopsies to maintain disease relevance, ensuring findings are directly applicable to human neuropathy pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability for studying mitochondrial dynamics in various nerve fiber types across multiple neurodegenerative indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial involvement in nerve fiber degeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining, imaging, and analysis parameters, minimizing inter-user variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of mitochondrial targets, reducing investment in targets with poor biological validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative mitochondrial phenotypes that inform advancement decisions in neurology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence immunohistochemistry and confocal microscopy for proper antibody labeling and signal detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with specific objectives (40X oil immersion) and spectral separation capabilities for green and red fluorophores.
- Necessitates 3D image analysis software capable of deconvolution, surface creation, masking, and threshold-based segmentation.
- Requires consistency in staining, acquisition, and analysis parameters across batches to ensure comparability of mitochondrial measurements.
- Limited to tissue systems where nerve-specific markers (e.g., PGP9.5) and mitochondrial markers (e.g., PDH) can be effectively labeled and distinguished from background signals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 1
9:39
Conclusion
8:41
Results: Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers
2:27
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 2
3:21
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 3
4:22
Confocal Imaging
6:00
Image Processing
7:03
Isolation of Nerve-specific Mitochondrial Signal
