Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, atomik kuvvet mikroskobu mikro girintisi kullanarak taze aynalama akciğer dokusunun lokal elastik özelliklerini doğrudan ölçerek, akciğer parankiminin lokal mekanik ortamını yerleşik hücrelerle ilgili uzamsal bir ölçekte karakterize etmektir. Bu, agarro şişirilmiş fare akciğer dokusunun, beş ila beş milimetre uzunluğunda ve genişliğinde ve 400 mikrometre kalınlığında akciğer parankim şeritleri hazırlamak için bir jilet veya neşter bıçağı ile kesilmesiyle elde edilir. Sonraki sabitlenmemiş un perme akciğer dokusu şeritleri, bir FM mikro girintisi için ilgi alanlarını tanımlayan immün boyadır.

Daha sonra oda sıcaklığında PBS'deki doku şeritleri üzerinde bir FM mikro girinti yapılır. Taze akciğer dokusunun lokal elastik özelliklerini doğrudan ölçmek için sonuçlar elde edilir. Bu, normal ve fibrotik akciğer parankiminde doku sertliğinin aralığı ve dağılımında çarpıcı farklılıklar ve özellikle fibrotik akciğer numunesi içinde sertlikte büyük uzamsal farklılıklar gösterir.

Bir FM mikro girintisi kullanılarak elde edilen zorlanmış yer değiştirme eğrilerinden çıkarılan sertlik haritalarına dayanmaktadır. Bu tekniğin doku şeridi germe gibi mevcut ölçülere göre ana avantajı, doku sertliğindeki mikro ölçekli varyasyon hakkında benzersiz bir bakış açısı sağlayan benzeri görülmemiş bir uzamsal çözünürlük sunmasıdır. Bu ölçüm, sertliğin doku içinde mekansal olarak nasıl değiştiği ve hastalıktaki sertlik değişikliklerinin kapsamı ve mekansal ölçeğinin ne olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Doku yeniden şekillenmesi ile sonuçlanan süreçler: Akciğer dokusu şeritleri hazırlamak için, izole edilmiş fare akciğerlerini şişirerek akciğer yapısını kesim için stabilize ederek başlayın. Vücut ağırlığının kilogramı başına 50 mililitre olan intratrakeal olarak PBS'de hazırlanan ılık,% 2 düşük jel noktalı aros trakeayı bağlar ve şişirilmiş akciğerleri 60 dakika boyunca dört santigrat derecede bir PBS banyosunda soğutur. Aros, akciğer yapısını nazikçe stabilize etmek için hava boşluklarında jelleşecek ve sertleşecektir Bu aralık sırasında, bir jilet veya neşter kullanarak, aros stabilize fare akciğer dokusunu yaklaşık beş x beş milimetre uzunluğunda ve genişliğinde ve 400 mikrometre kalınlığında şeritler halinde kesin.

Daha sonra, büyük hava yollarını ve damarları dışlamak için kalan aroları çıkarmak için şeritleri PBS'de 37 santigrat derecede beş dakika yıkayın. Hava yolları ve büyük damarlar görüntülenecekse, ana gövde bronşlarından uzak subplevral bölgelerden şeritler kesin, FM mikro girinti için ilgi alanlarını izole etmek için akciğer dokusundan ana gövde bronşlarına daha yakın şeritler kesin. Dokuyu yüz kontrast mikroskobu veya immünostain ile görselleştirin ve floresan mikroskobu ile görselleştirin.

Prosedür için lütfen bu protokolün yazılı kısmına bakınız. Bir FM karakterizasyonundan hemen önce, doku şeridinin kapak kayma yüzeyine eşit şekilde yayıldığından emin olarak, kapak fişini yüzer dokunun altından kaldırarak doku şeritlerini poli L lizin kaplı 15 milimetre örtü kızaklarına takın. Gerekirse, şeridi ikinci bir temiz, kaplamasız örtü kızağı ile sandviçleyin ve poli L lizin kaplı örtü kızağına doku bağlanmasına yardımcı olmak için hafif bir basınç uygulayın.

Her mikro girinti deneyi turundan hemen önce üreticinin talimatlarını izleyerek A FM sistemini kalibre edin. Bunun için iki kritik parametre belirleyin. Havadaki termal dalgalanma yöntemini ve foto diyot çıkış sinyalini gerçek konsol sapma mesafesine ölçeklendirmek için kullanılan bir parametre olan konsol sapma hassasiyetini kullanan konsol yay sabiti.

Temiz bir cam kızak üzerinde PBS'de standart bir zorlanmış yer değiştirme eğrisi elde ederek sapma hassasiyetini kalibre edin. Ardından, zorlanmış yer değiştirme eğrisi ölçümünde zorlanmış yer değiştirme eğrisinin eğimini hesaplayın. A FM ucu, uç yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak izlenen konsol delta D ile tek bir konumda numune yüzeyine doğru uzatılır ve geri çekilir delta Z.It metre başına 0.06 newton yay sabitine sahip bir FM probları kullanılarak beş mikrometre çapında bo silikat küresel uçlu bir silikon nitrür üçgen konsol kullanılması önerilir.

100 ila 50.000 paskal arasında değişen şeffaf modüle edilmiş yumuşak malzemeleri mekanik olarak karakterize ettik. Numune kapak fişinin alt yüzeyini kağıt mendille silin, ardından vakumlu gres ile standart bir cam slayta sabitleyin. Cam slaytı A FM numune tablasına monte edin ve dokuyu 500 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ile kaplayın.

Ardından bir FM tarama kafasını numunenin üzerine yerleştirin. Mikroskop s'yi ayarlayınampMikroskobu, A FM ucunu görüş alanının ortasına hizalamak üzere mercek görüntüleme için ayarlamak için. Doku üzerinde bir ilgi alanı seçmek için A FM örnek aşamasını hareket ettirin.

Ardından, dokunun faz kontrast görüntüsünü ve/veya floresan görüntülerini istediğiniz gibi kaydetmek için CCD kamera görüntülemeye geçin. A FM ucunu ile temas edene kadar yavaşça aşağı doğru hareket ettirin.ample doğru. Yumuşak numunelerin bir FM mikro girinti karakterizasyonu, büyük yerel gerinimlerden kaçınmak için küçük girinti derinlikleri gerektirir, bu da büyük gerinimlerden kaçınmak için elastik modül hesaplaması için kullanılan hertz modelini geçersiz kılar, konsol maksimum sapmasını 500 nanometreye ayarlayarak tetikleme modunda girinti gerçekleştirir.

Bu sapma sınırı, maksimum girinti kuvvetini 30 nano Newton'dan daha az olacak şekilde sınırlayacaktır. Girinti hızı, yumuşak numunenin viskoelastik özelliklerinden ziyade elastik özelliklerini keşfetmek için yeterince yavaş olacak şekilde seçilmelidir. İlgilenilen bir alandan tek bir ölçüm için akciğer dokusu için saniyede iki ila 20 mikrometre arasında bir hız aralığı seçin.

A FM probunu ilgilenilen konuma getirin ve standart bir kuvvet yer değiştirme eğrisi toplamak için tek bir girinti gerçekleştirin. Prob sadece Z yönünde hareket edecektir. İlgilenilen bir bölgenin otomatik olarak eşlenmesi için, zorla harita moduna geçin, seçilen alan içindeki tarama boyutunu ve örnekleme noktalarını seçin.

A FM ucu, girinti hareketleri arasındaki numune yüzeyi boyunca RA'lar ve tanımlanmış bir numune ızgarası içindeki her noktada ayrı ayrı zorlanmış yer değiştirme eğrilerini toplar. Saniyede 20 mikrometre girinti hızında 80 mikrometreye 80 mikrometre alanı haritalamak için 16 x 16 örnek ızgarası kullanmanın pratik olduğunu gördük, bu da yaklaşık 10 dakikada tamamlanabilir. Young modülünü hesaplamak için, burada gösterildiği gibi, lee karesinin doğrusal olmayan eğri uydurmasını kullanarak kuvvet yer değiştirme eğrisini hertz küresel girinti modeline uydurun, burada F, K'ye eşittir, alt C çarpı, delta, D, konsolu bükme kuvvetidir.

K alt C, konsol yay sabitidir. R, küre ucu yarıçapı delta, delta Z'ye eşittir eksi delta D, girintidir ve yeni, akciğer dokusu için 0.4'e eşit olan numunelerin poisson oranıdır. Uyumun kalitesini değerlendirmek için, doğrusal olmayan eğri uydurma sırasında SSR değerini veya veriler ile uyum değerleri arasındaki farkın karelerinin toplamını hesaplayın.

Büyük SSR değerlerine sahip bozuk eğrilerden verileri atarak güvenilmez veya yorumlanamayan ölçümleri ortadan kaldırın. İstenirse, elastik modülü veya E'yi şeffaf modüle dönüştürün. G. Kuvvet haritası modunda toplanan uzamsal sertlik modellerini görselleştirmek G.To E ilişkisini kullanmak, örneğin 80 mikrometreye 80 mikrometrelik bir alanı kaplayan 16'ya 16'lık bir ızgarada modül verilerini ve kontur haritalarını çizmek için bir artı yeni zamanların toplamının iki katına eşittir.

Büyük miktarda kuvvet eğrisi verisini işlemek için, kuvvet yer değiştirme eğrilerini otomatik olarak sığdırmak, modüler çıkarmak ve/veya kontur haritalarını veya ELA greftini çizmek için özel bir algoritma yazılabilir. Az önce açıklanan aynı prosedürleri ve parametreleri kullanarak, bu şekil dokuyu düzgün bir şekilde kesip boyadığımı gösterir. Akciğer parankiminin alveolar mikrosu, bazal membran bileşeni için immünofloresan boyama, fiksasyon veya geçirgenlik olmadan laminin ile gözlemlendiği gibi iyi korunur.

Bu paneller, daha önce PBS ile tedavi edilen veya fibrozu indüklemek için bliyo misin ile tedavi edilen farelerden toplanan taze sabitlenmemiş akciğerlerde bulunan kollajen için immünofloresan boyamayı gösterir. Bir FM mikro girintisinden elde edilen numune kuvveti yer değiştirme grafikleri, aynı uygulanan kuvvetle burada gösterilmiştir. A FM ucu, yumuşak bir bölge üzerinde büyük bir girinti oluşturur, bu da mavi ile gösterilen nispeten düz bir kuvvet yer değiştirme eğrisine karşı küçük bir girinti ve kırmızı ile gösterilen daha sert bir bölge için dik bir kuvvet yer değiştirme eğrisi ile sonuçlanır.

Her girintiden sonra temiz kuvvet eğrileri elde etmek için, A FM ucunun numune yüzeyinden tamamen geri çekilmesi ve bir sonraki girintiden önce temastan arındırılması gerekir. Bu temassız durum, ucun konsol sapması olmadan çevrildiği eğrinin düz bölgesine karşılık gelir. Bu şekil, yumuşak numunenin uca yapışması gibi uç numune yüzeyinden tamamen geri çekilmediğinde meydana gelen ve ucun tamamen yumuşak numuneye sıkışması durumunda temas noktasının belirlenmesini imkansız hale getiren, düz bir bölgesi olmayan tipik bir yanlış eğriyi göstermektedir.

Eğri, net bir sapma olmadan, ancak küçük bir gürültü olmadan böyle görünebilir. Bu şekil sertliği gösterir. Zorlanmış yer değiştirme eğrilerinden elde edilen veriler, sertlik ile renk ölçeklerinin ELAs grefti olarak adlandırılan sertlik haritaları olarak uzamsal olarak görüntülendiği durumlarda, normal ve fibrotik akciğer parankimindeki doku sertliğinin aralığı ve dağılımında çarpıcı farklılıklar ve özellikle fibrotik akciğer numunesi içinde sertlikte büyük uzamsal farklılıklar gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, Atomik Kuvvet mikroskobik kopyasını kullanarak taze akciğer dokusunun lokal elastik özelliklerini doğrudan ölçerek akciğer parankiminin lokal mekanik ortamını nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamalısınız.