CRISPR Aracılı Baz Düzenleme Araçları: Hedeflenen Baz İkamesini İndüklemek için Bir Genom Düzenleme Tekniği

CRISPR aracılı genom düzenleme için, bir baz düzenleyici enzimi kodlayan entegre bir BE genine sahip bir haploid hücre hattı olan HAP1-BE3 kültürü ile başlayın. Bu kültüre, insan meme kanseri geni, BRCA1 gibi belirli bir hedef için tasarlanmış CRISPR-Cas9 plazmidi içeren lentiviral vektörler ekleyin.

Lentivirüs partikülü, konak hücre zarı ile birleşerek, sonunda CRISPR-Cas9-BE gen segmentlerini oluşturmak için konak hücre genomuna entegre olan plazmidi serbest bırakır. Bu genler, BRCA1 hedefli bir gRNA, Cas9 endonükleaz ve BE-sitidin deaminaz üretir.

BRCA1 hedefleme gRNA, Cas9 ile birleşen ve kompleksi BRCA1 gen lokusuna yönlendiren bir RNA'dır. Bu genin yakınında, lokus, BE'nin aktif katalitik bölgesine ulaşmak için kararlı bir şekilde kenetlenebileceği ve yukarı doğru hareket edebileceği bir Protospacer Bitişik Motif veya PAM'dir. Burada, BE bir sitidin bazını tanır ve onu üridine dönüştürür.

Bu baz ikame mutasyonu, değiştirilmemiş DNA zincirini kesmek için Cas9 nükleazını tetikler. DNA ipliğinin kırılması, eksik bazı dolduran ve DNA olmayan bir baz olan urasili timine dönüştüren onarım enzimlerini aktive eder. Genel olarak, bu süreçler bir gen varyantı oluşturur.

Şimdi, gen varyantını çoğaltmak için hücreleri fizyolojik koşullar ve alt kültür altında inkübe edin. Genomik DNA'yı çıkarın ve CRISPR aracılı baz düzenleme verimliliğini analiz etmek için dizileyin.

Transfeksiyondan bir gün önce 24 oyuklu plakalarda oyuk başına 5 x 10⁵ HAP1-BE3 hücresi tohumlayın ve transfeksiyon için% 70 ila% 80 birleşmeye ulaşacak şekilde kültürleyin. Üreticinin protokolüne göre, satın alma transfeksiyon reaktiflerini kullanarak BRCA1 hedefleme kılavuzu RNA'larını transfekte edin. BRCA1 hedef bölgelerinde CG'den TA'ya dönüşümü indüklemek için 1 mikrogram BRCA1 hedefleme kılavuzu RNA'ları kullanın. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin ve her 3 ila 4 günde bir alt kültür yapın. Baz düzenleme verimliliklerini analiz etmek için hücre peletlerini transfeksiyondan 3, 10 ve 24 gün sonra hasat edin. Genomik DNA saflaştırma kitini kullanarak genomik DNA'yı çıkarın.