Yüksek Performanslı İnce Tabaka Kromatografisi: Nötrofillerden lipitlerin ön ayrılması ve miktarının belirlenmesi için bir teknik

Yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi, HPTLC, sabit faz olarak ince boyutlu adsorban partiküller kullanarak farklı analitleri ayırmak için gelişmiş bir analitik tekniktir. Bu özellik, verimli paketlemeyi kolaylaştırarak daha iyi ayırma sağlar.

HPTLC kullanarak lipitleri ayırmak için, nötrofillerden elde edilen farklı polaritelere sahip lipitlerin bir karışımını alın. Şimdi, su buharı ve kir izlerini gidermek için plakayı organik bir çözücü içinde önceden dengeleyin, ardından plakanın bozulmasını önlemek için yüksek bir sıcaklıkta etkinleştirin.

Lipid karışımını ve bir standardı, plakanın tabanına yakın ayrı noktalar olarak uygulayın. Plakayı polar bir çözücü ile doyurulmuş bir cam hazneye aktarın - mobil faz. Çözücünün kılcal hareket yoluyla yukarı doğru hareket etmesine izin verin.

Hareket ederken, polar çözücüye olan afiniteleri nedeniyle daha fazla polar lipit çözücü cephesi boyunca göç eder. Tersine, daha az polar lipit silika parçacıkları üzerinde adsorbe edilir ve gecikir. Lipitleri bir ara polarite çözücüsünde, ardından tamamen polar olmayan bir çözücü içinde çalıştırın, bu da daha fazla lipit ayrılmasına neden olur.

Solvent cephesi istenen mesafeye ulaştığında plakayı çıkarın ve kurutun. Plakayı, asitlenmiş bakır sülfat gibi bir boyama reaktifine maruz bırakın ve bu da lipid kömürleşmesine neden olur. Bu, ön lipid tanımlamasına yardımcı olan standart noktalara kıyasla, ayrılmış lipid lekelerini görselleştirmeye yardımcı olur.

Başlamak için, ilgili cam haznede her bir çözeltiden 5 mililitreye kadar doldurun. Her haznedeki çalışma hızını artırmak için herhangi bir filtre kağıdı ekleyin. İlk çalışan çözeltide 20 x 10 santimetre HPTLC silika jel 60 cam plakayı önceden inkübe edin. Çalışan solüsyon plakanın üst kısmına ulaştığında, 110 santigrat derecede 10 dakika kurutun.

Daha önce bir vakum yoğunlaştırıcı ile kurutulduktan sonra elde edilen sıvı peleti, istenen hacimde 1: 1 kloroform / metanol çözeltisi içinde çözün ve çözünmesi için 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ardından, istenen sayıda numune ve en az bir standart için yükleme noktalarını işaretlemek için bir cetvel ve yumuşak bir kalem kullanın. Koşu mesafesini ilk koşu çözümü için yaklaşık 4 santimetre ve ikinci koşu çözümü için yaklaşık 6 santimetre olarak işaretleyin.

Numuneleri yüklemek için, her yeni numuneyi yüklemeden önce 10 mikrolitrelik şırıngayı 1:1 kloroform/metanol içinde üç kez yıkayın. Her numuneden 10 mikrolitreyi damla damla yükleyin ve numuneyi mümkün olduğunca küçük bir alana konsantre etmeye çalışın. Plakayı, çalışan çözelti #1 ile ilk hazneye dikey olarak yerleştirin. Düzgün bir migrasyon hızı elde etmek için plakanın cam haznenin duvarına paralel olduğundan emin olun.

Plakalar birlikte cam odaların arka duvarına paralel olarak yerleştirilir ve çözücü cepheleri, lipitlerin verimli bir şekilde ayrılmasını sağlamak için çok uzağa gitmez.

Çözücü hattı ilk işarete ulaştığında, plakayı çıkarın, kurutun ve ikinci çözeltiye yerleştirin. İkinci ve üçüncü çalışan çözümler için benzer adımları yineleyin. Çözücü cephesi plakanın üst kısmına ulaşana kadar plakayı çözelti içinde bırakın. Ardından plakayı çıkarın ve oda sıcaklığında bir dakika kurutun.

Plakayı yedi saniye boyunca bakır sülfat çözeltisine yerleştirin. Plakayı iyice kuruduktan sonra 170 derecelik fırında yedi dakika pişirin. Plakayı fırından çıkarın ve soğumaya bırakın.