Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Aktin monomerleri, mikrofilamentler adı verilen ince lifler oluşturmak için baştan kuyruğa polimerize olur. Benzer şekilde, tübülin dimerleri daha uzun içi boş silindirik mikrotübüller halinde polimerize olur. Bu hücre iskeleti bileşenleri hücre şeklini korur ve hücresel hareketliliği kolaylaştırır.

Toplam iç yansıma mikroskobu, TIRF ile aktin-mikrotübül eşleşme dinamiklerini görselleştirmek için özelleştirilmiş bir görüntüleme düzeneği alın.

Görüntüleme düzeneği iki lamelden oluşur: bir üst m-PEG silan kaplı lamel ve bir alt biotin-PEG silan kaplı lamel . İki lamel çift taraflı yapışkan bantla uzunlamasına aralıklandırılır ve bir akış kanalı oluşturmak için her iki uçta sızdırmaz hale getirilir.

Hazneyi doldurmak için BSA'yı akış kanalına pipetleyin. Streptavidin çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. Streptavidin molekülleri, alt lamellerin PEG-silanına bağlı biyotin moleküllerine bağlanır.

TIRF tamponunu kanala akıtın. Etiketlenmemiş, biyotin etiketli ve mor florofor etiketli aktin monomerleri ile birlikte etiketlenmemiş ve yeşil florofor etiketli tübülin dimerleri içeren bir hücre iskeleti karışımı çözeltisi ekleyin.

Daha sonra, ATP - aktin polimerizasyonunu teşvik edici ajan ve GTP - tübülin polimerizasyonunu teşvik edici ajan ve aktin-mikrotübül birleştirme proteini içeren bir reaksiyon çözeltisi ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Tübülin dimerleri GTP moleküllerine bağlanır ve polimerize olurken, aktin monomerleri ATP moleküllerine bağlanır ve sırasıyla mikrotübüller ve mikrofilamentler oluşturmak üzere polimerize olur.

Görüntüleme düzeneğini bir TIRF mikroskobu altına yerleştirin. Floroforları uygun dalga boylarındaki lazerlerle uyarın.

Uyarma ışığı dahili olarak yansır ve farklı kırılma indekslerine sahip iki ortamın bulunduğu cam-su arayüzünün yakınında sınırlı bir bölgedeki floroforları seçici olarak aydınlatan bir ışık alanı oluşturur. Bu bölgede, mikrofilamentler mor görünür ve mikrotübüller yeşil görünür.

24 milimetre uzunluğunda 12 şerit çift sırtlı, çift taraflı bant kesin. Bant desteğinin bir tarafını çıkarın ve temiz bir görüntüleme odasında bulunan altı oluğun yanındaki bant parçalarını sabitleyin. Bandın yapışkan tarafını her bir hazne oluğu boyunca ortaya çıkarmak için ikinci bant desteğini çıkarın ve hazneyi, bant tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin.

Epoksi reçine ve sertleştirici solüsyonlarını küçük bir kantarda bire bir karıştırın ve her görüntüleme odası oluğunun ucundaki bant şeritleri arasına bir damla karışık epoksi yerleştirmek için bir P1000 ucu kullanın. Ardından, hazne bandını veya epoksi tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin.

Kaplanmış bir lameli 70 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve lamellerin kaplanmış ve kaplanmamış yüzeylerini altı kez çift damıtılmış su ile durulayın. Filtrelenmiş nitrojen gazı ile kurulayın ve ardından lamel kaplama tarafı banda bakacak şekilde görüntüleme odasına yapıştırın.

Bant ile lamel arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak için bant-cam arayüzüne baskı uygulamak için bir P200 veya P1000 pipet ucu kullanın. Epoksinin kullanmadan önce oda duvarlarını tamamen kapatmasını sağlamak için monte edilmiş odaları oda sıcaklığında en az beş ila 10 dakika inkübe edin.

Perfüzyon odaları, montajdan sonraki 12 ila 18 saat içinde sona erer. Bir perfüzyon pompası kullanın ve görüntüleme odasını doldurmak için 50 mikrolitre %1 BSA akıtarak perfüzyon odasında koşullandırma solüsyonlarını sırayla değiştirin.

Luer-lock bağlantı rezervuarındaki fazla tamponu çıkarın. Daha sonra, mililitre streptavidin başına 50 mikrolitre 0.005 miligram akar ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika inkübe edilir. Fazla tamponu rezervuardan çıkarın.

Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için 50 mikrolitre% 1 BSA akışı yapın ve 10 ila 30 saniye inkübe edin. Fazla tamponu rezervuardan çıkarın. Daha sonra, 50 mikrolitre ılık 1x TIRF tamponu ve ardından 1x TIRF tamponunda seyreltilmiş 50 mikrolitre stabilize ve% 50 biyotinile mikrotübül tohumu akıtın.

İlk biyokimyasal reaksiyonu görüntülemeden önce sahneyi veya objektif ısıtıcı cihazı 30 dakika boyunca 35 ila 37 santigrat derece sıcaklığı koruyacak şekilde ayarlayın. Ardından, alım aralığını 15 ila 20 dakika boyunca her beş saniyede bir olarak ayarlayın. Ardından, aktin filament düzeneğini başlatmak için polimerizasyon reaksiyonunu ayarlayarak 488 ve 647 lazer maruziyetlerini %5 ila %10 güçte 50 ila 100 milisaniyeye ayarlayın.

Görüntüleri 647 nanometrede elde edin ve uygun ayarlamaları yapın. Ardından, mikrotübül düzeneğini başlatmak için polimerizasyon reaksiyonunu ikinci bir koşullu perfüzyon kuyusunda ayarlayın. 488 nanometrede görselleştirin ve uygun ayarlamaları yapın.

Kullanmadan en fazla 15 dakika önce, üç mikrolitre 10 mikromolar 488-tübülini, 7.2 mikrolitrelik 100 mikromolar floresan etiketsiz tübül alikotu ile birleştirin. Daha sonra, üç mikrolitre seyreltilmiş biyotinile aktini, uygun hacimlerde floresan olarak etiketlenmemiş ve etiketlenmiş aktin içinde birleştirin, böylece nihai karışım %10 ila %30 floresan etiketli 12.5 mikromolar toplam aktin olacaktır.

Görüntülemeden en fazla 15 dakika önce, 12.5 mikromolar aktin karışım stoğunun iki mikrolitresini tübülin stok karışımı ile birleştirerek hücre iskeleti karışımını hazırlayın. Kullanana kadar buz üzerinde saklayın.

2x TIRF tamponu, ağartıcı önleyici, nükleotidler, tamponlar ve yardımcı proteinler dahil olmak üzere diğer tüm deneysel bileşenleri ve proteinleri birleştirerek protein reaksiyon karışımını hazırlayın. Hücre iskeleti karışımını protein reaksiyon karışımında ayrı ayrı, 37 santigrat derecede 30 ila 60 saniye inkübe edin.

Reaksiyonu başlatmak için, protein reaksiyon karışımının içeriğini hücre iskeleti karışımına ekleyin ve karıştırın. 15 mikromolar serbest tübülin, bir milimolar GTP, 0.5 mikromolar aktin monomeri ve uygun hacimlerde tampon kontrolleri ile desteklenmiş 1x TIRF tamponu içeren reaksiyon karışımının 50 mikrolitresini perfüzyon odasına akıtın.

Mikroskop yazılımı kullanarak her beş saniyede bir, 15 ila 20 dakika boyunca hızlandırılmış bir video kaydedin. Yeni bir perfüzyonu iyi bir şekilde şartlandırın ve tampon hacmini, ilgilenilen düzenleyici protein ve tampon kontrolleri ile değiştirin. Ortaya çıkan aktin mikrotübül fonksiyonları için düzenleyici proteinleri değerlendirmek.