Name: Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Öğrenin, TIRF mikroskobu ile hücre duvarlı mikroorganizmalarda korteks protein dinamiklerini yüksek çözünürlükle görselleştirmeyi. Bu yöntem, hücre biyolojisi araştırmalarında protein lokalizasyonunu incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Max Planck toplum tarafından finanse edildi.

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

TIRF mikroskopi görüntü periferik proteinleri tercih edilen tekniktir. Yiten alan düşük penetrasyon derinliği gürültü oranı çok iyi bir sinyal yol açar ve yüksek kare hızları, ya da çok zayıf ifade proteinlerin görüntüleme ile veri toplama sağlar odaklanma ışık, dışı en aza indirir. Yüksek kontrast ve yüksek kare oranı ile TIRF mikroskopi kortikal lokalize proteinlerin görüntüleme uzay-zamansal dinamiği için mükemmel bir araçtır. İlginçtir bir çok mikroorganizma çevreleyen kalın hücre duvarı TIRF periferik proteinler gö...

<table border="1"><tbody><tr><td> Aracı / reaktif Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Orbital Çalkalayıcı </td><td> Araç </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D YÖNLÜ SHAKER </td></tr><tr><td> TIRF mikroskop </td><td> Kadar </td><td></td><td> Özelleştirilmiş kurulum </td></tr><tr><td> Cam kabı </td><td> Araç </td><td> VITLAB </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Seramik boyama raf </td><td> Araç </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalin A </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Lameller # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Mikroskop Slaytlar </td><td> Mikroskop </td><td> Menzel Glazer </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Immersion Yağı </td><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Imersol 518F </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

mikroorganizmalarda cortex organizasyon ve dinamiği görselleştirme, toplam İç yansıma floresan mikroskobu kullanılarak

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF mikroskopi in vitro floresan moleküllerin uzay-zamansal dinamiklerini incelemek için güçlü bir görüntüleme teknolojisi olarak ve hücrelerin 1 canlı ortaya çıkmıştır. Hafif karakteristik bir kritik açı (yani yakın sınır paralel olmaya) daha büyük bir açıyla düşük kırılma endeksi ile orta içine yüksek refraktif indeksi ile orta geçerken toplam iç yansıma optik olayı oluşur. Tüm ışık bu koşullar altında geri yansıtılmasına karşın, bir fani dalga oluşturulduğunu genelinde ve mesafe ile katlanarak bozunmaları ve sadece arayüz 2 civarındaki 100-200 nm örnek alanlar nüfuz sınır boyunca yayılır. Üstün aksiyal çözünürlük sağlamasının yanı sıra, odak florofor dışı düşük uyarılma gürültü oranı çok yüksek bir sinyal oluşturur ve 2,3 photobleaching zararlı etkilerini en aza indirir. Geniş açılı bir tekniği olan TIRF da daha hızlı görüntü ac veriyortemelli konfokal kurulumları tarama çoğundan daha quisition. İlk bakışta, TIRF düşük penetrasyon derinliği genellikle kalın hücre duvarları ile çevrilidir bakteriyel ve mantar hücreleri, görüntüleme ile uyumlu görünmektedir. Aksine, maya ve bakteriyel hücre hücre duvarları aslında TIRF kullanışlılığını iyileştirmek ve gözlemlenebilir yapılar 4-8 aralığında artış olduğunu bulduk. Pek çok hücresel süreçleri bu nedenle doğrudan çoğu zaman güçlü genetik manipulasyon teknikleri sunan küçük, tek hücreli mikroorganizmalar, içinde TIRF tarafından erişilebilir. Bu bize protein etkileşimleri ve faaliyetlerin kinetiği doğrudan canlı hücreler içerisinde değerlendirilebilir vivo biyokimya deneyler, içinde gerçekleştirmenizi sağlar. Biz burada Saccharomyces cerevisiae veya Bacillus subtilis hücreleri için yüksek kaliteli TIRF görüntüler elde etmek için gerekli adımları tek tek açıklayın. Biz Affe çeşitli sorunlara işaretct TIRF hücrelerinde floresan probların görselleştirme ve çeşitli uygulama örnekleri ile işlem göstermektedir. Son olarak, TIRF görüntüleri daha köklü görüntü restorasyon teknikleri kullanılarak artırılabilir nasıl gösterilmektedir.

Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF mikroskobisi, floresan moleküllerin in vitro ve canlı hücrelerdeki uzaysal-zamansal dinamiklerini incelemek için güçlü bir görüntüleme teknolojisi olarak ortaya çıkmıştır1. ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre duvarına sahip mikroorganizmaların yüksek kaliteli, toplam internal yansımalı, floresan veya TIRF görüntülerini elde etmektir. Bu işlem, öncelikle lamellerin ve hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise optimal görüntü kalitesi için mikroskop düzeneğinin hassas bir şekilde hizalanmasıdır.Ardından, görüntülerin veya videoların alınması için uygun olaylar, açılar ve görüntüleme koşulları seçilir. Son adım, elde edilen görüntülerin görüntüleme sonrası işlemesidir. Nihayetinde, turf mikroskobisi hücre korteksindeki protein lokalizasyonunun dinamiklerini incelemek için kullanılır.Bu tekniğin konvansiyonel veya konfokal mikroskopi gibi geleneksel metal mikroskopi yöntemlerine karşı temel avantajı, görüntü kontrastının çok yüksek olmasıyla hızlı çekim sürelerine ve düşük ışığa olanak tanımasıdır. Bu haliyle söz konusu yöntem, lateral protein ayrışmasının mekanizmaları veya membran proteinlerinin mobilitesi gibi membran araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. TIRF mikroskopi için kullanılan lameller, kullanımdan önce toz partiküllerinden arındırılmalıdır.Turf, kirli bir lam örtüsündeki tozdan kaynaklanan

visualization-cortex-organization-dynamics-microorganisms-using-total

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları...

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, kortikal nöronlardaki ekzositik olayları görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu göstermektedir. pH'a duyarlı bir yeşil floresan protein (GFP) markörü, vezikül füzyonu üzerine floresan yapar ve zaman atlamalı görüntülemede membran-proksimal ekzositozu yakalayan seçici TIRF...

Ekzositik olayların görselleştirilmesi için toplam iç yansıma floresan mikroskobu 

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Öğrenin, TIRF mikroskobu ile hücre duvarlı mikroorganizmalarda korteks protein dinamiklerini yüksek çözünürlükle görselleştirmeyi. Bu yöntem, hücre biyolojisi araştırmalarında protein lokalizasyonunu incelemek için değerlidir.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Daha fazla video keşfet