Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, hücre duvarı taşıyan mikroorganizmaların yüksek kaliteli, toplam iç yansıma, floresan veya çim görüntülerini elde etmektir. Bu, önce kapak fişleri ve hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, optimum görüntü kalitesi için mikroskop kurulumunu hassas bir şekilde hizalamaktır.

Ardından, görüntülerin veya filmlerin elde edilmesi için doğru olaylar, açılar ve görüntüleme koşulları seçilir. Son adım, elde edilen görüntülerin görüntüleme sonrası işlenmesidir. Sonuç olarak, hücre korteksindeki protein lokalizasyonunun dinamiklerini incelemek için çim mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin mikroskopi için konvansiyonel veya konfokal gibi metalleri aşmaya göre ana avantajı, görüntü kontrastı int mikroskopi çok yüksektir, hızlı sürelere ve düşük ışığa izin verir. Bu nedenle, bu yöntem, yanal protein ayrışma mekanizmaları veya zar proteinlerinin hareketliliği gibi zar araştırması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çim mikroskobu için lameller kullanımdan önce toz parçacıklarından temizlenmelidir.

Çim, kirli bir örtü kızağı üzerindeki tozdan kaynaklanan arka plan sinyallerine karşı hassas olduğundan. Kapak fişlerini temizleme prosedürüne başlamak için daha az arka plana sahip temizlenmiş bir kapak fişi gereklidir. Kapak fişlerini kapaklı seramik bir tutucuya yerleştirmek için forseps kullanın.

Ardından, bir cam kabı bir molar sodyum hidroksit ile doldurun. Bu sodyum hidroksit birden çok kez yeniden kullanılabilir. Kapak fişlerini içeren seramik tutucuyu sodyum hidroksit içine yerleştirin ve kapak fişlerini yavaş sürekli dönüş altında iki saat inkübe edin.

Sekiz saatten fazla inkübe etmeyin, çünkü bu iki saat sonra opak kapak fişleri oluşturacaktır, kapak fişlerini yavaş sürekli rotasyon altında her seferinde beş dakika boyunca iki kez damıtılmış suyla yıkayın, temizlenmiş kapak fişlerini %100 etanol kaplı seramik tutucuda saklayın. Çim mikroskobu için basil hazırlamak için, en ince hücreler, beş mililitre uygun büyüme ortamında 0.01 ila 0.05 arasında bir OD 600'e seyreltin ve üstel faza kadar büyür. Sentetik ortamda% 1.25 aros hazırlayın, aros tozunu 1.5 mililitrelik bir plastik tüpte 95 santigrat derecede çözün ve ardından 72 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda saklayın.

Bir slaytın ortasına küçük bir damla aros ekleyin ve ikinci bir slaytla, en az iki dakika sonra aroları düz bir pedin içine bastırın, slaytları dikkatlice ayırın. 500 mikrolitre basil en ince hücresini bir dakika boyunca 12.000 RPM'de bir mikro santrifüjde döndürün. Süpernatanı atın ve peleti 50 mikrolitrelik ortamda yeniden süspanse edin.

Aros pedinin ortasına iki ila dört mikrolitre hücre ekleyin. Ardından, etanol dolu kaptan temizlenmiş bir kapak fişini çıkarmak için forseps kullanın ve basınçlı hava ile kurulayın. Kapak fişini numunenin üzerine dikkatlice yerleştirin.

Mikroskopiden önce hücrelerin en az iki dakika oturmasına izin verin. Uzun süreli görüntüleme için, kapak kaymasının kenarlarını ısıtılmış Vazelin, lanolin ve parafin karışımı veya Val uygulaması ile kapatın. Saccharomyces visi hücrelerini çim mikroskobu için hazırlamak için, bir ön kültürü seyreltin ve en az beş saat boyunca uygun ortamda büyütün.

Üstel faza geçmek için, etanol dolu kaptan bir kapak fişi alın ve bir pipet yayılımı ile basınçlı hava ile kurulayın. Beş mikrolitre, konvel ve kapakta bir veya con bir çözelti. Basınçlı hava ile kayın ve kurulayın, con A, maya hücre duvarındaki karbonhidratlara bağlanır ve maya hücrelerini hareketsiz hale getirir.

Daha sonra, 4.5 mikrolitre bir maya hücresi süspansiyonunu, kaplanmış bir kapak kayması, con'un bir tarafına aktarın. Kapak kayması, numune örneğini aşağı bakacak şekilde, bir kenardan başlayarak ve yavaşça damlamaya bırakarak bir mikroskop lamına dikkatlice yerleştirin. Bu, hava kabarcıklarının oluşumunu önleyecektir.

Mikroskopiden önce hücrelerin en az iki dakika oturmasına izin verin, uzun süreli görüntüleme için kapak kaymasının kenarlarını val uygulaması ile kapatın. Bu videoda gösterilen tüm deneyler, Olympus 100 x 1.45 NA objektife sahip tam otomatik bir IMEX standına dayalı özelleştirilmiş bir çim kurulumunda gerçekleştirilmiştir. Kullanılan ışık kaynakları 75 miliwatt diyot, 488 nanometre ve 561 nanometrede pompalanan katı hal veya DPSS lazerlerdir.

Çim açıları ve floresan. Foto ağartma veya frat pozisyonundan sonraki toparlanma, iki galvanometre ile anında ayarlanabilir. Epi, floresan, frap ve çim arasında geçiş yapmak için üçüncü bir galvanometre kullanılır.

Doğrudan canlı çekim yazılımından kontrol edilen galvanometreler, çim görüntülerinde izlenen nesneler için lokalizasyon kinetiğinin basit bir şekilde ölçülmesine olanak tanır ve bir EM CCD kamera ve kamera önünde iki x büyütme lensi ile toplanır. Satın alma, canlı satın alma yazılımı tarafından da kontrol edilir. Lazerle çalışmaya başlamadan önce, lazer koruyucu gözlüklerini takın, lazeri çim modunda tavana yansıtın ve sıfır derece konumunu lazer düz bir çizgide olacak şekilde kalibre edin.

Objektif ile, optimum ayarlamadan sonra lazer noktasını minimum boyuta odaklayın, lazer profili kabaca yuvarlak bir şekle sahip iyi tanımlanmış bir nokta oluşturmalıdır. Her seanstan önce kalibrasyon yapın. Optimum görüntü kalitesi elde etmek için, çim mikroskobunun hizalanması bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir.

Görüntü elde etmek için doğru insidans, açılar ve parametreler, optimum görüntü kalitesi için dikkatli bir şekilde ayarlanmalıdır. Görüntü alımına başlamak için, parlak alan aydınlatması kullanarak hücrelerin konumunu belirleyin. Kırmızı LED'ler, önemli fotoğraf hasarına neden olmadıkları için özellikle iyidir.

Lazer aydınlatmaya geçin ve tercih edilen floroforları uyarmak için uygun lazerleri ve filtre kombinasyonlarını seçin, çim açısının kritik düzeyde olduğundan emin olun. Aksi takdirde, GFP füzyon proteinlerinden kaynaklanan sinyaller tespit edilmeyecektir. Hücrenin üst kısmını, hücrenin kapak fişine bakan tarafını bulun.

Sinyaller kaybolana kadar lazer ışınının geliş açısını kademeli olarak artırın ve ardından hücre yüzeyindeki floresanın yeniden ortaya çıktığı noktaya kadar açıyı yavaşça azaltın. Yüzeyde en uygun konum için Z odağını tekrar ayarlayın. Kabul edilebilir çim açıları, bu maya proteini örneğinde gösterildiği gibi hücrenin kenarında bulanık hale oluşturmaz.

PMA bir GFP, sol üstten sağ alta doğru azalan insidans açılarıyla görüntülendi. Görüntüler, kritik açıda ani bir sinyal kaybı ve yapısal bilgilerde ve sinyal-gürültü oranında aşamalı bir azalma gösterir, dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için lazer yoğunluklarını ve kamera kazancını ayarlar. Tipik olarak, E-M-C-C-D kameralar, yüksek sinyal-gürültü oranlarında çok düşük sinyalleri algılamak için idealdir.

Çim mikroskobu küçük yüksekliğe karşı çok hassastır. Kapak kaymasının farklılıkları, aynı anda görüntülenebilen yalnızca birkaç hücre ile sonuçlanır. Floresan boncukların yoğun bir süspansiyonunun bu görüntüsü, görüş alanının yalnızca bir kısmının odakta olduğu düzensiz bir görüş alanı örneğidir.

Bu nedenle, küçük hücreler için, edinme bölgesi genellikle tercih edilen nesneyi içeren bir alt bölgeye indirgenebilir. Çift renkli çim deneyleri için, R-F-P-G-F-P çiftleri için floroforların sızması en aza indirilmelidir. RFP haftalık olarak 488 nanometre ışıkla uyarıldığı için ayrı emisyon filtreleri kullanın.

Taşmayı önlemek için tipik bir iş akışı ve çift renkli görüntüleme burada gösterilmektedir. Hücreler ayrı filtre setleriyle görüntülendikten sonra, görüntüler birleştirilmeden önce floresan boncuklar kullanılarak aktarılır ve hizalanır Analiz için, görüntü kalitesini etkileyen kritik bir parametre lazer hizalama ve temiz bir objektiftir. Lazeri hizaladıktan ve çim görüntüleme için kullanılan Z konumuna odaklandıktan sonra, numuneyi çıkarın ve tüm yağın objektifini temizleyin.

Artık yağ, lazer ışığının kırınımına ve ışın profilinde beneklere yol açacaktır. Çim mikroskobu, bakteri hücrelerinde aktin homologlarının ve hücre duvarı enzimlerinin dağılımını görselleştirmek için kullanılabilir. Bu temsili sonuçta, aktin çemberi MBL veya transpeptidaz PBPH'nin GFP füzyonlarını eksprese eden basil ince hücreleri, çim ve düzenli epi floresan ile görüntülendi.

Buradaki görüntüler, motile'nin kapladığı alanı belirtmek için bir zaman serisinin ortalama projeksiyonlarını temsil eder. Farklı görüntüleme modlarıyla izlenen MBL yamaları. Bindirme görüntüsündeki mavi anahat, parlak alan görüntüsü görüntüsünden görselleştirilen hücre sınırını belirtir.

Haftalık olarak eksprese edilen transpeptidaz PBPH, epi floresan ile neredeyse hiç görülemeyen kortikal yamalara lokalize olur, ancak çim ile açıkça ayırt edilebilir. Azaltılmış penetrasyon en iyi, epi floresansta çizgiler olarak görünen, ancak çimde noktalar olarak görünen oklarla gösterilen SEPTA'daki P-B-P-H-G-F-P sinyali için gözlemlenebilir. Bu sonraki görüntü seti, Saccharomyces visi'deki bit 61 olan TOR kompleks bileşeninin epi floresansı ve çim aydınlatması arasında bir karşılaştırma göstermektedir.

Bu protein haftalık olarak eksprese edilir ve yama başına sadece birkaç protein kopyası ile küçük kortikal yamalar oluşturur. Epi floresansta, güçlü arka planın üzerinde sadece birkaç yama görünürken, yamalar çimde çok iyi bir sinyal-gürültü oranıyla görüntülenebilir. Gauss veya medyan bulanık görüntülerin çıkarılması gibi çeşitli görüntü işleme adımlarıyla görüntü kontrastında ek iyileştirme elde edilebilirken, yerel arka plan çıkarma gürültüyü ortadan kaldırır ve yüksek yoğunluklu yapıları keskinleştirir.

Bu genellikle ince yapıların kaybı ve yüksek yoğunluklu bölgelerin abartılı amplifikasyonu pahasına gelir. Okla gösterildiği gibi, üstün bir prosedür, ücretsiz veya ticari olarak temin edilebilen yazılım paketleriyle gerçekleştirilebilen 2D dekonvolüsyondur. Dekonvolüsyondan sonra kontrast artışı, değişen ham ve devredilmiş çim görüntülerini gösteren GFP RA'ların bu hızlandırılmış filmi ile gösterilmektedir.

GFP RA'ların ikisi hızlı hareket eden bir protein olduğundan, hızlı edinim sürelerinin çözülmesi önemlidir. Dinamik davranışı. Görüntü işleme, maya proteinlerinin, FET 3G FP'nin ve PMA bir RFP'nin bu hızlandırılmış çift renkli filminde gösterildiği gibi kolokalizasyon analizleri için özellikle önemlidir.

İlk 10 kare ham görüntüleri temsil eder ve kalan kareler devredilmiş görüntülerdir Analizi mümkün kılmak için kontrastı en üst düzeye çıkarmak ve bulanık ham görüntüleri keskinleştirmek çok önemlidir. Çim ve frap, kortikal proteinlerin dinamiklerini incelemek için güçlü bir kombinasyon sunar. Bu tekniğin B'de kullanılması, G-F-P-M-B-L eksprese eden en ince hücreler, MBL içeren yamaların gözlenen motilitesinin mekanizması olarak koşu bandını dışladı.

Hareketli yamanın chm grafiği ve noktalı çizgi ile gösterilen chm grafiği boyunca yoğunluk profili, maya plazma zarının benzer bir şekilde çim frapında gösterilir. Bir TPA'nın PMA'sı, geliştirilmesinden sonra tüm hücre yüzeyini kaplayan ağ benzeri alanlara dağılan maya plazma zarı proteinlerinin yavaş yeniden düzenlenmesini ortaya çıkardı. Bu teknik, BA subtilis'te hücre duvarı sentezi mekanizmasını araştırmak için bakteri hücre biyolojisi alanındaki araştırmaların önünü açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, maya ve bakteri gibi mikroorganizmaların çim görüntülerini nasıl elde edeceğinizi ve bu tekniğin kortikal proteinlerin dinamik özelliklerini incelemede nasıl yardımcı olabileceğini iyi anlamış olmalısınız.