Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, hücre duvarına sahip mikroorganizmaların yüksek kaliteli, toplam internal yansımalı, floresan veya TIRF görüntülerini elde etmektir. Bu işlem, öncelikle lamellerin ve hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise optimal görüntü kalitesi için mikroskop düzeneğinin hassas bir şekilde hizalanmasıdır.

Ardından, görüntülerin veya videoların alınması için uygun olaylar, açılar ve görüntüleme koşulları seçilir. Son adım, elde edilen görüntülerin görüntüleme sonrası işlemesidir. Nihayetinde, turf mikroskobisi hücre korteksindeki protein lokalizasyonunun dinamiklerini incelemek için kullanılır.

Bu tekniğin konvansiyonel veya konfokal mikroskopi gibi geleneksel metal mikroskopi yöntemlerine karşı temel avantajı, görüntü kontrastının çok yüksek olmasıyla hızlı çekim sürelerine ve düşük ışığa olanak tanımasıdır. Bu haliyle söz konusu yöntem, lateral protein ayrışmasının mekanizmaları veya membran proteinlerinin mobilitesi gibi membran araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. TIRF mikroskopi için kullanılan lameller, kullanımdan önce toz partiküllerinden arındırılmalıdır.

Turf, kirli bir lam örtüsündeki tozdan kaynaklanan arka plan sinyallerine karşı hassas olduğundan, lam örtüsü temizleme prosedürüne başlamak için daha az arka plana sahip, temizlenmiş bir lam örtüsü gereklidir. Lam örtülerini kapaklı seramik bir tutucuya yerleştirmek için pens kullanın.

Ardından, cam bir kabı bir molar sodyum hidroksit ile doldurun. Bu sodyum hidroksit birden fazla kez yeniden kullanılabilir. Lamine camları içeren seramik tutucuyu sodyum hidroksitin içine yerleştirin ve lamine camları yavaş ve sürekli rotasyon altında iki saat boyunca inkübe edin.

İki saat sonra kapatma lamlarının opaklaşmasına neden olacağı için sekiz saatten fazla inkübe etmeyin; kapatma lamlarını, yavaş ve sürekli rotasyon altında her seferinde beş dakika olmak üzere iki kez distile su ile yıkayın, temizlenen kapatma lamlarını %100 ethanol ile kaplı seramik tutucuda saklayın. Bacillus subtilis hücrelerini TURF mikroskopisi için hazırlamak üzere, uygun büyüme ortamının beş mililitresinde OD 600 değerini 0,01 ile 0,05 arasına gelecek şekilde seyreltin ve eksponansiyel faza kadar büyütün. Sentetik ortamda %1,25'lik agar hazırlamak için, agar tozunu 1,5 mililitrelik plastik bir tüp içinde 95 °C'de çözün ve ardından 72 °C'deki bir ısıtma bloğunda saklayın.

Bir lamın ortasına küçük bir damla aros ekleyin ve ikinci bir lam yardımıyla, en az iki dakika bekledikten sonra aros'u düz bir tabaka haline gelene kadar bastırın; ardından lamları dikkatlice ayırın. 500 µL bacillus subtlest hücresini bir mikro santrifüjde 12,000 RPM'de bir dakika boyunca çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti 50 µL besiyerinde yeniden süspanse edin.

Aros pedinin merkezine iki ila dört mikrolitre hücre ekleyin. Ardından, bir penset kullanarak etanol dolu kaptan temizlenmiş bir lam kapatı çıkarın ve bunu basınçlı hava ile kurutun. Lam kapatıyı dikkatlice örneğin üzerine yerleştirin.

Mikroskopi öncesinde hücrelerin çökmesi için en az iki dakika bekleyin. Uzun süreli görüntüleme için, lamelin kenarlarını ısıtılmış vazelin, lanolin ve parafin karışımıyla veya Val app ile mühürleyin. Saccharomyces visi hücrelerini turf mikroskopisi için hazırlamak amacıyla, bir ön kültürü seyreltin ve uygun medyada en az beş saat boyunca büyütün.

Eksponansiyel fazda, etanol dolu kaptan bir lamel alın ve bunu pipet yayarak basınçlı hava ile kurulayın. Lamelin üzerine beş mikrolitre, konval ve a veya con a çözeltisi damlatın ve basınçlı hava ile kurulayın. Con A, maya hücre duvarındaki karbonhidratlara bağlanır ve maya hücrelerini immobilize eder.

Ardından, 4,5 µL maya hücresi süspansiyonunu kaplamalı bir lamel olan con'un bir yanına aktarın. Lameli, bir kenarından başlayarak ve damlaların yavaşça inmesine izin vererek, örnek tarafı aşağı bakacak şekilde bir mikroskop lamı üzerine dikkatlice yerleştirin. Bu işlem, hava kabarcığı oluşumunu önleyecektir.

Mikroskopi öncesinde hücrelerin çökelmesi için en az iki dakika bekleyin; uzun süreli görüntüleme için lamın kenarlarını val app ile mühürleyin. Bu videoda gösterilen tüm deneyler, Olympus 100 x 1.45 NA objektifli, tam otomatik bir IMEX standı üzerine kurulu özelleştirilmiş bir düzenekte gerçekleştirilmiştir. Kullanılan ışık kaynakları, 488 nanometre ve 561 nanometre dalga boylarında 75 milliwatt diyot pompalı katı hal veya DPSS lazerlerdir.

Turf açıları ve floresans. Fotoblokaj sonrası toparlanma veya FRAP pozisyonu, iki galvanometre aracılığıyla anlık olarak ayarlanabilir. Üçüncü bir galvanometre ise epi, floresan, FRAP ve turf modları arasında geçiş yapmak için kullanılır.

Canlı görüntüleme yazılımı tarafından doğrudan kontrol edilen galvanometreler, EM CCD kamera ve kamera önündeki iki kat büyütmeli lens ile toplanan çim görüntülerinde izlenen nesnelerin lokalizasyon kinetiğinin basit bir şekilde ölçülmesini sağlar. Görüntüleme işlemi de canlı görüntüleme yazılımı ile kontrol edilir. Lazerle çalışmaya başlamadan önce lazer güvenlik gözlüklerini takın, lazeri çim modunda tavana yansıtın ve lazer düz bir hat oluşturacak şekilde sıfır derece konumunu kalibre edin.

Hedefle birlikte, optimal ayarlamanın ardından lazer noktasını minimum boyuta odaklayın; lazer profili, yaklaşık olarak yuvarlak bir şekle sahip, belirgin bir nokta oluşturmalıdır. Her oturumdan önce kalibrasyon yapın. Optimal görüntü kalitesi elde etmek için, çim mikroskobunun hizalanması bu prosedürün başarısı açısından kritik öneme sahiptir.

Optimal görüntü kalitesi için doğru insidans, açılar ve görüntüleme parametreleri dikkatlice ayarlanmalıdır. Görüntülemeye başlamak için, parlak alan aydınlatmasını kullanarak hücrelerin konumunu belirleyin. Kırmızı LED'ler, önemli ölçüde fotooksidatif hasara yol açmadıkları için özellikle uygundur.

Lazer aydınlatmaya geçin ve seçilen floroforları uyarmak için uygun lazer ve filtre kombinasyonlarını belirleyin; kırılma açısının kritik açının altında olduğundan emin olun. Aksi takdirde, GFP füzyon proteinlerinden gelen sinyaller tespit edilemeyecektir. Hücrenin, lamel camına bakan tarafı olan üst bölümünü bulun.

Lazer ışınının geliş açısını, sinyaller kaybolana kadar kademeli olarak artırın ve ardından hücre yüzeyindeki floresans yeniden görünene kadar açıyı yavaşça azaltın. Yüzeydeki optimal konum için Z odağını tekrar ayarlayın. Maya proteini örneğinde gösterildiği gibi, kabul edilebilir açı değerleri hücre kenarında bulanık bir halo oluşturmaz.

Sol üstten sağ alta doğru azalan geliş açılarıyla görüntülenen PMA one GFP. Görüntüler, kritik açıda ani bir sinyal kaybı ile yapısal bilgide ve sinyal-gürültü oranında kademeli bir azalma göstermektedir; dinamik aralığı maksimize etmek için lazer yoğunluklarını ve kamera kazancını ayarlayın. Genellikle, yüksek sinyal-gürültü oranlarında çok düşük sinyalleri tespit etmek için E-M-C-C-D kameralar optimaldir.

Turf mikroskopisi, küçük yükseklik farklarına karşı çok hassastır. Lamel arasındaki farklar, aynı anda görüntülebilen hücre sayısının sadece birkaç hücreyle sınırlı kalmasına neden olur. Floresan boncukların yoğun bir süspansiyonuna ait olan bu görüntü, görüş alanının yalnızca bir kısmının odakta olduğu düzensiz bir görüş alanı örneğidir.

Bu nedenle, küçük hücreler için görüntüleme alanı genellikle seçilen nesneyi içeren bir alt bölgeye indirgenebilir. Çift renkli turf deneylerinde, RFP-GFP çiftleri için floroforların birbirine karışması (bleed-through) minimize edilmelidir. RFP, 488 nanometre ışık ile zayıf şekilde uyarıldığı için ayrı emisyon filtreleri kullanın.

Sızıntı (bleed-through) ve çift renkli görüntülemeden kaçınmak için tipik bir iş akışı burada gösterilmiştir. Hücreler ayrı filtre setleriyle görüntülendikten sonra, görüntüler birleştirilmeden önce floresan boncuklar kullanılarak geliştirilir ve hizalanır. Analiz için, görüntü kalitesini etkileyen kritik bir parametre lazer hizalaması ve temiz bir objektiftir. Lazeri hizaladıktan ve turf görüntüleme için kullanılan Z pozisyonuna odaklandıktan sonra, örneği çıkarın ve objektifi tüm yağlardan temizleyin.

Kalıntı yağ, lazer ışığının kırınımına ve ışın profilinde beneklenmelere yol açacaktır. Turf mikroskopisi, bakteriyel hücrelerdeki aktin homologlarının ve hücre duvarı enzimlerinin dağılımını görselleştirmek için kullanılabilir. Bu temsili sonuçta, aktin homologu MBL veya transpeptidaz PBPH'nin GFP füzyonlarını eksprese eden bacillus subtles hücreleri, turf ve standart epi floresans ile görüntülenmiştir.

Buradaki görüntüler, farklı görüntüleme modlarıyla izlenen motil MBL yamalarının kapsadığı alanı belirtmek için bir zaman serisinin ortalama projeksiyonlarını temsil etmektedir. Üst üste bindirilmiş görüntüdeki mavi çerçeve, bir aydınlık alan görüntüsünden görselleştirilen hücre sınırını göstermektedir.

Haftalık olarak eksprese edilen transpeptidaz PBPH, epi floresan ile zor seçilen ancak turf ile net bir şekilde ayırt edilebilen kortikal yamalarda lokalize olur. Azalmış penetrasyon, epi floresan ile çizgiler şeklinde, turf ile ise noktalar şeklinde görünen ve oklarda belirtilen SEPTA'lardaki P-B-P-H-G-F-P sinyalinde en iyi şekilde gözlemlenebilir. Bir sonraki görüntü seti, Saccharomyces visi'deki TOR kompleksi bileşeni bit 61'in epi floresan ve turf aydınlatma yöntemleri arasındaki karşılaştırmasını göstermektedir.

Bu protein zayıf şekilde eksprese edilir ve yama başına yalnızca birkaç protein kopyası içeren küçük kortikal yamalar oluşturur. Epi-floresansta, güçlü arka planın üzerinde yalnızca birkaç yama görünürken, turf yönteminde yamalar çok iyi bir sinyal-gürültü oranıyla görüntülenebilmektedir. Görüntü kontrastında ek iyileştirmeler, Gauss veya medyan bulanıklaştırılmış görüntülerin çıkarılması gibi çeşitli görüntü işleme adımları aracılığıyla elde edilebilirken, yerel arka plan çıkarma işlemi gürültüyü giderir ve yüksek yoğunluklu yapıları keskinleştirir.

Bu durum genellikle ince yapıların kaybı ve yüksek yoğunluklu bölgelerin aşırı yükseltilmesi pahasına gerçekleşir. Okun işaret ettiği gibi, ücretsiz veya ticari olarak mevcut yazılım paketleri ile gerçekleştirilebilen 2D dekonvolüsyon daha üstün bir prosedürdür. Dekonvolüsyon sonrası kontrast artışı, ham ve dekonvolüye edilmiş görüntülerin ardışık olarak gösterildiği bu GFP RA'lar iki zaman atlamalı filminde örneklenmiştir.

GFP RAs two hızlı hareket eden bir protein olduğu için, dinamik davranışını çözümlemek adına hızlı görüntüleme süreleri önemlidir. Maya proteinleri FET 3G FP ve PMA one RFP'nin yer aldığı bu zaman ayarlı çift renkli videoda gösterildiği üzere, görüntü işleme özellikle kolokalizasyon analizleri için büyük önem taşır.

İlk 10 kare ham görüntüleri temsil eder ve geri kalan kareler devolvüzyona uğramış görüntülerdir. Analizi mümkün kılmak için, kontrastı maksimize etmek ve bulanık ham görüntüleri netleştirmek kritiktir. Turf ve frap, kortikal proteinlerin dinamiklerini incelemek için güçlü bir kombinasyon sunar. G-F-P-M-B-L eksprese eden B subtlest hücrelerinde bu tekniğin kullanılması, MBL içeren yamaların gözlemlenen motilitesinin mekanizması olarak treadmilling olasılığını elemiştir.

Hareketli yamayı gösteren chm grafiği ve noktalı çizgi ile belirtilen chm grafiği boyunca yoğunluk profili, maya plazma membranının turf frap'ine benzer bir şekilde gösterilmiştir. Bir TPAs PMA one, maya plazma membran proteinlerinin, gelişiminden sonra tüm hücre yüzeyini kaplayan ağ benzeri domenlere dağılarak gerçekleştirdiği yavaş yeniden düzenlenmeleri ortaya koymuştur. Bu teknik, bakteri hücre biyolojisi alanındaki araştırmaların B. subtilis'te hücre duvarı sentez mekanizmasını keşfetmesinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, maya ve bakteri gibi mikroorganizmaların turf görüntülerini nasıl elde edeceğiniz ve bu tekniğin kortikal proteinlerin dinamik özelliklerinin incelenmesine nasıl yardımcı olabileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.