Name: Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T11:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin, mikrotübülleri etiketsiz görüntülemek için girişim yansıma mikroskobisini kullanmayı. Bu yöntem, yüksek kontrastlı ve hızlı görüntüleme sağlayarak hücre biyolojisi araştırmalarında maliyet etkin bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar önemli okuma ve protokol hakkında yorumlar için Anna Luchniak ve Yin-Wei Kuo teşekkür ederiz.

1. mikroskop modifikasyon ve objektif objektif
<ol><li>Uygun bir filtre küpü kullanarak floresan mikroskop filtre tekerleğine bir 50/50 ayna takın (Şekil 1). 50/50 aynası, sıklıkla Anti-yansıma kaplamasına sahip olarak özen yansıtın. Not: Biz mikroskop boş bir filtre küpü bir 50/50 ayna kullandık. 50/50 ayna, dikroik aynanın bulunduğu yere eklenir.</li>
	<li>Yüksek büyütme/yüksek NA yağ amacı kullanın. Not: Bu protokolde, bir 100x/1.3 NA amacı kullandık.</li>
</ol>2. mikrotübülleri yüzeye yapışmasına yönelik oda hazırlığı
<ol><li>Temiz mikroskop slaytlar ve 22 mm x 22 mm kapak (dik mikroskop için) veya 22 mm x 22 mm ve 18 mm x 18 mm kapak (ters mikroskoplar için). Yüzeyi gerektiği gibi değiştirin. Örneğin, bir alkalin deterjan kullanarak coverfları temizleyin ( malzeme tablosunabakın) ve ardından% 100 etanol ile damıtılmış su yıkama ile11arasında ve sonralar.</li>
	<li>3 mm genişliğinde plastik parafin filmi keser (bkz. malzeme tablosu) bir tıraş bıçağı ve bir kenar olarak başka bir mikroskop slayt kullanarak.</li>
	<li>Temiz 22 x 22mm kapak kayma üzerinde 3 mm ayrı iki plastik parafin Film şeritler yerleştirin. Sonra bir kanal oluşturmak için 18 mm x 18 mm lamel magazini yerleştirin. Dikey mikroskop kullanıyorsanız, şeritleri temiz bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirin ve ardından üstüne bir lamel magazini yerleştirin.</li>
	<li>Lamel magazini (veya slayt) bir ısı bloğu üzerinde 100 ° c için 10-30 s için parafin film için mühürlü bir kanal oluşturmak için yerleştirin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak perfüzyon ile 50 μg/mL antikor (Brinkley buffer 1980 (BRB80)) içinde akış. 10 dakika boyunca kulyur. Not: Biz yüzeye Rhodamine etiketli Mikrotubul tohumları bağlamak için anti-Rhodamine antikorları kullanıyoruz. Alternatif olarak, avidin biotin etiketli Mikrotubul tohumları veya biyotinlenmiş altın parçacıklar bağlamak için kullanılabilir. Sadece çözelti içinde tübülin yokluğunda mikrotübüller bakmak için (yani, olmayan bir dinamik tahlil), bir anti-tübülin antikor kullanılabilir.</li>
	<li>BRB80 tampon ile beş kez yıkayın. 0,22 μm filtre kullanılarak çözümlerin filtrelendiği tavsiye edilir.</li>
	<li>Akış içinde 1% Poloksamer 407 (bir triblock kopolimmer) içinde BRB80 özel olmayan bağlama karşı yüzeyi engellemek için. 10 dakika boyunca kulyur.</li>
	<li>BRB80 tampon ile beş kez yıkayın.</li>
	<li>Örnek mikroskop üzerine yerleştirilmeye hazırdır. Numunenin kurumasını önlemek için, kanalın ucunda BRB80 tampon iki damlacıkları ekleyin ve gerektiğinde yenilenir.</li>
</ol>3. mikroskop hizalama
<ol><li>Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. Epi-aydınlatma ışık kaynağını açın.</li>
	<li>Örnek yüzeye odaklanın. Objektif, optik yolun içindeki optik ışığın arka yansımasından dolayı yukarı ve aşağı taşındığında birden fazla yüzeyi gözlemleyecektir. Örnek yüzeyi bulmak için iyi bir yöntem parafin film kenarına odaklanmak için. Yüzey bulunduğunda, görünüm alanını odanın merkezine ayarlayın.</li>
	<li>Alanı diyaframı orta yöne kapatarak ve ayar vidalarını kullanarak görüş alanına Ortala. Bir kez hizalanır, diyaframı yeniden açın. Not: vida ayarı sadece spor, belki de her 3-6 ay veya sorun giderme sırasında yapılması gerekir.</li>
	<li>Hedefe çıkış öğrenci (geri odak düzlem) görüntülemek için Bertrand objektif kaydırın.</li>
	<li>Objektif çıkış öğrenci kenarlarının ötesinde diyafram diyafram (AD) kapatın.</li>
	<li>AD 'yi çıkış öğrenciyle ortalamak için ayar vidalarını kullanın. AD 'yi açarak ve kenarlarını çıkış öğrencilerinden biriyle eşleştirerek çift kontrol edin. Not: Bu ayarlama yalnızca spor yapmak gerekir.</li>
	<li>Objektif NA yaklaşık 2/3 diyafram diyaframı ayarlayın. Diyafram diyaframını optimize etmek için ayrıntılı prosedürler için Bölüm 7 ' ye bakın.</li>
</ol>4. görüntüleme stabilize mikrotübüller veya 40 Nm altın parçacık
Not: stabilize mikrotübüller ve altın nanopartiküller iyi kontrol örnekleri olarak hizmet vermektedir. IRM performansını değerlendirmek ve optimal diyafram diyafram açıklığı (Bölüm 7) ayarlamasına yardımcı olmak için ilk adım olarak görüntü yüzeyine bağlı mikrotübüller veya altın nanopartiküller için tavsiye edilir.
<ol><li>Kameranın pozlama süresini 10 MS 'ye ayarlayın ve aydınlatması kamera dinamik aralığını neredeyse doyurmak için ayarlayın.</li>
	<li>BRB804,12,13 (veya 40 Nm altın partikülleri) içinde 10 μL guanylyl-(Alfa, Beta)-metilen-difosforat (gmpccp)-veya Taxol-stabilize mikrotübüller içinde akış yeni bir örnek ve monitör için bir pipet kullanarak perfüzyon yüzey görüntüleme tarafından bağlayıcı. Bir kez 10-20 mikrotübüller görünüm alanı içinde bağlı, BRB80 ile örnek 2x yıkayın. Not: iyi uyumlu bir mikroskop ile mikrotübüller arka plan çıkarma olmadan görünür olmalıdır.</li>
	<li>10 saniye süreyle 1 saniyelik gecikme süresi (10 MS pozlama) ile bir zaman atlamalı ayarlayarak 10 görüntü kazanın.</li>
	<li>Bir arka plan görüntüsü edinin. Bunu yapmak için, aşama denetleyicisi veya bilgisayar yazılımını kanal uzun eksen boyunca kullanarak sahne alanı hareket ettirirken, gecikme olmadan 100 görüntü alırken (örn. 100 fps 'ye yakın akış, 10 MS pozlama). Not: arka plan 100 görüntülerin medyan olur. Medyan alarak, aydınlatma profili ve diğer sabit özellikleri optik üzerinde kir gibi her şey filtrelenmiş iken korunur. Bu aşama taşınır ve sonuçta arka plan görüntüsünü düşürerek Aksiyel pozisyonda değiştirmek için yol açacaktır gibi örnek üzerinde eğim olmamalıdır. Eğim kaçınılamıyor, daha sonra alternatif bir yöntem tohum akan önce ortalama arka plan görüntüleri elde etmektir.</li>
	<li>Görüntüleri işleme ve analiz etmek için adım 6 ' ya gidin.</li>
</ol>5. görüntüleme Mikrotubul dinamikleri
<ol><li>Beyin tubulin kullanarak Mikrotubul dinamikleri için, numune ısıtıcı sıcaklığını 37 °c ' ye ayarlayın.</li>
	<li>BRB8011 ' de 10 μL gmpccp-stabilize Mikrotubul tohumları ile yeni bir örneğe pipet kullanarak perfüzyon ile akış yapın ve yüzeyi canlı görüntüleyerek yüzeye bağlaması izleyin (yani, akış sırasında). Bir kez 10-20 tohumlar görüş alanı ile bağlı, BRB80 ile 2x Kanal hacmi kullanarak örnek yıkayın (BRB80 37 °C veya oda sıcaklığında en az prewarmed olmalıdır). Not: iyi uyumlu bir mikroskop Ile tohum arka plan çıkarma olmadan görünür olmalıdır.</li>
	<li>Polimerizasyon karışımı akışı (7,5 μM etiketsiz tübülin + 1 mm guanozin trifosfat (GTP) + 1 mm dithiothreitol (DTT) BRB80 buffer). Mikrotubul büyümesini ölçmek için, her 5 saniyede bir görüntü elde etmek için satın alma yazılımını kullanarak bir zaman atlamalı ayarlayın (0,2 saniye başına kare (fps)) 15 dakika.</li>
	<li>Kontrastı geliştirmek için her zaman noktasında 10 görüntü (bir yerine) alın ve bunları ortalama. Mikrotubul küçülme için, 0 ve 10ms bir pozlama süresi (daha yüksek fps kullanılabilir kamera bağlı olarak ilgi küçük bölgeler ile mümkündür) zaman gecikmesi ayarlayarak 100 fps 'de görüntüleri elde.</li>
	<li>Adım 4,4 gibi bir arka plan görüntüsü edinin.</li>
</ol>6. görüntü işleme ve analiz
Not: analiz Için, bu protokol Fiji14 kullanır ama okuyucu o/o uygun bulmak herhangi bir yazılım kullanmak için ücretsizdir.
<ol><li>Kaydedilmiş arka plan görüntülerini açın.</li>
	<li>Görüntü &amp;Gt; Stack &amp;Gt; Z projesi &amp;Gt; Mediankullanarak Median görüntüyü (Yani arka plan) hesaplayın.</li>
	<li>Açık Mikrotubul dinamiği film bir yığın olarak (aynı dinamik olmayan microtubules için) Dosya &gt; kullanarak açın.</li>
	<li>İşlem &amp;Gt; görüntü hesap makinesikullanarak yığından arka plan görüntüsünü çıkarın. "32bit (float) sonucu" seçeneğini kontrol ettiğinizden emin olun.</li>
	<li>Dinamik microtubules için Çizgi aracını kullanarak bir çizgi ilgi microtubül boyunca çizin ve "t" tuşuna basarak faiz Yöneticisi bölgesine ekleyin. Tüm mikrotübüller ilgi için tekrarlayın.</li>
	<li>Dinamik microtubules için Multi-Kymo makroyu çalıştırın (ek dosya 1). Makro, YG yöneticisinde her microtubül için bir video ve bir kymograf oluşturur. Her Mikrotubul benzersiz bir tanımlayıcı alacak.</li>
	<li>Dinamik microtubules için Kymo-analiz makro (Tamamlayıcı dosya 2) çalıştırın ve büyüme hızları ve mikrotubüllerin küçülme oranlarını ölçmek için kendi adımlarını izleyin.</li>
</ol>7. diyafram diyaframı boyutu
Not: IRM kullanarak mikrotübüller yüksek kontrast görüntüleri elde etmek için önemli bir faktör aydınlatma sayısal diyafram (ına) doğru10,15ayarı. Ina , AD (ad) boyutu ile kontrol edilen hedef çıkış öğrencide gelen aydınlatma ışın boyutunu değiştirerek değiştirilebilir (reklam çıkış öğrenci ile bir Konjugat düzleminde bulunur (arka odak düzlem) amacı , Şekil 1): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59520/59520eq1.jpg"> dad diyafram diyaframının çapıdır, famacı , hedefin odak uzaklığı ve dEP , hedefin çıkış öğrenci çapıdır. Genellikle, AD floresan görüntüleme için tamamen açık bırakılır, bu nedenle ına eşittir hedefin na. Floresan Mikroskobu, AD ölçeği çapını göstermez, böylece ına hesaplanamaz. Reklam boyutunu bir amaç yardımıyla kalibre etmek mümkündür. Ancak, AD boyutu en yüksek kontrastı üreten boyuta sabitlenenden beri gerekli değildir.
<ol><li>Yüzeye yapışan floresan etiketli stabilize mikrotübüllerin bir örneğini hazırlayın (4.1-4.2 adımları). Not: Biz mikrotubules etiketli tetrametilrhodamin kullanılan16 (ör: 550 nm, Em: 580 Nm).</li>
	<li>Mikrotübüller, mikrotübüller etiketli değilse, mikro odaklama düğmesi kullanarak odak içine getirmek (mikrotübüller etiketlenmiş değilse, IRM15 veya DIC5ile görüntü).</li>
	<li>Kamera yazılımını kullanarak kamera pozlama 10 MS ayarlayın. Not: Bu pozlama rasgele ve 100 ms bir pozlama de çalışır.</li>
	<li>AD 'yi en küçük açısına kapatın. Işığı neredeyse kameranın dinamik aralığını veya mümkün olan en yüksek seviyede doyurmak için ayarlayın. Not: bir kılavuz olarak, genellikle edinme yazılımı tarafından sağlanan görünüm tablosunu kullanın.</li>
	<li>10 + microtubules içeren bir bakış alanı 10 görüntü (akış veya her saniye bir görüntü alarak) elde.</li>
	<li>Adım 4,4 gibi bir arka plan görüntüsü edinin.</li>
	<li>AD boyutunu değiştirin ve tüm AD açılış aralığı için 7.5-7.6 arasındaki adımları yineleyin (kapalı gelen öğrenci boyutu, Şekil 2). AD boyutu her değiştiğinde, aydınlatma yoğunluğunu 7,4 adım ile eşleşecek şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Alınan her görüş alanı için, işlem &gt; görüntü Hesaplayıcı kullanarak ilgili arka planı çıkarın ve açılır menüden "çıkarma" seçeneğini seçin. "32bit (float) sonucu" seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Ardından, görüntü &gt; yığını &amp;Gt; Z projesini ortalama &gt;kullanarak elde edilen görüntüleri ortalama.</li>
	<li>Mikrotubüllerin ortalama yoğunluğu olarak tanımlanan mikrotubulların sinyal-arka plan gürültü oranını (SBR) ölçüm (mikrotubülün yoğunluğu, arka planın yoğunluğu eksi) arka planda standart sapmaya bölünmüştür ( Şekil 3).</li>
	<li>Her açılış boyutu için mikrotübüllerin ortalama SBR değerini hesaplayarak ve AD boyutunu en yüksek SBR (Şekil 2) üreten birine ayarlamak suretiyle en uygun ad boyutunu (yani optimum ına) belirleyin. Karşılaştırılabilir kontrast üreten bir dizi AD boyutu vardır mümkündür15.</li>
</ol>

<ol><li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li>
<li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy%3A+rate+constants+and+transition+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li>
<li>Hotani, H., Horio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microtubules+visualized+by+darkfield+microscopy%3A+Treadmilling+and+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).</li>
<li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).</li>
<li>Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LED+illumination+for+video-enhanced+DIC+imaging+of+single+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules.</a> J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).</li>
<li>Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+Imaging+of+Microtubules+with+Sub-nm+Precision+Using+Interferometric+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).</li>
<li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+Imaging+and+Bending+Analysis+of+Microtubules+by+ROCS+Microscopy+and+Optical+Trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li>
<li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Imaging+of+Single+Microtubule+Dynamics+Using+Spatial+Light+Interference+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li>
<li>Curtis, A. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+of+Adhesion+of+Cells+to+Glass%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass.</a> The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).</li>
<li>Weber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B2%5D+Reflection+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">[2] Reflection interference contrast microscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).</li>
<li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+-+Microtubule+Dynamics+Reconstituted+In+Vitro+and+Imaged+by+Single-Molecule+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Nitzsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Studying+Kinesin+Motors+by+Optical+3D-Nanometry+in+Gliding+Motility+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays.</a> Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).</li>
<li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li>
<li>Hyman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B39%5D+Preparation+of+modified+tubulins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">[39] Preparation of modified tubulins.</a> Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).</li>
<li>Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Single+Particles+and+Elongated+Filaments+with+Nanometer+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision.</a> Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).</li>
<li>Mahamdeh, M., Schäffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+with+millikelvin+precision+of+temperature-controlled+objectives+and+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution.</a> Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).</li>
<li>Kim, K., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+method+for+reflection+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy.</a> Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).</li>
<li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li>
<li>Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).</li>
<li>Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Reflection+Interference+Contrast+Microscopy+%28RICM%29+in+Soft+Matter+and+Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion.</a> ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.

Bu protokol, Mikrotubul dinamiklerinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için IRM 'nin başarılı bir şekilde kullanımını göstermiştir. Görüntü kontrastı üzerinde en güçlü etkiye sahip olduğu için doğru aydınlatma sayısal diyafram ayarlamak için bakım verilmelidir. Ayrıca, yüksek sayısal diyafram (NA) hedefleri kullanarak yüksek çözünürlük/yüksek kontrast görüntüleri almak için önemlidir, yüksek NA amacı düşük NA hedeflerine kıyasla daha yüksek ışık toplama gücü vardır. Temizleyici yüzey ve çözümler, kir yüzeye iliştirmek kadar düşük gürültü kullanılan ve (deney boyunca) ekleme görüntüleri için gürültü gibi lekeli. Bir arka plan görüntüsü edinme önemli yanı sıra aydınlatma inhomojenler, statik gürültü ve yüzey düzensizlikleri kaldırır.
Önerilen değişiklik, aydınlatma yolundaki uzun geçiş filtresini (> 600 Nm) tanıtmaktır. Beyaz ışık kaynaklarının spektrumları genellikle mikrotubüllere zarar verebilecek UV 'de dalga boylarını içerir. Ayrıca, IRM için uzun dalga uzunluğunun kullanılması, IRM 'i floresan ile birleştirerek (örneğin, Mikrotubul ilişkili proteinlerin (haritalar) Mikrotubul dinamiklerine etkisini inceleyerek) kullanışlı bir şekilde gelir. Zaman harcanan süre için görüntüleme, örnek Drift (özellikle optik eksen boyunca) arka plan düzleminden görüntü düzleminin sapması nedeniyle görüntü kontrastı azalır unutmayın. Modern mikroskoplar genellikle stabilizasyon mekanizmaları (örn. mükemmel odaklama (Nikon), kesin Focus. 2 (Zeiss), ıXON-ZDC2 (Olympus)) ile donatılmıştır. Alternatif bir çözüm termal veya pasif veya aktif18 veya drift19,20,21için düzelterek kurulum stabilize etmektir. Son olarak, Mikrotubul kontrast alan diyafram boyutunu azaltarak artırılabilir (bir 70% açılış iyi bir seçimdir artan kontrast ve görüş boyutu alanı arasında bir denge olduğu gibi)15.
IRM görüntüleme mikrotubülleri için uygun iken tek proteinleri algılamak için yeterince hassas değildir. Bu tür bir uygulama için, ıscat daha uygun bir tekniktir. Benzer şekilde, flüoresan ve ıscat, 10 Nm 'den az hassas izleme gerektiğinde daha uygundur. IRM için ölçülen uzunluk izleme hassasiyeti Şekil 7' de gösterildiği gibi ~ 20 Nm 'dir.
Yüzeyde ıRM kullanımı microtubules ötesinde olabilir; Örneğin, moleküler motorlar altın nanopartikülleri ile etiketlenmiş ve microtubules ile etkileşime girdikleri gibi izleniyor olabilir. Ayrıca yansıtıcı girişim kontrast mikroskopisi olarak bilinen ıRM daha gelişmiş bir formu (RICM)22 olabilir, prensip olarak, daha fazla mikrotubules kontrast geliştirmek ve daha yüksek izleme hassasiyeti elde etmek için kullanılabilir.

Mikrotubüllerin etiketsiz görüntülenmesi, görüntülerde kontrast üretmek için tübülin flüoresan etiketlemesi ihtiyacını atlatmaları gibi ilgi çekici bir şey. Floresan etiketleme çeşitli dezavantajları vardır: Eğer protein konsantrasyonu düşük1 ve photobleaching ve fotodamat izleme süresini sınırlamak mümkün değildir. Video geliştirilmiş diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi (DIC) ve Darkfield mikroskobu2,3,4,5dahil olmak üzere etiket içermeyen microtubules görüntü için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Son zamanlarda, interferometrik saçılma mikroskopisi (ıscat)6, dönen-tutarlı-saçılma mikroskobu (rocs)7 ve uzamsal ışık paraziti MIKROSKOPISI (ince)8de kullanılmıştır. Tüm bu teknikler görüntüleme mikrotübüller yeteneğine sahiptir ve Mikrotubul dinamikleri okumak için değerli olduğunu kanıtladı. Ancak, her biri kendi sınırlamaları vardır. DıC 'de kontrast microtubül ve Nomarski prizma ekseni arasındaki açıya bağlıdır.  Darkfield 'de mikrotubule sinyali, kirler veya yüzeyler kusurlarından kaynaklanan dağınık ışık ile bozulur. Iscat olağanüstü hassasiyet (aşağı tek proteinler) sergiler ve rocs örnek içine derin görüntü mikrotübüller olabilir rağmen, her iki yöntem Teknik olarak talep, lazer tarayıcılar gerektirir.
Bu protokol, mikroskobik yansıma mikroskobu (IRM)9,10 ' u mikrotubüllerin etiketsiz görüntüleme için alternatif bir teknik olarak nasıl ayarlanacağını gösterir. Bir standart floresan mikroskop sadece ucuz 50/50 ayna ilavesi gerektirir gibi ıRM uygulamak kolaydır. Burada açıklanan yazılım ile birlikte kullanıldığında, IRM yüksek kontrast mikrotubule görüntüler üretir, yüksek hızda görüş büyük alanları görüntü, bir tek seferlik hizalama gerektirir ve kolayca floresan görüntüleme gibi diğer teknikler ile kombine edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td>50</td></tr><tr><td>/50 ışın ayırıcı</td><td>Chroma</td><td>21000</td> Satın <td>alırken, mikroskopta kullanılan küpe uygun ayırıcı boyutlarını seçtiğinizden emin olun</td></tr>: <tr><td>NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 İris objektif</td>, <td>Nikon</td><td>MRH02902</td><td>Görüntüleme objektifi. Bu hedef, NA 1.3'e açılan bir NA ayarlama irisine sahiptir.</td></tr><tr><td>Mucasol evrensel deterjan</td><td>Sigma-aAldrich</td><td>Z637181-2L</td><td>Lamelleri ve slaytları temizlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>plastik parafin filmi (ticari adı Parafilm M)</td><td>Sigma-aAldrich</td><td>P7793</td><td>Akış kanalları oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-TAMRA antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A-6397</td><td>TAMRA etiketli molekülleri (örn. mikrotübüller) numune yüzeyine bağlamak için kullanılır. RRID (AB_2536196)</td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (ticari adı Pluronic F-127)</td><td>Sigma-aAldrich</td><td></td><td>Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için kanal yüzeyini bloke etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>40 nm altın nanopartiküller</td><td>Sigma-aAldrich</td><td>753637</td><td>Kontrol numunesi olarak kullanılır</td></tr><tr><td>20 nm altın nanopartiküller</td><td>Sigma-aAldrich</td><td>753610</td><td>Kontrol numunesi olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Zyla 4.2 Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td>2048x2048 piksel (6.5 ve mikro; m piksel boyutu)% 72 kuantum verimliliği ve 16 bit dinamik aralık</td></tr><tr><td>ile Feista izleme yazılımı</td><td></td><td></td><td>https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA</td></tr><tr><td>Evde hazırlanan stabilize mikrotubles</td><td></td><td></td><td>(metindeki referanslara bakın)</td></tr></tbody></table>

microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim reflection microkopi uygulanması

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Yüzeylere yakın saflaştırılmış biyomoleküllerin görselleştirmek için çeşitli yöntemler vardır. Total-iç yansıma floresans (TIRF) mikroskobu yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, ancak moleküllerin aktivitesine engel olabilecek floresan etiketleme gerektirdiği dezavantajı vardır. Ayrıca, photobleaching ve photodam endişeleri vardır. Microtubules durumunda, biz TIRF benzer kalitede görüntüleri girişim yansıma mikroskopisi (ıRM) kullanılarak elde edilebilir bulduk. Bu, IRM 'nin büyük biyomoleküllerin ve oligomerler in vitro dinamiklerini görselleştirmenin genel bir tekniği olabileceğini göstermektedir. Bu yazıda, bir Floresan Mikroskobu sadece ıRM görüntüleri elde etmek için nasıl değiştirildiğini gösteriyoruz. IRM, diferansiyel parazit kontrast mikrokopya veya interferometrik saçılma mikroskobu gibi diğer kontrast tekniklerinden daha kolay ve önemli ölçüde daha ucuzdur. Ayrıca, karanlık alan mikroskobu daha yüzey kusurları ve çözüm kirlikleri daha az duyarlıdır. IRM kullanarak, bu yazıda açıklanan görüntü analiz yazılımı ile birlikte, görüş alanı ve kare hızı sadece kamera tarafından sınırlıdır; bir scmos kamera ve geniş alan aydınlatma Mikrotubul uzunluğu ile ölçülebilir 20 NM ile 10 Hz bant genişliği ile ölçülebilir.

Yukarıda belirtildiği gibi, iyi uyumlu bir mikroskop ile, mikrotübüller arka plan çıkarma olmadan görünür olmalıdır (Şekil 4A). Arka planı çıkarma (Şekil 4b) mikrotubülün kontrastını geliştirir (Şekil 4c). Kontrastı daha da geliştirmek için, ortalama veya Fourier filtreleme veya her ikisinin bir kombinasyonu kullanılabilir (Şekil 4d, F, E). Şekil 4g 'de çizgi taramaları görüntü kalitesinin artımlı gelişimini gösterir. Her işlem adımıyla arka plan gürültüsünün azalmasına dikkat edin.
Zaman atlamalı filmlerden oluşturulan Mikrotubul dinamiklerinin kymograf örnekleri Şekil 5' te gösterilir. Videolar iki kare oranlarında elde edildi: 0,2 fps (yavaş) ve 100 fps (hızlı). Önceki büyüme hızını ölçmek için uygundur, ikincisi daha hızlı büyüme oranından daha büyüklüğü bir sırası olan küçülme hızını ölçmek için uygundur.
Mikroskop kurmak için altın nanopartiküller kullanıldığı durumda Şekil 6' da örnek bir görüntü gösterilir. Altın nanopartiküller pasif olarak yüzeye takılmış. 40 Nm partikülleri tavsiye edilirken, 20 Nm parçacıkların yansımasına karşın daha düşük bir kontrastı da mümkündür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig1.jpg"> Şekil 1. IRM 'nin şematik gösterimi. (A) epi-ışık kaynağından aydınlatma 50/50 aynaya ulaşmadan önce diyafram diyaframından geçer. Diyafram diyafram kiriş genişliği böylece aydınlatma NA ayarlar. 50/50 ayna, numuneyi aydınlatmak için ışık hedefini kısmen yansıtır. Örnek yansıyan ışık toplanır ve sonra görüntü oluşturmak için müdahale nerede kamera yongası (tüp objektif) üzerine yansıtılır. Görüntü kontrastı, cam/su arayüzünden (I2) yansıyan ışık ile su/mikrotubule arayüzünden (II$) yansıyan ışık arasındaki parazitin sonucudur. Mikrotubüs/yüzey mesafesine (h) bağlı olarak, I2 ve ı$ arasındaki optik yol farkı, yapıcı (parlak sinyal) veya yıkıcı (koyu sinyal) veya arasında herhangi bir şeye neden olacaktır. Örneğin, 600 nm dalga boyu ile ışık görüntüleme için kullanıldığında, kontrast yaklaşık 100 Nm ile Mikrotubul yüksekliği değiştiğinde koyu ve parlak arasında geçiş yapar. Yıldız işareti, Konjugat düzlemlerini gösterir (15' ten değiştirildi). (B) 50/50 yansıtma yükleme örneği. Uygun bir filtre küpü açıldı ve dikrotik aynaya genellikle oturduğu yerde ayna takılmış. Ayna, üretici yönergelerine göre yönlendirilmiş. Sonra küp geri mikroskop (gösterilmez) yerleştirilen filtre tekerleğine yerleştirilir. Kurulum sırasında eldiven kullanıldı ve ayna sadece kenarlar tarafından tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig2.jpg"> Şekil 2. Optimum Aperture diyafram ayarı. (A) aynı görüş alanı, arka plan çıkarma olmadan farklı diyafram diyafram açıklıkları görüntülenmiş. Görsel olarak kontrast, diyafram diyaframın boyutu arttıkça bir plato ulaşıncaya kadar arttı ve daha sonra kötüleşmesine başladı. Bu, arka planda ayrılan görüntülerin (B) SBR ölçümleriyle doğrulandı. Hata çubukları standart sapmadır.  Ölçek çubukları 500 μm (AD) ve 3 μm (microtubules) ' dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig3.jpg"> Şekil 3. Sinyal-arka plan gürültü oranını ölçme. Microtubules ilgi bölgelerde izole edildi. Her bölge ilgi arka planda Mikrotubul ayırmak için thresholded. Mikrotubul üzerinden ortalama mikrotubule sinyali bir hat taramasından alınmıştır. Tarama çizgisi genişliği microtubül uzunluğuna eşit olarak ayarlandı. Bu şekilde, taramanın her noktası, bu noktaya paralel olan Mikrotubul ekseni boyunca tüm piksellerin sinyallerinin ortalamasıdır. Arka plan gürültüsü, eşik altındaki tüm piksellerin standart sapmasını keser.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig4.jpg"> Şekil 4. Görüntü işleme. RAW görüntüler aldıktan sonra (A), arka plan (B) çıkarılır (C) Mikrotubul kontrast geliştirmek için. Kontrastı daha da iyileştirmek için görüntülerin ortalamaları (D) veya Fourier filtrelenmiş (E) veya her ikisi (F). Konumu ( a ) içindeki kesikli kırmızı çizgiyle gösterilen çizgi taramaları ( G), (a) ile ( F)arasındaki çeşitli görüntülerle eşleştirilir. Alt köşedeki Sayılar, tüm görüş alanı için ölçülen ortalama SBRs 'dir. Ölçek çubuğu 5 μm (15' ten değiştirildi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig5.jpg"> Şekil 5. Kymograf örnekleri. (A) 0,2 fps 'de elde edilen zaman atlamalı filmlerden üretilen Mikrotubul dinamiklerinin kymograph örnekleri. (B) 100 fps 'de elde edilen bir filmden oluşturulan bir küçülme olayının bir örneğini tasvir eden kymograph. Kesikli çizgiler tohumları işaretler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig6.jpg"> Şekil 6. IRM ile görüntülenmiş altın nanopartiküller örneği. Altın nanopartiküller 20 ve 40 Nm boyutları pasif yüzeye bağlı. 10 görüntü alınmıştır. Arka plan çıkarma sonrasında, yansımaları karşıtlığı artırmak için ortalamaları vardı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig7.jpg"> Şekil 7. IRM görüntülerde Microtubule uzunluğu Izleme hassasiyeti. Stabilize mikrotübüller (yani, sabit uzunlukları) 100 fps daha sonra 10 fps kontrast geliştirmek için ortalamalı 200x görüntülenmiştir. Ardından, microtubules ' uzunlukları Fiesta17 izleme yazılımı kullanılarak ölçülmüştür. Her microtubül için ortalama uzunluğu ve standart sapma şeklinde gösterildiği gibi hesaplanır (kesik çizgi ortalama ve katı kırmızı çizgiler standart sapmayı temsil eder, uzunluk = 3971 ± 20 Nm. Genel izleme hassasiyeti tüm izlenen mikrotübüller standart sapması ortalamasıdır (n = 6 mikrotübüller x 20 veri noktaları = 120 veri noktaları). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig7large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
Ek dosya 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Multi_Kymo.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a> 
Ek dosya 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Kymo_Analysis.ijm" target="_blank">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Bu protokolün önemi, DIC ve karanlık alan gibi diğer tekniklerden daha basit ve daha ucuz yüksek kare hızlarında yüksek kontrastlı görüntüler elde edebilen etiketsiz bir görüntüleme tekniği sunabilmesidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, uygulanması kolay ve kullanımı kolay olmasıdır. Bu ucuz ve kolayca floresan mikroskoplar ile kombine edilebilir.Yöntem tek tek mikrotübülleri görselleştirmek için geliştirilmiştir. Büyük protein komplekslerini ve nano partikülleri görselleştirmek için kullanılma potansiyeline sahiptir. Ana zorluk yarım gümüş ayna eklemek için filtre küpü ile tamir etmek için gerekli aktivasyon enerjisidir.Tekniği ilk kez deneyen birine tavsiyem bunu yapmak. Başlamak için, uygun bir filtre küpü kullanarak floresan mikroskobun filtre tekerleğine 50/50 ayna takın. Genellikle bir anti-yansıma kodlama var gibi dikkatli bir şekilde ayna kolu.Aynı zamanda yüksek sayısal diyafram yüksek bir büyütme hedefi açın. Burada gösterilen 1.3 sayısal diyafram ile 100x yağ hedefidir. Daha sonra, plastik parafin film üç milimetre genişliğinde şeritler kesmek için düz bir kenar olarak bir jilet ve mikroskop slayt kullanın.Plastik parafin film şeritleri üç milimetre ayrı temiz bir 22 tarafından 22 milimetrelik kapak kayma yerleştirin, sonra bir kanal oluşturmak için şeritler üstüne 18 tarafından 18 milimetrelik kapak kayma yerleştirin. Parafin filminin kapalı bir kanal oluşturması için kapak fişini 100 santigrat derecede 100 santigrat dereceden bir ısı bloğuna aktarın. Bir pipet kullanarak, perfüzyon ile bir anti-rhodamine antikor mililitre başına 50 mikrogram akış ve 10 dakika boyunca slayt kuluçka.Kuluçkadan sonra, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın, ardından filtrelenmiş BRB80'de %1 Poloxamer 407 ile akar ve yüzeyi spesifik olmayan bağlamaya karşı bloke edin ve kaydırağı 10 dakika kuluçkaya yatırın. Yine, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın. Numunenin kurumasını önlemek için, kanalın sonuna filtrelenmiş BRB80'den iki damlacık ekleyin ve gerektiğinde daha fazla arabellek ekleyin.Örneği mikroskop aşamasına yerleştirin ve epi-illumination ışık kaynağını açın. Örnek yüzeyi bulmak için parafin film kenarına odaklanın ve görünümü odanın ortasına ayarlamak için alanı hareket ettirin. Optik yol içindeki optik ışıktan gelen ışığın arkadan yansıması nedeniyle amaç yukarı ve aşağı hareket ettikçe birden fazla yüzey gözlemleyeceksiniz.Daha sonra, alan diyaframını yarı yolda kapatarak ve ayar vidalarını kullanarak görüş alanında ortaladı. Diyafram düzgün hizalandığında, yeniden açın. Daha sonra, bertrand lens slayt arka odak düzlemi görüntülemek için, aynı zamanda objektif çıkış gözbebeği olarak bilinen.Diyafram diyaframını çıkış gözbebeğinin kenarlarının ötesine kapatın ve diyafram diyaframını çıkış gözbebeğiyle ilgili olarak ortalamak için ayar vidalarını kullanın. Diyafram diyaframını açarak ve kenarlarını çıkış gözbebeğiyle eşleştirerek çift kontrol edin. Daha sonra diyafram diyaframını, hedefin sayısal diyaframının yaklaşık üçte ikisine ayarlayın.Başlamak için, kameranın pozlama süresini 10 milisaniyeye ayarlayın ve aydınlatmayı kameradinamik aralığını neredeyse doygunlaştıracak şekilde ayarlayın. Daha sonra, 0,22 mikrometre filtrelenmiş BRB80 GMPCPP stabilize mikrotübüllerin 10 mikrolitre akış için bir pipet kullanın. Yüzeyin görüntülenmesinde mikrotübül bağlamasını izleyin.10 ila 20 mikrotübül görüş alanına bağlandıktan sonra, filtrelenmiş BRB80 ile numuneyi iki kez yıkayın. Toplam 10 saniye lik bir zaman atlamave 10 saniyelik bir gecikme süresi oluşturarak mikrotübüllerin 10 görüntüsünü elde edin. Ardından, sahne denetleyicisini kanalın uzun ekseni boyunca kullanarak sahne görüntüsünü hareket ettirerek ve gecikmeden 100 görüntü elde ederek arka plan görüntüleri elde edin.Beyin tubulin kullanarak mikrotübül dinamikleri görüntü için, 37 santigrat derece örnek ısıtıcı sıcaklığı ayarlayarak başlayın. Bir pipet kullanarak, 10 mikrolitre GMPCPP stabilize mikrotübül tohumu akışı ve yüzeycanlı görüntüleme tarafından yüzeye bağlayıcı onları izlemek. 10 ila 20 tohum görüş alanına bağlandıktan sonra, önceden ısıtılmış ve filtrelenmiş BRB80'in iki katı kanal hacmini kullanarak numuneyi yıkayın.Sonra, polimerizasyon karışımı 10 mikrolitre akış. Mikrotübül büyümesini ölçmek için, 15 dakika boyunca her beş saniyede bir görüntü elde etmek için satın alma yazılımını kullanarak bir zaman atlamalı ayarlayın. Her zaman noktasında ortalama 10 görüntü elde ederek kontrastı artırın.Önceki bölümde gösterildiği gibi arka plan görüntüleri edinin. Görüntüye giderek, yığın seçerek ortanca hesaplayın, sonra Z projesi, sonra ortanca. İşleme giderek, görüntü hesap makinesine giderek ve açılır menüden çıkarma seçerek ilgili arka planı çıkarın.32 bit float sonuç seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Mikrotübül büzülmesi için, zaman gecikmesini sıfıra ayarlayarak ve pozlama süresini 10 milisaniyede tutarak saniyede 100 kare lik görüntüler elde edin. Girişim indüksiyon mikroskobu ile yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için önemli bir faktör düzgün aydınlatma sayısal diyafram ayarlamaktır.Bu diyafram diyafram boyutu tarafından kontrol edilen objektif, çıkış gözbebeği aydınlatma kiriş boyutu rehberlik tarafından yapılabilir. Floresan etiketli stabilize mikrotübüllerden bir örnek kullanarak, mikrotübülleri floresan olarak görüntülerken mikroskobun odak noktası haline getirin. Kamera pozlamasını 10 milisaniyeye ayarlayın ve diyafram diyaframını en küçük açıklığına kadar kapatın.Ayrıca, aydınlatmayı kameranın dinamik aralığını neredeyse doygunlaştıracak şekilde veya maksimum menzile ulaşılıncaya kadar ayarlayın. 10 veya daha fazla mikrotübül içeren bir görüş alanı akışı yaparak 10 görüntü elde edin. Ardından arka plan görüntüsü elde edin.Diyaframın boyutunu değiştirin ve aydınlatma yoğunluğunu daha önce belirlenenle eşleşecek şekilde ayarlayın. 10 yeni görüntü ve yeni bir arka plan edinin. Diyaframın tüm aralığı tamamlanana kadar bu işlemi tekrarlayın.Edinilen her görüş alanı için, ilgili arka planı çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi ortaya çıkan arka plan çıkarılan görüntüleri ortalama. Daha sonra, her açılış boyutu için mikrotübüllerin arka plan gürültü oranına ortalama sinyali hesaplayın. Diyafram boyutunu arka plan gürültü oranına kadar en yüksek sinyali üreten boyuta ayarlayın.Burada gösterildiği gibi karşılaştırılabilir kontrast üreten bir dizi boyut olması mümkündür. İyi hizalanmış bir mikroskopla, mikrotübüller arka plan çıkarma olmadan görülebilmelidir. Ancak arka planı çıkarmak mikrotübülün kontrastını artırır.Kontrastı daha da artırmak için ortalama, 4a filtreleme veya her ikisinin bir kombinasyonu kullanılabilir. Burada gösterilen çizgi taramaları görüntü kalitesinin artımlı gelişimini açıklar. Bunlar, her işlem adımında arka plan gürültüsünün gözle görülür şekilde azaltılmasını açıklar.Mikrotübül dinamiği zaman atlamalı filmlerden oluşturulan kinograflarda rapor edilebilir. Saniyede 0,2 kare kare hızında edinilen bir örnek kinograf burada gösterilmiştir. Kesik çizgiler tohumları işaretler.Bu yordamı gerçekleştirirken, yüksek sayısal diyafram hedefleri ile çalışmak önemlidir. Diyafram çapı çerçevesinin boyutunu doğru hizalamak ve ayarlamak da önemlidir. Irm'i floresan görüntüleme ile birleştirmek kolaydır, örneğin mikrotübül bağlayıcı proteinleri ve mikrotübül dinamiklerini nasıl değiştirdiklerini incelemek için.Bu teknik fotoğraf hasarını önemli ölçüde azaltır ve daha yüksek kare hızı elde edilmesine olanak sağlayarak, mikrotübüller gibi etiketli biyopolimerlerin yüksek zamansal çözünürlük ve iyi izleme hassasiyeti ile uzun süre çalışılmasını kolaylaştırır.

implementation-interference-reflection-microscopy-for-label-free-high

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, aktin ve mikrotübül polimerizasyon dinamiklerini görselleştirmek için toplam iç yansıma mikroskobu tabanlı bir teknik olan TIRF açıklanmaktadır. Yöntem, hücresel karışmaları anlamak için gerekli olan aktin ve mikrotübül eşleşme dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verir.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğini Görselleştirmek için TIRF Mikroskobu

Bu videoda, uygun bir tampon varlığında bir lamel yüzeyinde büyüyen mikrotübülleri görselleştirmek için girişim yansıma mikroskobu (IRM) tekniğini açıklıyoruz. Gelen ışıkla aydınlatıldıktan sonra, lamel tampon arayüzü ve tampon-mikrotübül arayüzü ışığı yansıtır, bu da bir girişim deseni oluşturmak için birleşerek mikrotübüllerin parlak bir arka plana karşı yüksek kontrastlı görüntüler olarak görselleştirilmesini sağlar.

Mikrotübül Dinamiğinin Etiketsiz Görselleştirilmesi için Girişim Yansıma Mikroskobu

Mikrotübüller doğal kararsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Burada photoablatable stabilize kapaklar ile segmentli mikrotübülleri kullanarak protokolleri açıklar. Parçalara Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül uçları ile hareketleri analizi yardımcı, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir.

Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için...

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Bu makalede, basit, yenilikçi bir ikinci harmonik nesil mikroskopi yaklaşımı ile bir tübülinopati modelinde mikrotübül yüklü oligodendrositleri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

Merkezi Miyelin'de Tubuline Bağlı Kusurların İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler

Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Öğrenin, mikrotübülleri etiketsiz görüntülemek için girişim yansıma mikroskobisini kullanmayı. Bu yöntem, yüksek kontrastlı ve hızlı görüntüleme sağlayarak hücre biyolojisi araştırmalarında maliyet etkin bir alternatif sunar.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

Daha fazla video keşfet