Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması
8 Ağustos 2019
Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.
Bu protokolün önemi, DIC ve karanlık alan gibi diğer tekniklerden daha basit ve daha ucuz yüksek kare hızlarında yüksek kontrastlı görüntüler elde edebilen etiketsiz bir görüntüleme tekniği sunabilmesidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, uygulanması kolay ve kullanımı kolay olmasıdır. Bu ucuz ve kolayca floresan mikroskoplar ile kombine edilebilir.
Yöntem tek tek mikrotübülleri görselleştirmek için geliştirilmiştir. Büyük protein komplekslerini ve nano partikülleri görselleştirmek için kullanılma potansiyeline sahiptir. Ana zorluk yarım gümüş ayna eklemek için filtre küpü ile tamir etmek için gerekli aktivasyon enerjisidir.
Tekniği ilk kez deneyen birine tavsiyem bunu yapmak. Başlamak için, uygun bir filtre küpü kullanarak floresan mikroskobun filtre tekerleğine 50/50 ayna takın. Genellikle bir anti-yansıma kodlama var gibi dikkatli bir şekilde ayna kolu.
Aynı zamanda yüksek sayısal diyafram yüksek bir büyütme hedefi açın. Burada gösterilen 1.3 sayısal diyafram ile 100x yağ hedefidir. Daha sonra, plastik parafin film üç milimetre genişliğinde şeritler kesmek için düz bir kenar olarak bir jilet ve mikroskop slayt kullanın.
Plastik parafin film şeritleri üç milimetre ayrı temiz bir 22 tarafından 22 milimetrelik kapak kayma yerleştirin, sonra bir kanal oluşturmak için şeritler üstüne 18 tarafından 18 milimetrelik kapak kayma yerleştirin. Parafin filminin kapalı bir kanal oluşturması için kapak fişini 100 santigrat derecede 100 santigrat dereceden bir ısı bloğuna aktarın. Bir pipet kullanarak, perfüzyon ile bir anti-rhodamine antikor mililitre başına 50 mikrogram akış ve 10 dakika boyunca slayt kuluçka.
Kuluçkadan sonra, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın, ardından filtrelenmiş BRB80'de %1 Poloxamer 407 ile akar ve yüzeyi spesifik olmayan bağlamaya karşı bloke edin ve kaydırağı 10 dakika kuluçkaya yatırın. Yine, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın. Numunenin kurumasını önlemek için, kanalın sonuna filtrelenmiş BRB80'den iki damlacık ekleyin ve gerektiğinde daha fazla arabellek ekleyin.
Örneği mikroskop aşamasına yerleştirin ve epi-illumination ışık kaynağını açın. Örnek yüzeyi bulmak için parafin film kenarına odaklanın ve görünümü odanın ortasına ayarlamak için alanı hareket ettirin. Optik yol içindeki optik ışıktan gelen ışığın arkadan yansıması nedeniyle amaç yukarı ve aşağı hareket ettikçe birden fazla yüzey gözlemleyeceksiniz.
Daha sonra, alan diyaframını yarı yolda kapatarak ve ayar vidalarını kullanarak görüş alanında ortaladı. Diyafram düzgün hizalandığında, yeniden açın. Daha sonra, bertrand lens slayt arka odak düzlemi görüntülemek için, aynı zamanda objektif çıkış gözbebeği olarak bilinen.
Diyafram diyaframını çıkış gözbebeğinin kenarlarının ötesine kapatın ve diyafram diyaframını çıkış gözbebeğiyle ilgili olarak ortalamak için ayar vidalarını kullanın. Diyafram diyaframını açarak ve kenarlarını çıkış gözbebeğiyle eşleştirerek çift kontrol edin. Daha sonra diyafram diyaframını, hedefin sayısal diyaframının yaklaşık üçte ikisine ayarlayın.
Başlamak için, kameranın pozlama süresini 10 milisaniyeye ayarlayın ve aydınlatmayı kameradinamik aralığını neredeyse doygunlaştıracak şekilde ayarlayın. Daha sonra, 0,22 mikrometre filtrelenmiş BRB80 GMPCPP stabilize mikrotübüllerin 10 mikrolitre akış için bir pipet kullanın. Yüzeyin görüntülenmesinde mikrotübül bağlamasını izleyin.
10 ila 20 mikrotübül görüş alanına bağlandıktan sonra, filtrelenmiş BRB80 ile numuneyi iki kez yıkayın. Toplam 10 saniye lik bir zaman atlamave 10 saniyelik bir gecikme süresi oluşturarak mikrotübüllerin 10 görüntüsünü elde edin. Ardından, sahne denetleyicisini kanalın uzun ekseni boyunca kullanarak sahne görüntüsünü hareket ettirerek ve gecikmeden 100 görüntü elde ederek arka plan görüntüleri elde edin.
Beyin tubulin kullanarak mikrotübül dinamikleri görüntü için, 37 santigrat derece örnek ısıtıcı sıcaklığı ayarlayarak başlayın. Bir pipet kullanarak, 10 mikrolitre GMPCPP stabilize mikrotübül tohumu akışı ve yüzeycanlı görüntüleme tarafından yüzeye bağlayıcı onları izlemek. 10 ila 20 tohum görüş alanına bağlandıktan sonra, önceden ısıtılmış ve filtrelenmiş BRB80'in iki katı kanal hacmini kullanarak numuneyi yıkayın.
Sonra, polimerizasyon karışımı 10 mikrolitre akış. Mikrotübül büyümesini ölçmek için, 15 dakika boyunca her beş saniyede bir görüntü elde etmek için satın alma yazılımını kullanarak bir zaman atlamalı ayarlayın. Her zaman noktasında ortalama 10 görüntü elde ederek kontrastı artırın.
Önceki bölümde gösterildiği gibi arka plan görüntüleri edinin. Görüntüye giderek, yığın seçerek ortanca hesaplayın, sonra Z projesi, sonra ortanca. İşleme giderek, görüntü hesap makinesine giderek ve açılır menüden çıkarma seçerek ilgili arka planı çıkarın.
32 bit float sonuç seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Mikrotübül büzülmesi için, zaman gecikmesini sıfıra ayarlayarak ve pozlama süresini 10 milisaniyede tutarak saniyede 100 kare lik görüntüler elde edin. Girişim indüksiyon mikroskobu ile yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için önemli bir faktör düzgün aydınlatma sayısal diyafram ayarlamaktır.
Bu diyafram diyafram boyutu tarafından kontrol edilen objektif, çıkış gözbebeği aydınlatma kiriş boyutu rehberlik tarafından yapılabilir. Floresan etiketli stabilize mikrotübüllerden bir örnek kullanarak, mikrotübülleri floresan olarak görüntülerken mikroskobun odak noktası haline getirin. Kamera pozlamasını 10 milisaniyeye ayarlayın ve diyafram diyaframını en küçük açıklığına kadar kapatın.
Ayrıca, aydınlatmayı kameranın dinamik aralığını neredeyse doygunlaştıracak şekilde veya maksimum menzile ulaşılıncaya kadar ayarlayın. 10 veya daha fazla mikrotübül içeren bir görüş alanı akışı yaparak 10 görüntü elde edin. Ardından arka plan görüntüsü elde edin.
Diyaframın boyutunu değiştirin ve aydınlatma yoğunluğunu daha önce belirlenenle eşleşecek şekilde ayarlayın. 10 yeni görüntü ve yeni bir arka plan edinin. Diyaframın tüm aralığı tamamlanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
Edinilen her görüş alanı için, ilgili arka planı çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi ortaya çıkan arka plan çıkarılan görüntüleri ortalama. Daha sonra, her açılış boyutu için mikrotübüllerin arka plan gürültü oranına ortalama sinyali hesaplayın. Diyafram boyutunu arka plan gürültü oranına kadar en yüksek sinyali üreten boyuta ayarlayın.
Burada gösterildiği gibi karşılaştırılabilir kontrast üreten bir dizi boyut olması mümkündür. İyi hizalanmış bir mikroskopla, mikrotübüller arka plan çıkarma olmadan görülebilmelidir. Ancak arka planı çıkarmak mikrotübülün kontrastını artırır.
Kontrastı daha da artırmak için ortalama, 4a filtreleme veya her ikisinin bir kombinasyonu kullanılabilir. Burada gösterilen çizgi taramaları görüntü kalitesinin artımlı gelişimini açıklar. Bunlar, her işlem adımında arka plan gürültüsünün gözle görülür şekilde azaltılmasını açıklar.
Mikrotübül dinamiği zaman atlamalı filmlerden oluşturulan kinograflarda rapor edilebilir. Saniyede 0,2 kare kare hızında edinilen bir örnek kinograf burada gösterilmiştir. Kesik çizgiler tohumları işaretler.
Bu yordamı gerçekleştirirken, yüksek sayısal diyafram hedefleri ile çalışmak önemlidir. Diyafram çapı çerçevesinin boyutunu doğru hizalamak ve ayarlamak da önemlidir. Irm'i floresan görüntüleme ile birleştirmek kolaydır, örneğin mikrotübül bağlayıcı proteinleri ve mikrotübül dinamiklerini nasıl değiştirdiklerini incelemek için.
Bu teknik fotoğraf hasarını önemli ölçüde azaltır ve daha yüksek kare hızı elde edilmesine olanak sağlayarak, mikrotübüller gibi etiketli biyopolimerlerin yüksek zamansal çözünürlük ve iyi izleme hassasiyeti ile uzun süre çalışılmasını kolaylaştırır.
Genel Bakış
Bu protokol, standart floresan mikroskoplarda interferans refleksiyonu mikroskopisini kullanarak yüksek kontrast, yüksek hızlı mikrotübül görüntüleme için etiket içermeyen bir görüntüleme tekniği sunar. Geleneksel yöntemlere göre daha basit ve daha uygun maliyetli olması için tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskop Teknikleri
Arka Plan
- Interferans refleksiyonu mikroskopisi, etiketler olmadan yüksek kontrastlı görüntüleme sağlar.
- Bu yöntem özellikle mikrotübülleri ve büyük protein komplekslerini görselleştirmek için kullanışlıdır.
- DIC ve karanlık alan mikroskopisi gibi tekniklere kıyasla daha kolay uygulanabilir.
- Protokol, numunelerin hazırlanması ve görüntüleme koşullarının optimize edilmesi için ayrıntılı adımlar içerir.
Çalışmanın Amacı
- Interferans refleksiyonu mikroskopisi kullanarak mikrotübül görüntüleme için basit bir protokol sağlamak.
- Bu tekniğin çeşitli biyolojik yapıları görselleştirmede potansiyel uygulamalarını göstermek.
- Yüksek kaliteli görüntüler elde etme sürecini uygun maliyetli bir şekilde basitleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Mikrotübül bağlanması için kanallar oluşturmak üzere parafin film kullanarak numunelerin hazırlanması.
- Belirli filtre küpleri ve aynalar içeren bir floresan mikroskop kullanımı.
- Mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini izlemek için zaman süreci görüntüleme.
- Kontrast geliştirme için arka plan görüntüsü elde etme.
Ana Sonuçlar
- Yüksek kontrast ve hızda mikrotübülleri başarılı bir şekilde görselleştirme.
- Tekniğin kullanım kolaylığını ve uygulanabilirliğini gösterme.
- Büyük protein kompleksleri ve nanopartiküllerin çalışmasında uygulama potansiyeli.
- Tekrarlanabilirliği artıran ayrıntılı görüntüleme protokolleri sağlama.
Sonuçlar
- Bu protokol, mikroskopi ve hücre biyolojisi araştırmacıları için değerli bir araç sunar.
- Etiket içermeyen görüntüleme tekniklerinin avantajlarını vurgular.
- Gelecek uygulamaları çeşitli biyolojik ve biyomedikal araştırma alanlarına uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Label-free, high-speed imaging of microtubules addresses a key discovery-stage challenge in studying cytoskeletal dynamics without perturbing native function. Interference reflection microscopy (IRM) provides predictive confidence in target validation by enabling quantitative measurement of microtubule length and dynamics with high temporal resolution. This supports early de-risking of therapeutic hypotheses involving microtubule-targeting agents or associated regulatory proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microtubule dynamics as a therapeutic hypothesis without fluorescent labels that could alter protein function.
- Operational Value: Provides label-free contrast compatible with standard fluorescence microscopes, reducing reagent costs and phototoxicity concerns.
- Predictive Confidence: Allows measurement of microtubule length with precision up to 20 nm and bandwidth of 10 Hz, supporting quantitative assessment of compound effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-contrast, label-free images suitable for automated analysis of microtubule binding and polymerization kinetics.
- Operational Value: Uses wide-field illumination and sCMOS cameras, enabling scalable imaging across large fields of view limited only by camera performance.
- Assay Readiness: Background subtraction and image averaging enhance signal-to-noise ratio, supporting reproducible compound screening in 384-well or higher formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by visualizing microtubule dynamics in vitro under physiological conditions (37°C) with minimal photodamage.
- Operational Value: Enables long-term time-lapse imaging (e.g., 15-minute growth assays) at high frame rates, facilitating kinetic analysis of microtubule-targeting compounds.
- Translational Continuity: Compatible with fluorescence imaging, allowing correlation of label-free structural data with fluorescently tagged binding proteins or post-translational modifications.
Pipeline & Workflow Integration
IRM fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for compounds modulating microtubule stability or motor protein activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying microtubule growth and shrinkage rates in response to perturbations, enabling mechanistic de-risking of targets.
- Screening: Delivers quantitative outputs (length, growth rate, catastrophe frequency) that allow comparison across compound libraries or genetic conditions.
- Analytics: Enables calculation of signal-to-background ratios and kinograph generation from time-lapse movies, providing objective metrics for hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining microtubule integrity over extended imaging periods, supporting dose-response and target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Requires only a fluorescence microscope, half-silver mirror, and paraffin film, making it a low-cost, reusable platform across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing label-free, high-speed visualization of microtubule dynamics without photobleaching or photodamage.
- Operational Value: Standardizes imaging via aperture diaphragm optimization and background subtraction, improving reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on cytoskeletal function, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microtubule-modulating compounds through quantitative, label-free phenotypic readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, particularly aperture diaphragm and condenser adjustment for optimal signal-to-noise ratio.
- Needs a fluorescence microscope with filter cube capable of holding a 50/50 mirror and high-NA objective (e.g., 100x oil, NA 1.3).
- Demands standardization of sample preparation steps, including paraffin film channel formation and surface blocking with Poloxamer 407.
- Adaptation to other model systems may require optimization of surface chemistry and incubation times for target binding.
- Practical limitation: Initial setup involves manual alignment of aperture diaphragm to exit pupil, which may require training for consistent results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Microscope Modification and Chamber Preparation
2:32
Microscope Alignment
3:43
Control: Imaging Stabilized Microtubules
4:43
Imaging Microtubule Dynamics
6:28
Properly Setting the Aperture Diaphragm Size
8:11
Results: IRM Imaging of Microtubules Dynamics and Contrast Enhancement using Image Processing
9:02
Conclusion
