Mikrotübül Dinamiğinin Etiketsiz Görselleştirilmesi için Girişim Yansıma Mikroskobu

Girişim yansıma mikroskobu, dinamik olarak büyüyen ve küçülen mikrotübüllerin görüntülenmesini sağlar.

Parafin şeritlerini bir lamel üzerine sabitleyin ve üstüne biraz daha küçük bir lamel yerleştirin. Parafini eritmek için ısıtın, kapalı bir kanal oluşturun. Kanaldan antikor içeren bir çözelti pipetleyin. Antikorlar lamel yüzeyine yapışır. Antikora bağlanmamış bölgeleri bloke eden ve spesifik olmayan protein bağlanmasını önleyen bir bloke edici çözelti ekleyin.

Lameli mikroskop tablasına yerleştirin. Numune ısıtıcısını mikrotübül büyümesini kolaylaştıran bir sıcaklığa ayarlayın.

Hidrolize edilemeyen bir guanozin trifosfat, GTP, analog ile stabilize edilmiş pipet mikrotübül tohumları. Tohumlar antikor kaplı lamel ile bağlanır. Etiketlenmemiş tübülin, GTP ve indirgeyici maddeler içeren bir tampon ekleyin.

Optimum sıcaklık ve tampon koşullarında, tohumlar çekirdeklenme bölgeleri olarak işlev görür ve etiketlenmemiş tübül bağlanmasına ve mikrotübül büyümesine izin verir.

Görüntülemeye başlayın. Gelen ışık, bir diyafram açıklığı diyaframından, ışığı kısmen objektife yansıtan ve numuneyi aydınlatan bir ışın ayırıcıya odaklanır. Lamelin cam-tampon arayüzü, gelen ışığı kısmen yansıtır. Kalan gelen ışık geçer ve tampon-mikrotübül arayüzlerinden yansır.

Mikrotübül-lamel mesafesine bağlı olarak, iki arayüzden yansıyan ışınlar girişim üreterek enterferans üretir - parlak bir sinyal üretmek için birleşen ışınlar veya yıkıcı girişim - karanlık bir sinyal üretmek için iptal edilen ışınlar.

Mikrotübülleri yüksek kontrastlı görüntüler olarak görselleştirin. Mikrotübül büyümesini ve büzülmesini algılayarak zaman atlamalı görüntüler yakalayın.

Başlamak için, uygun bir filtre küpü kullanarak bir floresan mikroskobun filtre çarkına 50/50'lik bir ayna yerleştirin. Aynayı, yansıma önleyici bir kaplamaya sahip oldukları için dikkatli tutun. Aynı zamanda yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip yüksek büyütme oranına sahip bir objektife dönün. Burada gösterilen, sayısal açıklığı 1,3 olan 100x'lik bir yağ hedefidir.

Ardından, 3 milimetre genişliğinde plastik parafin film şeritlerini kesmek için düz kenar olarak bir tıraş bıçağı ve mikroskop lamı kullanın. Plastik parafin film şeritlerinden ikisini 3 milimetre aralıklarla 22 x 22 milimetrelik temiz bir lamel üzerine yerleştirin. Ardından, bir kanal oluşturmak için şeritlerin üzerine 18 x 18 milimetrelik bir lamel yerleştirin.

Parafin filminin kapalı bir kanal oluşturması için lamel 100 santigrat derecede 10 ila 30 saniye boyunca bir ısı bloğuna aktarın. Bir pipet kullanarak, perfüzyon yoluyla mililitre başına 50 mikrogram bir anti-rodamin antikoru akıtın ve slaytı 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın. Ardından, yüzeyi spesifik olmayan bağlanmaya karşı bloke etmek için filtrelenmiş BRB1'de %407 poloksamer 80'yi akıtın ve slaytı 10 dakika inkübe edin. Yine, filtrelenmiş BRB80 kullanarak kanalı beş kez yıkayın.

Numunenin kurumasını önlemek için, kanalın uçlarına filtrelenmiş BRB80'den iki damla ekleyin ve gerektiği kadar daha fazla tampon ekleyin. Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin ve epi-aydınlatma ışık kaynağını açın. Numune yüzeyini bulmak için parafin film kenarına odaklanın ve ardından görünümü odanın merkezine ayarlamak için alanı hareket ettirin. Optik yol içindeki optiklerden gelen ışığın geri yansıması nedeniyle objektif yukarı ve aşağı hareket ederken birden fazla yüzeyi gözlemleyeceksiniz.

Ardından, alan diyaframını yarıya kadar kapatarak ve ayar vidalarını kullanarak görüş alanında ortalayın Diyafram düzgün şekilde hizalandıktan sonra yeniden açın. Ardından, objektifin çıkış göz bebeği olarak da bilinen arka odak düzlemini görüntülemek için Bertrand merceğini kaydırın.

Diyafram diyaframını çıkış gözbebeğinin kenarlarının ötesine kapatın ve diyafram diyaframını çıkış gözbebeğine göre ortalamak için ayar vidalarını kullanın. Diyafram diyaframını açarak ve kenarlarını çıkış göz bebeğininkilerle eşleştirerek iki kez kontrol edin. Ardından, diyafram diyaframını objektifin sayısal diyafram açıklığının yaklaşık 2/3'üne ayarlayın.

Beyin tübülini kullanarak mikrotübül dinamiklerini görüntülemek için, örnek ısıtıcı sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayarak başlayın. Bir pipet kullanarak, 10 mikrolitre GMPCPP ile stabilize edilmiş mikrotübül tohumlarını akıtın ve yüzeyi canlı olarak görüntüleyerek yüzeye bağlanmalarını izleyin. Görüş alanına 10 ila 20 tohum bağlandıktan sonra, numuneyi önceden ısıtılmış ve filtrelenmiş BRB80'in kanal hacminin iki katı kullanarak yıkayın.

Daha sonra, polimerizasyon karışımının 10 mikrolitresini akıtın.

Mikrotübül büyümesini ölçmek için, 15 dakika boyunca her 5 saniyede bir görüntü elde etmek için edinme yazılımını kullanarak hızlandırılmış bir çekim ayarlayın. Her zaman noktasında ortalama 10 görüntü elde ederek kontrastı artırın. Önceki bölümde gösterildiği gibi arka plan görüntüleri alın. Görüntü'ye gidip Yığın'ı, ardından Z Projesi'ni ve ardından Medyan'ı seçerek medyanı hesaplayın. İşlem'e giderek, Görüntü Hesaplayıcı'ya giderek ve açılır menüden Çıkar'ı seçerek ilgili arka planı çıkarın. 32 bit float sonuç seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun.

Mikrotübül büzülmesi için, zaman gecikmesini sıfıra ayarlayarak ve pozlama süresini 10 milisaniyede tutarak saniyede 100 kare hızında görüntüler elde edin.