Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Membran Fırfır Oluşumunun Miktar Tayini

Dış stimülatörler hücreleri aktive eder ve çeşitli hücresel aktiviteler için gerekli olan üç boyutlu dairesel zar çıkıntısını veya zar fırfır oluşumunu indükler.

Membran fırfır oluşumunu görselleştirmek için, tabanda bir lamel içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın. Lamelin üst kısmında kültürlenmiş makrofajlar vardır.

Bu makrofajları, hücreleri aktive eden, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini ve zar çıkıntı oluşumunu kolaylaştıran stimülatör moleküllerle tedavi edin. Hücreleri sabitleyici bir çözelti ile kaplayın, proteinleri çapraz bağlayın ve hücresel yapıyı koruyun.

Tam dehidrasyon için sabit makrofajları artan alkol konsantrasyonları ile tedavi edin. Bu makrofajları kritik bir nokta kurutucu kullanarak kurutun ve daha iyi görüntüleme için su kalıntılarını ortadan kaldırın.

Lameli iletken bant kullanarak bir taramalı elektron mikroskobu veya SEM numune tutucusuna monte edin. Makrofaj içeren lameli ince bir metal tabaka ile püskürterek kaplayın ve görüntüleme sırasında iyi bir elektronik iletkenlik sağlayın.

Lameli SEM odasına yerleştirin. Elektron demetini lamel üzerine odaklayın. Elektron ışını, metal kaplı makrofajın zarına çarpar ve zar yüzeyinden düşük enerjili ikincil elektron üretimine neden olur.

Üç boyutlu çıkıntılar, elektronları zarın geri kalanından farklı bir şekilde dağıtır ve bu özellikleri hücre yüzeyinde vurgular. Dedektör, saçılan elektronları çeşitli hücre yüzey bölgelerinden toplayarak bir kontrast görüntü oluşturur.

SEM görüntüsünde, makrofajlar yüzeyde parlak dairesel çıkıntılarla daha koyu görünür ve fırfır oluşumunu doğrular.

Otoklavlanmış forseps kullanarak 24 oyuklu bir plakanın kuyularına steril cam lameller yerleştirerek başlayın. Daha sonra, RAW 264.7 makrofajlarını mililitre başına 10⁶ hücre yoğunluğunda lamellerin üzerine tohumlayın ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

Ertesi gün, her bir oyuktaki ortamı 500 mikrolitre taze tam ortamla değiştirin, ardından makrofajları DMSO gibi bir araç kontrolü veya EIPA gibi bir makropinositoz inhibitörü ile 30 dakika boyunca ön işlemden geçirin. Daha sonra, zar fırfırlamasını teşvik etmek için, hücreleri 30 dakika boyunca 1 mikromolar PMA çözeltisi veya mililitre makrofaj koloni uyarıcı faktör başına 100 nanogram gibi makropinositoz stimülatörleri ile tedavi edin.

Elektron mikroskobu taramak için hücreleri sabitlemek için, ortamı kuyulardan aspire edin ve lamelleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, lamelleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir fiksatif içinde inkübe edin, ardından gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, hücre tek tabakasını bozmadan, nazikçe yıkayın ve ardından lamelleri 500 mikrolitre 0.1 molar sodyum kakodilat içinde 15 dakika inkübe edin. 500 mikrolitre damıtılmış su ile iki yıkamadan sonra, lamelleri her yıkamada 10 dakikalık bir inkübasyon ile 500 mikrolitre dereceli etanol serisinde iki kez yıkayın.

Kritik nokta kurutması yapmak için, lamelleri bir Kritik Nokta Kurutucuya yerleştirin ve üzerlerini %100 etanol ile kaplayın, ardından Güç düğmesine basın ve karbondioksit tankını açın. Sıcaklık 30 santigrat dereceye düşene kadar Soğutma düğmesine yaklaşık 0 saniye basın. Ardından, oda penceresinde bir baloncuk görünene kadar Doldur düğmesine basın.

Ardından, temizleme egzozundan gelen etanol kokusu kaybolana kadar Temizleme düğmesine basın. Ardından, sıcaklık 0 santigrat dereceye düşene kadar Soğut düğmesine tekrar basın. Kapatmak için Doldur ve Temizle düğmelerine yeniden basın. Ardından karbondioksit tankını kapatın. Kapatmak için Soğutma düğmesine tekrar basın, ardından Isı düğmesine basın. Sıcaklığı 42 santigrat dereceye ve basıncı inç kare başına 1.200 pound'a ayarlayın.

Basınç ve sıcaklık dengelendiğinde, basıncın yavaşça düşmesini sağlamak için Boşaltma düğmesine basın. Hazne basıncı inç kare başına 150 pound'a ulaştığında, Havalandırma düğmesine basın ve basınç inç kare başına 0 pound'a düşene kadar bekleyin. Kritik Nokta Kurutucuyu kapatın ve lamelleri çıkarın.

Ardından, Karbon Yapıştırıcı tırnakları kullanarak, elektron mikroskobunu taramak için lamelleri alüminyum numune yuvalarına monte edin. Ardından, bir püskürtme kaplayıcıda altın veya paladyum kullanarak püskürtme kaplamasına devam edin.

Püskürtme kaplayıcının Güç düğmesini açın. Vakum 30 militorra ulaştıktan sonra, gaz anahtarını kapatarak ve İnce Gaz vanasını saat yönünün tersine çevirerek nemi ve havayı gidermek için hazneyi yıkayın. Vakum 200 militorr'a yükseldiğinde, gaz anahtarını kapatın ve vakum 30 militorr'a ulaşana kadar bekleyin, Ardından, gösterildiği gibi nemi ve havayı çıkarmak için hazneyi tekrar yıkayın. Hazneyi üç kez yıkadıktan sonra, Zamanlayıcı düğmesine basın ve Voltaj düğmesini gösterge 10 miliamper okuyana kadar ayarlayın. Ardından, kaplanmış lamelleri hazneden çıkarın.

Membran fırfırlarını görselleştirmek ve ölçmek için, numune lamellerini bir taramalı elektron mikroskobunun haznesine yerleştirin. Kapıyı kapatın ve Evac düğmesine basın. Mikroskop çalıştırma yazılımını açın ve hızlanma voltajını 15 kilovolta ve çalışma mesafesini 10 milimetreye ayarlayın. Koordinatlar düğmesine basın ve hücreler gözlem ekranının ortasında görünene kadar denetleyicinin etrafında hareket edin. Büyütmeyi 3500x olarak ayarlayın ve Fotoğraf düğmesine tıklayarak örneği görüntüleyin.