Name: Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Öğrenin hücre kenarı çıkıntı analizi ile hücre göçü dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, hücre hareketliliğindeki kritik proteinleri ve sinyal mekanizmalarını belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH MH115939, NS112121, NS105640 ve R56MH122449-01A1 (Anthony J. Koleske'ye) ve İsrail Bilim Vakfı'ndan (1462/17 ve 2142/21 numaralı hibeler) (Hava Gil-Henn'e) hibelerle desteklenmiştir.

Bu protokolde açıklanan tüm yöntemler, Bar-Ilan Üniversitesi kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Bu bölümde açıklanan yordamın adım adım grafiksel gösterimi Şekil 1'de görülmektedir.
1. Hücre kültürü
NOT: Protokolde kullanılan hücreler, vahşi tip C57BL / 6 farelerin E11.5-13.5 embriyolarından üretilen fare embriyonik fibroblastlarıdır (MEF'ler). Birincil MEF'ler Jacks laboratuvar protokolüne göre oluşturulmuştur13. Beş farklı embriyodan elde edilen hücreler bir araya getirildi ve SV40 büyük T antijenini eksprese eden retroviral bir vektör ile enfeksiyon ile ölümsüzleştirildi ve ardından 3 hafta boyunca 4 mM Histidinol ile seçildi.
<ol><li>1 g / L glikoz,% 1 glutamin,% 1 penisilin-streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren doku kültürü plakalarındaki kültür hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu), 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde.</li>
	<li>Hücreleri% 90-95 akıcılığa kadar kültürleyin ve her 2-3 günde bir 1: 5 oranında bölün.</li>
</ol>2. Cam tabanlı çanak kaplama
NOT: Cam tabanlı çanak kaplama, doku kültürü davlumbazında steril koşullarda yapılmalıdır.
<ol><li>Cam tabanlı bir kabın ortasına 2 mL 1N HCl çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Bu aşama, daha sonra görüntülemeyi kesintiye uğratabilecek kalıntıları camdan uzaklaştırmak içindir.</li>
	<li>Cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS (Malzeme Tablosu) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Fibronektini (bakınız Malzeme Tablosu) 1x PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltin. Seyreltilmiş fibronektin çözeltisinin 200 μL'sini kabın cam merkezine ekleyin. 1 saat boyunca 37 °C'de (doku kültürü inkübatörü) inkübe edin. NOT: Alternatif olarak, cam tabanlı çanak düz bir yüzeyde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilebilir.</li>
	<li>Fibronektin kaplama inkübasyon süresi boyunca, 1x PBS'de% 1 BSA (Malzeme Tablosu) çözeltisi hazırlayın, 0,2 μm'den süzün ve önceden ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe ederek denatüre edin.</li>
	<li>Kaplamalı cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Cam merkeze 2 mL denatüre BSA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin (doku kültürü inkübatörü). NOT: Alternatif olarak, cam tabanlı çanak düz bir yüzeyde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilebilir.</li>
	<li>Cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS ile 3 kez yıkayın. NOT: Cam tabanlı tabakların fibronektin ile inkübasyonu, yüzeyi düzgün bir şekilde kaplamak için 37 ° C'de en az 1 saat boyunca yapılmalıdır. Daha kısa inkübasyon süresi uygun kaplama üretmeyebilir ve sonuç olarak, hücre fenotipi integrin aktivasyonu ile ilişkili olmayabilir. BSA tabakası inerttir ve çıkıntı dinamiklerini etkilemez ve integrinden bağımsız hücre yapışması için serbest potansiyel bölgeleri bloke etmek içindir. BSA, hücre kenarı dinamiklerini etkileyebilecek hücre apoptozunu indüklemesini önlemek için kaplamadan önce denatüre edilmelidir.</li>
</ol>3. Görüntüleme için hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Deneyden on altı ila on sekiz saat önce, ertesi gün% 70 -% 80 birleşime ulaşmak için hücreleri plakalayın. MEF'ler için, deneyi gerçekleştirmeden bir gün önce 10 cm çapında doku kültürü plakası başına 0.7 x 106 hücre plakası. NOT: Başarılı bir çıkıntı deneyi için, hücrelerin logaritmik büyüme fazları sırasında kullanılması önemlidir. Bunu başarmak için, hücreler deney gününde% 70 -% 80 birleşme noktasına ulaşmalıdır. Daha yüksek bir hücre yoğunluğu, deney sırasında daha uzun bir yayılma süresine ve / veya bağlanmada engele neden olacaktır.</li>
	<li>Deney gününde, 10 cm çapında doku kültürü plakası başına 2 mL tripsin çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve hücreler ayrılana kadar bir doku kültürü inkübatöründe 2-3 dakika inkübe edin. Tam ortamın 5 mL'sini ekleyerek tripsini devre dışı bırakın.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve yukarıdaki gibi kaplanmış cam tabanlı bir tabakta tam ortamın 2 mL'sinde 20.000 hücre tabak yapın (bölüm 2). NOT: Kaplama için hücre sayısı, hücrelerin boyutuna ve türüne bağlıdır. Daha büyük veya daha fazla yayılmış hücre için, görüntüleme için yeterli hücreye sahip olmak için sadece 10.000 hücreyi plakalayın. Hücreden hücreye temas, hücreye özgü yayılma davranışlarını değiştirebileceğinden, dokunmayan tek hücreleri seçmek önemlidir.</li>
	<li>Cam tabanlı tabakları doku kültürü inkübatöründe kaplanmış hücrelerle 15 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Bu aşamada, hücreler fibronektin substratına yapışır ve üzerine yayılır. Hücre yayılımı sırasında çıkıntıları ölçerken, hücrelerin kaplamadan sonra ve görüntülemeden önce 15 dakika boyunca yayılmasına izin verilmelidir. Görüntüleme, kaplamadan sonra 15 dakika ila ~ 1 saat arasında bir zaman aralığında ve her durumda, hücreler göç etmeye başlamadan önce gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>4. Mikroskop kurulumu ve görüntüleme
NOT: Çeşitli canlı hücre mikroskopi sistemleri mevcuttur. Burada kullanılan sistem, CO2 ve ısıtma üniteleri ile donatılmış bir Leica AF6000 ters mikroskoptur ve bir ORCA-Flash 4.0 V2 dijital CMOS kameraya takılıdır.
<ol><li>Isıtma ünitesini görüntülemeden en az 1 saat önce açın ve 37 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>CO2 ünitesini görüntülemeden en az 10 dakika önce açın ve %5 CO2'ye ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop, kamera ve bilgisayarı açın.</li>
	<li>Mikroskop edinme yazılımını açın (bkz. Yakalanan görüntülerin kaydedileceği klasörü seçin ve bir dosya adı yazın. Her filmi yeni bir dosya olarak kaydedin.</li>
	<li>Büyütmeyi 40x kuru lens, faz kontrastlı olarak ayarlayın. Zaman aralığını 5 sn, toplam film süresi 10 dakika olarak ayarlayın.</li>
	<li>Kaplanmış hücrelerin 15 dakikalık inkübasyonundan sonra, yapıştırılmış hücrelere sahip cam tabanlı kabı adaptöre yerleştirin ve sabitleyin. Adaptörü çanak ile mikroskop aşamasındaki yuvasına yerleştirin.</li>
	<li>Çanak kapağını çıkarın ve yerine CO2 kapağını yerleştirin. CO2 vanasını açın. NOT: CO2 kapağını cam tabanlı kabın üstüne yerleştirmeden önce temiz olduğundan emin olun. Kirli bir kapak filmlerin kalitesini düşürecektir. CO2 kapağının alt tarafını, toz ve kiri temizlemek için %70 etanol ile ıslatılmış tüy bırakmayan bir mendille silin. Tüy bırakmayan kuru bir mendille ikinci kez silin.</li>
	<li>Hücreleri görüntüleyin ve görüntüleme için uygun bir hücre bulun. Hücrenin odakta olduğundan emin olun ve film alımını başlatın.</li>
</ol>5. Görüntü analizi
NOT: Görüntü analizi, aşağıdaki gibi ImageJ (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir:
<ol><li>Alınan filmi ImageJ'de açın.</li>
	<li>Ana araç çubuğundaki Düz aracı kullanarak, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, her 45°'de bir radyal düzenlemede, lamel ve hücre kenarı da dahil olmak üzere çıkıntılara dik 20 rasgele birimden oluşan sekiz satır oluşturun.</li>
	<li>Ana araç çubuğunda, Görüntü > Yığınları > Reslice'a gidin. Bu, hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini tanımlayan bir kimograf resmi verecektir (Şekil 2B). Bu eylem, sekiz satırdan her satır için ayrı ayrı gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>İlgili kimograf görüntülerinden ızgara çizgileriyle işaretlenmiş hücredeki sekiz bölgenin her birindeki çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sayısını ayıklayın ve manuel olarak sayın. Bu sayılar 10 dakikada çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sıklığını temsil eder (Şekil 2C, D). NOT: Fırfırlar, faz kontrastlı mikroskopideki karanlık görünümlerine ve hücre kenarında başlayıp hücre gövdesinin sınırında sona eren ve elde edilen filmlerde gözlemlenebilen merkezcil hareketlerine dayanarak diğer yapılardan ayırt edilebilir. Dikkat edilmesi gereken, çıkıntı, geri çekilme ve karıştırma sıklığını ölçerken, filmler nicelleştirme ve özellikle fırfırları tanımlamak için bir kontrol olarak gözlemlenmelidir.</li>
	<li>Kimografi analizi ile çıkıntı kalıcılığını, mesafesini ve hızını belirleyin. Oluşturulan kimografların her biri için, X ekseni mesafeyi ve Y ekseni zamanı temsil eder.</li>
	<li>Çıkıntı mesafesini ölçmek için 5.6.1-5.6.2 adımlarını izleyin.<ol>
<li>Çıkıntının tabanından çıkıntının en yüksek zirvesine dik bir çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek için ImageJ'de M düğmesine basın.</li>
		<li>Uzunluğu piksellerden μm'ye dönüştürmek için piksel-μm oranının bilindiğinden emin olun. NOT: μm-piksel oranı, CCD kameradaki bir pikselin fiziksel uzunluğu / toplam büyütmedir. Piksel boyutu her kamera türünün karakteristiğidir. Örneğin, bu çalışmada kullanılan kamera için piksel boyutu 6,5 μm x 6,5 μm, fiziksel uzunluk 6,5 μm ve kullandığımız büyütme 40x'tir. Bu nedenle, kameramızın μm / piksel oranı 0.1625 μm / pikseldir. Analizde, 30 piksel uzunluğundaki bir çizgi için çıkıntı mesafesi 30 piksel x 0.1625 μm / piksel = 4.875 μm olacaktır (Şekil 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Çıkıntı süresini ölçmek için (kalıcılık; bir çıkıntının geri çekilmeden önce çıkıntı yapmak için harcadığı süre), 5.7.1-5.7.2 adımlarını izleyin.<ol>
<li>Çıkıntının başlangıcından (soldan sağa) en yüksek tepe bölgesine yatay bir çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek için ImageJ'de M düğmesine basın.</li>
		<li>Uzunluğu piksellerden dakikalara dönüştürmek için piksel-minimum oranını hesaplayın. Bu değer, görüntüler arasındaki aralığa bağlıdır. NOT: Bu örnekte, görüntüler arasındaki aralık 5 sn, min/piksel oranı 0,0833 ve yatay çizgi uzunluğu 8 pikseldir. Bu nedenle, çıkıntı süresi 8 piksel x 0.0833 dakika / piksel = 0.6664 dakikadır.</li>
	</ol></li>
	<li>Geri çekilme süresini, çıkıntının tepesinin sağdaki tabanına olduğu yerden çıkıntının tabanına yatay olarak çizilen bir çizgi için çıkıntı süresine benzer şekilde ölçün ve hesaplayın ( Şekil 3'teki X2 çizgisi).</li>
	<li>Çıkıntı mesafesini çıkıntı süresine bölerek çıkıntı hızını hesaplayın. Çıkıntı mesafesini geri çekme süresine bölerek geri çekme hızını hesaplayın. Bu örnekte, çıkıntı hızı 4.875 μm / 0.6664 dakika = 7.315 μm / dak. olarak hesaplanır ve zamanı temsil eden çizgi aynı uzunlukta olduğu için geri çekme hızı aynıdır. NOT: Farklı hücre tiplerini, yani aynı proteinin vahşi tipini ve mutant yapılarını ifade eden hücreleri karşılaştırırken, kör bir analiz yapmak zorunludur, bu nedenle önyargı ortaya çıkmaz.</li>
</ol>

<ol><li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+embryonic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li>
<li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+and+elongation+factors%3A+mechanisms+and+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li>
<li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+JM+%22The+Actin+Cytoskeleton+and+the+Regulation+of+Cell+Migration.+Colloquium+series+on+building+blocks+of+the+cell%3A+cell+structure+and+function%22">The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function</a>. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).</li>
<li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li>
<li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibers--assembly%2C+dynamics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).</li>
<li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li>
<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li>
<li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED%2C+a+new+computer-assisted+motion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li>
<li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Ena%2FVASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li>
<li>Jacks laboratory protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs">http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs</a> (2021).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187(2011).</li>
<li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Abl-related+gene+%28Arg%29+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li>
<li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li>
<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
<li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+%28Arg%29+tyrosine+kinase+and+N-WASp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li>
<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Çıkıntılar, retraksiyonlar ve fırfırlardan oluşan hücre kenarı çıkıntı dinamikleri, hücre hareketliliğinde hem bir ön koşul hem de potansiyel bir hız sınırlayıcı olaydır. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntılarının dinamiklerini ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem kısa süreli görüntülemeyi mümkün kılar, önemli miktarda veri üretir, hücrelerin floresan etiketlemesini veya pahalı floresan mikroskopi ekipmanı gerektirmez ve daha fazla kaynak gerektiren yöntemler gerçekleştirmeye karar verm...

Hücre göçü, tüm canlı organizmaların gelişimini ve işlevini kontrol eden kritik bir süreçtir. Hücre göçü hem embriyogenez, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi gibi fizyolojik durumlarda hem de kanser metastazı ve otoimmün hastalık gibi patolojik durumlarda ortaya çıkar. Farklı göç olaylarında yer alan hücre tiplerindeki farklılıklara rağmen, tüm hücre hareketlilik olayları, protozoalardan memelilere evrimde korunmuş olan benzer moleküler mekanizmaları paylaşır ve çevreyi algılayabilen, sinyallere yanıt verebilen ve yanıt olarak hücre davranışını modüle edebilen ortak hücre iskeleti kontrol mekanizmalarını içerir1.
Hücre göçünde ilk aşama, hücrenin ön kenarında oldukça dinamik çıkıntıların oluşumu olabilir. Lamellipodyumun arkasında, aktin'i miyozin II aracılı kontraktiliteye bağlayan ve altta yatan substrata yapışmaya aracılık eden lamel bulunabilir. Lamellipodia, büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre adezyon reseptörleri gibi hücre dışı uyaranlar tarafından indüklenir ve plazma zarını ileriye doğru iten fiziksel kuvveti sağlayan aktin polimerizasyonu tarafından tahrik edilir2,3. Birçok sinyal ve yapısal protein buna dahil edilmiştir; Bunlar arasında, Arp 2/3 kompleksi, WASP ailesi proteinleri ve lamellipodia2,4,5'teki Formin ve Spire ailelerinin üyeleri gibi aktin düzenleyici proteinleri aktive etmek için diğer sinyallerle koordineli olarak hareket eden Rho GTPazlar bulunmaktadır.
Aktin polimerizasyonuna ek olarak, lamellipodyum ve anterior lamelde kontraktil kuvvetler üretmek için miyozin II aktivitesi gereklidir. Hücre kenarı retraksiyonları olarak da tanımlanan bu kasılmalar, hücre periferinde dendritik aktinin depolimerizasyonundan da kaynaklanabilir ve lamellipodial ön kenarı geliştirmek ve çıkıntının hücre dışı matrisin ve diğer hücrelerin esnekliğini algılamasına ve göç yönünü belirlemesine izin vermek için kritik öneme sahiptir6,7,8 . Substrata yapışamayan hücre kenarı çıkıntıları, periferik membran fırfırları, lamellipodia ve lamelin ventral yüzeyinde görünen tabaka benzeri yapılar oluşturacak ve göç yönüne göre geriye doğru hareket edecektir. Lamellipodyum substrata yapışamadığından, altında bir posterior lamellipodyum oluşur ve ilk lamellipodyumu mekanik olarak üst ventral yüzeye doğru iter. Daha önce substrata paralel olan fırfırdaki aktin filamentleri şimdi ona dik hale gelir ve fırfır şimdi ilerleyen lamellipodyumun üzerine yerleştirilir. Geriye doğru hareket eden fırfır, sitosol içine geri düşer ve lamellipodial aktinin geri dönüşümü için hücresel bir mekanizmayı temsil eder9,10.
Burada, hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin ölçümü için bir tahlil açıklıyoruz. Çıkıntı testi, hücrenin yayılma aşamasında 10 dakika boyunca tek hücre kenarı çıkıntı dinamiklerini ölçmek için hızlandırılmış video mikroskopisi kullanır. Çıkıntı dinamikleri, bu filmlerden kimografiler üretilerek analiz edilir. Prensip olarak, bir kimograf, hücre kenarı dinamiklerinin nitel bir anlayışını sağlamak için uzaysal zamansal bir grafikte hareketli parçacıkların ayrıntılı nicel verilerini verir. Hareketli parçacığın yoğunluğu, X ekseni ve Y ekseninin sırasıyla zaman ve mesafeyi temsil ettiği bir zamana karşı uzay grafiğindeki tüm görüntü yığınları için çizilir11. Bu yöntem, ayrıntılı nicel veriler elde etmek için ImageJ ile manuel bir kimograf analizi kullanır, düşük sinyal-gürültü oranı ve / veya yüksek özellik yoğunluğu durumunda filmlerden ve görüntülerden bilgi alınmasını ve faz kontrastlı ışık mikroskobu veya düşük görüntü kalitesinde elde edilen görüntülerin analizini sağlar.
Burada açıklanan hücre kenarı çıkıntı dinamiği testi hızlı, basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu nedenle ve hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterildiğinden11,12, daha fazla kaynak gerektiren yöntemler gerçekleştirmeye karar vermeden önce hücre hareketliliğinde yer alan sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Ayrıca, sitoiskelet proteinlerinin genetik manipülasyonlarının (nakavt, nakavt veya kurtarma yapıları) basit bir platform kullanarak sitoiskelet dinamiklerini nasıl etkilediğinin nicel ölçümünü de sağlar. Tahlil, hücre göçü bağlamında sitoiskelet dinamiklerini araştırmak için öğretici bir modeldir ve hücre hareketliliğinin altında yatan mekanizmaların ve moleküllerin aydınlatılması için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>10 cm hücre kültürü plakaları</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiye Eagle medium (DMEM)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>01-055-1A</td><td>Medium, yüksek glikoz (4.5 g/L D-glikoz) içerirDulbecco</td></tr><tr><td>' s fosfat tamponlu salin (1xDPBS)</td><td>Biyolojik Endüstriler, İsrail</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Biyolojik Endüstriler, İsrail</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>İnsan plazmasından fibronektin, sıvı, %0.1, hücre kültürü için uygun</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt tabaklar</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35 mm cam alt çanak, çanak boyutu 35 mm, kuyu boyutu 20 mm, # 1.5 kapak camı (0.16-0.19 mm).</td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>NIH</td><td></td><td>Feely şu adreste mevcuttur: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>ORCA-Flash 4.0 V2 dijital CMOS ile donatılmış mikroskop edinme yazılımı</td></tr><tr><td>Leica AF6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Ters parlak alan mikroskobu (40x, NA 1.3 ) faz kontrastlı optikler, bir inkübatör ve LAS AF toplama yazılımına sahip CO2 ünitesi ile donatılmıştır. ORCA-Flash 4.0 V2 dijital CMOS kamera.</td></tr><tr><td>L-glutamin çözeltisi</td><td>Biyolojik Endüstriler, İsrail</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V2 dijital CMOS kamera</td><td>Hamamatsu Fotonik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin çözeltisi</td><td>Biyolojik Endüstriler, İsrail</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi B (% 0.25), EDTA (% 0.05)</td> <td>Biyolojik Endüstriler, İsrail</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı hücre mikroskobu ile yayılma sırasında hücre-kenar Çıkıntı dinamiğinin Ölçülmesi

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Çok hücreli organizmaların gelişimi ve homeostazı, hücre göçünün koordineli bir şekilde düzenlenmesine dayanır. Hücre göçü, dokuların yapımında ve yenilenmesinde önemli bir olaydır ve embriyonik gelişimde, immünolojik yanıtlarda ve yara iyileşmesinde kritik öneme sahiptir. Hücre hareketliliğinin düzensizliği, kronik inflamasyon ve kanser metastazı gibi patolojik bozukluklara katkıda bulunur. Hücre göçü, doku invazyonu, akson ve dendrit büyümesi, aktin polimerizasyonu aracılı hücre kenarı çıkıntıları ile başlar. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin görüntülenmesi ve kantitatif analizi için basit, verimli, zaman kazandıran bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar gibi hücre kenarı membran dinamiklerinin ayrık özelliklerini ölçer ve anahtar aktin düzenleyicilerinin manipülasyonlarının çeşitli bağlamlarda hücre kenarı çıkıntılarını nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Şekil 2'de<im...

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Hücre kenarı çıkıntı testinin hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, hücre hareketliliğinde rol oynayan kritik proteinleri ve sinyal mekanizmalarını tanımlamak için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Yöntem hızlı, basit, uygun maliyetlidir ve floresan etiketleme veya pahalı bir floresan mikroskobu kullanma gerektirmez.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Michal Gendler olacak. Bir cam alt kabın ortasına iki mililitre normal hidroklorik asit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bulaşığı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın.PBS'de mililitre konsantrasyon başına 10 mikrogramda fibronektini seyreltin ve cam merkez kabına 200 mikrolitre seyreltilmiş çözelti ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. %1 BSA çözeltisi ve PBS hazırlayın ve 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.Önceden ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe ederek çözeltiyi denatüre edin. Kaplamalı cam alt kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. İki mililitre denatüre BSA çözeltisi ekleyin ve çanağı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Cam kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. 10 santimetre çapında doku kültürü plakası başına 0,7 milyon hücrede 16 ila 18 saatlik deneyden önce% 70 ila% 80 akıcılık elde etmek için. Ertesi gün, doku kültürü plakasına iki mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreler ayrılana kadar iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın.Tripsini inaktive etmek için ortamın beş mililitresini ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak, hücreleri sayın ve bir alt tabaktaki tam ortamın iki mililitresinde 20.000 hücreyi tabaklayın. Daha sonra çanağı 15 dakika boyunca bir inkübatörde kaplanmış hücrelerle inkübe edin.Isıtma ünitesini açın ve görüntülemeden bir saat önce 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ayrıca, karbondioksit ünitesini açın ve görüntülemeden 10 dakika önce% 5'e ayarlayın. Mikroskop ve kamerayı açın.Bilgisayarı açın ve mikroskop edinme yazılımını açın. Büyütmeyi 40X kuru lens faz kontrastına ayarlayın. Toplam film süresini beş saniyelik bir zaman aralığıyla 10 dakika olarak ayarlayın.15 dakikalık inkübasyondan sonra, yapıştırılmış hücrelere sahip cam alt kabı bir adaptöre yerleştirin ve sabitleyin. Adaptörü çanak ile mikroskop aşamasındaki yuvalara yerleştirin. Çanak kapağını çıkarın, karbondioksit kapağını yerleştirin ve karbondioksit valfini açın.Görüntüleme için uygun bir hücre bulun. Hücreye odaklandıktan sonra film edinimine başlayın. Görüntü analizini gerçekleştirmek için, görüntü analiz yazılımında düz aracı seçin ve lamel ve hücre kenarı da dahil olmak üzere her 45 derecede radyal bir düzenlemede çıkıntılara dik 20 rastgele birimden oluşan sekiz satır yapın.Ana araç çubuğunda görüntüye gidin, Yığınlar'ı seçin ve ardından hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini açıklayan bir kimograf resmi oluşturmak için Reslice'a tıklayın. Kimograf görüntülerini kullanarak, ızgara çizgileriyle işaretlenmiş hücredeki sekiz bölgenin her birindeki çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sayısını ayıklayın ve manuel olarak sayın. Bu sayılar, 10 dakikada çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sıklığını temsil eder.Kimografi analizi ile çıkıntı kalıcılığını, mesafesini ve hızını belirler. Çıkıntı mesafesini belirlemek için, çıkıntının tabanından çıkıntının en yüksek zirvesine dik çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek ve piksel-mikrometre oranının uzunluğu mikrometre cinsinden dönüştürdüğünün bilindiğinden emin olmak için M tuşuna basın.Çıkıntılar, reaksiyonlar ve fırfırlar 10 dakikada manuel olarak yapıldı ve çıkıntılar ve retraksiyonlar için elde edilen ortalama sıklık fırfırlar için 5.1 ve 2.1 idi. Temsili kimograf, yaklaşık 4.8 mikrometrelik bir çıkıntı mesafesine ve yaklaşık 0.6 dakikalık bir çıkıntı süresine sahipti. Analizin dışında bırakılması gereken bir hücre örneği temsil edilir.Kimografi analizi, hücrenin yayılma evresinde bulunmadığını ve net bir zar çıkıntısı göstermediğini ortaya koydu. En önemli şey, görüntüleme için doğru hücreleri seçmektir. Uygun bir hücre yayılma aşamasında olmalı ve hücre-hücre iletişimi ve sinyallemesini önlemek için diğer hücrelere dokunmamalıdır.Yöntem, hücre migrasyon tahlilleri gerektiren daha fazla sonuç almaya karar vermeden önce hücre hareketliliğini içeren sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön araç olarak kullanılabilir.

measuring-cell-edge-protrusion-dynamics-during-spreading-using-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri mikroskobik görüntüleme iskelet yapıları dinamik değişimlere karakterizasyonu sağlar. Sabit örneklerinde kullanan teknolojilerden farklı olarak, bu yöntem önce aynı hücrelerde aktin hücre iskeletinin temporal değişikliklerin ayrıntılı bir değerlendirme sırasında, çeşitli fiziksel, farmakolojik veya inflamatuvar uyaranlara sonra sağlar.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Canlı hücrelerdeki mekanik zorlanmaya gerçek zamanlı tepkilerin ölçülmesine izin vermek için özel bir motor tahrikli mekanik aktüatör kullanılarak yeni bir görüntüleme protokolü geliştirilmiştir. Mekanobiyoloji ile ilgili olarak, sistem konfokal veya atomik kuvvet mikroskobu ile neredeyse gerçek zamanlı görüntülemeye izin verirken %20'ye kadar suşlar uygulayabilir.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Burada, podosomes uyumlu bir filmde filmin topografik görüntülerin otomatik Analize hazırlanması uygulamak çıkıntı kuvvetleri değerlendirmek için kullanılan Deneysel teknikler ayrıntılı.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Daha önce tasarlanmış bir cihazı kullanarak bağlı hücrelere mekanik gerilme uygulamak için, bu yazıda bir yeniden tasarlanan substratum geometrisi ve 100 x yağ daldırma amacı ile gergin hücrelerin yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüleme için özelleştirilmiş bir cihaz açıklanmaktadır.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Bu yöntem, hücresel yapışmanın erken dinamiklerini ölçmek ve ankraja bağlı hücrelerin fibronektin üzerine yayılması için yararlıdır. Ayrıca, bu tetkik hücre yayılımı ve / veya hücre adezyonu ile ilgili hücre içi sinyal yolları üzerinde değişmiş redoks homeostaz etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.

Mikro Desenli Hücrelerde Hücresel Eksositozun Spatiotemporal Parametrelerinin Ölçülmesi

Bu protokolde canlı hücre mikroskopisi esas alınarak yapılan test yayılan bir hücrenin deneysel prosedürlerini sunuyoruz. Floresan etiketli hücrelerin tarafsız segmentasyonu ve hücre yayılması sırasında lamellipodia dinamiklerinin nicel analizi için açık kaynaklı bir hesaplama aracı sunuyoruz.

Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi

Bu makalede, Otomatik çok kanallı görüntüleme ve mekanobiyolojik analizin Evet ilişkili proteinin (YAP) mekano duyarlılığını aydınlatmasını sağlayan entegre çok fonksiyonlu ve kullanıcı tarafından programlanabilir bir sistemin nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılı bir adım adım protokol sunulmaktadır.

Çok Fonksiyonlu Bir Sistem Kullanarak İnsan Kanseri ve Normal Hücrelerde Evet İlişkili Proteinin Tamamen Optik Mekanobiyoloji Sorgulaması

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Öğrenin hücre kenarı çıkıntı analizi ile hücre göçü dinamiklerini incelemeyi. Bu yöntem, hücre hareketliliğindeki kritik proteinleri ve sinyal mekanizmalarını belirlemeye yardımcı olur.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet