Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Hücre kenarı çıkıntı testinin hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, hücre hareketliliğinde rol oynayan kritik proteinleri ve sinyal mekanizmalarını tanımlamak için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Yöntem hızlı, basit, uygun maliyetlidir ve floresan etiketleme veya pahalı bir floresan mikroskobu kullanma gerektirmez.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Michal Gendler olacak. Bir cam alt kabın ortasına iki mililitre normal hidroklorik asit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bulaşığı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın.

PBS'de mililitre konsantrasyon başına 10 mikrogramda fibronektini seyreltin ve cam merkez kabına 200 mikrolitre seyreltilmiş çözelti ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. %1 BSA çözeltisi ve PBS hazırlayın ve 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.

Önceden ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe ederek çözeltiyi denatüre edin. Kaplamalı cam alt kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. İki mililitre denatüre BSA çözeltisi ekleyin ve çanağı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Cam kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. 10 santimetre çapında doku kültürü plakası başına 0,7 milyon hücrede 16 ila 18 saatlik deneyden önce% 70 ila% 80 akıcılık elde etmek için. Ertesi gün, doku kültürü plakasına iki mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreler ayrılana kadar iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın.

Tripsini inaktive etmek için ortamın beş mililitresini ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak, hücreleri sayın ve bir alt tabaktaki tam ortamın iki mililitresinde 20.000 hücreyi tabaklayın. Daha sonra çanağı 15 dakika boyunca bir inkübatörde kaplanmış hücrelerle inkübe edin.

Isıtma ünitesini açın ve görüntülemeden bir saat önce 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ayrıca, karbondioksit ünitesini açın ve görüntülemeden 10 dakika önce% 5'e ayarlayın. Mikroskop ve kamerayı açın.

Bilgisayarı açın ve mikroskop edinme yazılımını açın. Büyütmeyi 40X kuru lens faz kontrastına ayarlayın. Toplam film süresini beş saniyelik bir zaman aralığıyla 10 dakika olarak ayarlayın.

15 dakikalık inkübasyondan sonra, yapıştırılmış hücrelere sahip cam alt kabı bir adaptöre yerleştirin ve sabitleyin. Adaptörü çanak ile mikroskop aşamasındaki yuvalara yerleştirin. Çanak kapağını çıkarın, karbondioksit kapağını yerleştirin ve karbondioksit valfini açın.

Görüntüleme için uygun bir hücre bulun. Hücreye odaklandıktan sonra film edinimine başlayın. Görüntü analizini gerçekleştirmek için, görüntü analiz yazılımında düz aracı seçin ve lamel ve hücre kenarı da dahil olmak üzere her 45 derecede radyal bir düzenlemede çıkıntılara dik 20 rastgele birimden oluşan sekiz satır yapın.

Ana araç çubuğunda görüntüye gidin, Yığınlar'ı seçin ve ardından hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini açıklayan bir kimograf resmi oluşturmak için Reslice'a tıklayın. Kimograf görüntülerini kullanarak, ızgara çizgileriyle işaretlenmiş hücredeki sekiz bölgenin her birindeki çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sayısını ayıklayın ve manuel olarak sayın. Bu sayılar, 10 dakikada çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sıklığını temsil eder.

Kimografi analizi ile çıkıntı kalıcılığını, mesafesini ve hızını belirler. Çıkıntı mesafesini belirlemek için, çıkıntının tabanından çıkıntının en yüksek zirvesine dik çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek ve piksel-mikrometre oranının uzunluğu mikrometre cinsinden dönüştürdüğünün bilindiğinden emin olmak için M tuşuna basın.

Çıkıntılar, reaksiyonlar ve fırfırlar 10 dakikada manuel olarak yapıldı ve çıkıntılar ve retraksiyonlar için elde edilen ortalama sıklık fırfırlar için 5.1 ve 2.1 idi. Temsili kimograf, yaklaşık 4.8 mikrometrelik bir çıkıntı mesafesine ve yaklaşık 0.6 dakikalık bir çıkıntı süresine sahipti. Analizin dışında bırakılması gereken bir hücre örneği temsil edilir.

Kimografi analizi, hücrenin yayılma evresinde bulunmadığını ve net bir zar çıkıntısı göstermediğini ortaya koydu. En önemli şey, görüntüleme için doğru hücreleri seçmektir. Uygun bir hücre yayılma aşamasında olmalı ve hücre-hücre iletişimi ve sinyallemesini önlemek için diğer hücrelere dokunmamalıdır.

Yöntem, hücre migrasyon tahlilleri gerektiren daha fazla sonuç almaya karar vermeden önce hücre hareketliliğini içeren sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön araç olarak kullanılabilir.