Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi
1 Kasım 2021
Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.
Hücre kenarı çıkıntı testinin hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, hücre hareketliliğinde rol oynayan kritik proteinleri ve sinyal mekanizmalarını tanımlamak için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Yöntem hızlı, basit, uygun maliyetlidir ve floresan etiketleme veya pahalı bir floresan mikroskobu kullanma gerektirmez.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Michal Gendler olacak. Bir cam alt kabın ortasına iki mililitre normal hidroklorik asit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bulaşığı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın.
PBS'de mililitre konsantrasyon başına 10 mikrogramda fibronektini seyreltin ve cam merkez kabına 200 mikrolitre seyreltilmiş çözelti ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. %1 BSA çözeltisi ve PBS hazırlayın ve 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.
Önceden ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe ederek çözeltiyi denatüre edin. Kaplamalı cam alt kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. İki mililitre denatüre BSA çözeltisi ekleyin ve çanağı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Cam kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. 10 santimetre çapında doku kültürü plakası başına 0,7 milyon hücrede 16 ila 18 saatlik deneyden önce% 70 ila% 80 akıcılık elde etmek için. Ertesi gün, doku kültürü plakasına iki mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreler ayrılana kadar iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın.
Tripsini inaktive etmek için ortamın beş mililitresini ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak, hücreleri sayın ve bir alt tabaktaki tam ortamın iki mililitresinde 20.000 hücreyi tabaklayın. Daha sonra çanağı 15 dakika boyunca bir inkübatörde kaplanmış hücrelerle inkübe edin.
Isıtma ünitesini açın ve görüntülemeden bir saat önce 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ayrıca, karbondioksit ünitesini açın ve görüntülemeden 10 dakika önce% 5'e ayarlayın. Mikroskop ve kamerayı açın.
Bilgisayarı açın ve mikroskop edinme yazılımını açın. Büyütmeyi 40X kuru lens faz kontrastına ayarlayın. Toplam film süresini beş saniyelik bir zaman aralığıyla 10 dakika olarak ayarlayın.
15 dakikalık inkübasyondan sonra, yapıştırılmış hücrelere sahip cam alt kabı bir adaptöre yerleştirin ve sabitleyin. Adaptörü çanak ile mikroskop aşamasındaki yuvalara yerleştirin. Çanak kapağını çıkarın, karbondioksit kapağını yerleştirin ve karbondioksit valfini açın.
Görüntüleme için uygun bir hücre bulun. Hücreye odaklandıktan sonra film edinimine başlayın. Görüntü analizini gerçekleştirmek için, görüntü analiz yazılımında düz aracı seçin ve lamel ve hücre kenarı da dahil olmak üzere her 45 derecede radyal bir düzenlemede çıkıntılara dik 20 rastgele birimden oluşan sekiz satır yapın.
Ana araç çubuğunda görüntüye gidin, Yığınlar'ı seçin ve ardından hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini açıklayan bir kimograf resmi oluşturmak için Reslice'a tıklayın. Kimograf görüntülerini kullanarak, ızgara çizgileriyle işaretlenmiş hücredeki sekiz bölgenin her birindeki çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sayısını ayıklayın ve manuel olarak sayın. Bu sayılar, 10 dakikada çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sıklığını temsil eder.
Kimografi analizi ile çıkıntı kalıcılığını, mesafesini ve hızını belirler. Çıkıntı mesafesini belirlemek için, çıkıntının tabanından çıkıntının en yüksek zirvesine dik çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek ve piksel-mikrometre oranının uzunluğu mikrometre cinsinden dönüştürdüğünün bilindiğinden emin olmak için M tuşuna basın.
Çıkıntılar, reaksiyonlar ve fırfırlar 10 dakikada manuel olarak yapıldı ve çıkıntılar ve retraksiyonlar için elde edilen ortalama sıklık fırfırlar için 5.1 ve 2.1 idi. Temsili kimograf, yaklaşık 4.8 mikrometrelik bir çıkıntı mesafesine ve yaklaşık 0.6 dakikalık bir çıkıntı süresine sahipti. Analizin dışında bırakılması gereken bir hücre örneği temsil edilir.
Kimografi analizi, hücrenin yayılma evresinde bulunmadığını ve net bir zar çıkıntısı göstermediğini ortaya koydu. En önemli şey, görüntüleme için doğru hücreleri seçmektir. Uygun bir hücre yayılma aşamasında olmalı ve hücre-hücre iletişimi ve sinyallemesini önlemek için diğer hücrelere dokunmamalıdır.
Yöntem, hücre migrasyon tahlilleri gerektiren daha fazla sonuç almaya karar vermeden önce hücre hareketliliğini içeren sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön araç olarak kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma; çıkıntılar, geri çekilmeler ve kıvrımlar dahil olmak üzere, yayılan hücrelerin dinamik parametrelerini incelemek için bir hücre kenarı çıkıntısı testi sunmaktadır. Bu yöntem, hücre göçü ile ilişkili olması nedeniyle özellikle önemlidir ve hücre hareketliliğinde rol oynayan kritik proteinlerin ve sinyal mekanizmalarının tanımlanmasına yardımcı olur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre göçü
- Hücre hareketliliği
- Sitoskeletal dinamikler
Arka Plan
- Hücre kenarı çıkıntıları ile hücre göçü arasında bir korelasyon vardır.
- Deney düzeneği basit ve düşük maliyetlidir; ayrıca floresan işaretleme gerektirmez.
- Çıkıntıların anlaşılması, hücresel davranışlar ve motiliteyi yönlendiren mekanizmalar hakkında bilgiler sağlayabilir.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre kenarı çıkıntısı testi
- Cam tabanlı kapta yapışmış hücreler
- Çıkıntıların değerlendirilmesi için kimografi analizi
Ana Sonuçlar
- Ortalama çıkıntı sıklığı 10 dakika için 5,1 iken, fırfırların sıklığı 2,1 olarak belirlenmiştir.
- Kimografi analizi, yaklaşık 4,8 mikrometreye ulaşan bir çıkıntı mesafesi ortaya koymuştur.
- Doğru sonuçlar elde etmek için yayılma fazında uygun hücrelerin seçilmesinin önemi saptanmıştır.
Sonuçlar
- Çalışma, hücre hareketliliği dinamiklerini değerlendirmek için erişilebilir bir analiz yöntemi sunmaktadır.
- Bu yöntem, daha karmaşık migrasyon analizleri gerçekleştirilmeden önce ön değerlendirme aracı olarak hizmet eder.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Hücre kenarı çıkıntı dinamikleri, hücre hareketliliğinin erken ve öngörücü bir okuması olarak hizmet ederek, kaynak yoğun göç deneylerine geçmeden öncele sitoskeletal regülatörlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu yöntem, moleküler pertürbasyonları fonksiyonel membran dinamikleriyle ilişkilendirerek hedef doğrulamayı destekler ve keşif iş akışlarında mekanistik risk azaltma sağlar. Etiketsiz ve maliyet etkin tasarımı; yara iyileşmesi, bağışıklık tepkisi ve kanser metastazı ile ilgili sinyal yollarının yüksek kapasiteli taranmasını kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Aktin düzenleyicileri ve mobilite yolaklarına ilişkin terapötik hipotezleri sorgulamak için çıkıntı frekansını, kalıcılığını, mesafesini ve hızını ölçer.
- Operasyonel Değer: Hücresel iskelet dinamiklerini etkileyen protein nakavtlarının veya inhibitörlerin hızlı ve etiketsiz taranmasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Çıkıntı dinamiklerini hücre migrasyonu ile ilişlendirerek, erken fenotipik okumalar üzerinden karar verme süreçlerini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Farklı deneysel koşullar arasında standartlaştırılmış karşılaştırmalar için kymograf türevli nicel metrikler (protrüzyon sayısı, mesafe, hız) üretir.
- Operasyonel Değer: Faz kontrastlı mikroskopi ve erişilebilir görüntü analiz araçları kullanarak, uzmanlaşmış ekipmanlara veya floresan problara olan bağımlılığı azaltır.
- Ölçeklenebilirlik: Hücre başına sekiz membran bölgesinden yapılan radyale örnekleme yoluyla çoklu koşul testlerini destekleyerek veri sağlamlığını artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Moleküler hedef modülasyonu ile fibroblastlar veya immün hücreler gibi hastalıkla ilişkili sistemlerdeki fonksiyonel hücresel davranış arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen fenotipik etkilerin, sekonder sitotoksisite veya adhezyon kusurlarından ziyade, değişen protrusion dinamiklerinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını netleştirir.
- Biyobelirteç Uyumu: Protrusion parametreleri, in vivo motilite veya invazyon fenotipleriyle ilişkilendirildiğinde translasyonel biyobelirteçler olarak hizmet edebilir.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu analiz, hedef etkileşiminden fenotipik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygun olup, biyokimyasal tarama ile fonksiyonel hücre bazlı analizler arasında bir köprü görevi görmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Aktin düzenleyicilerinin (örneğin, Arp2/3, kofilin, Rho GTPazlar) genetik veya farmakolojik manipülasyonlarının, motilite için bir vekil parametre olarak protrüzyon dinamiklerini nasıl etkilediğini test eder.
- Tarama: Bileşik kütüphaneleri veya genetik taramalar arasında karşılaştırmaya olanak tanıyan tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar (örneğin, 10 dakika başına protrüzyon sayısı, protrüzyon hızı) sağlar.
- Analitik: Kimografi, membran dinamiklerinin zamansal ve mekansal çözünürlüğünü sağlayarak mekanistik modelleme için kritik olan kinetik parametrelerin çıkarılmasına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Hedef hitlerin, primer veya hastalıkla ilişkili hücre hatlarında tutarlı protrüzyon fenotipleri ürettiğini doğrulayarak preklinik modellere geçişteki sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Gelişim, inflamasyon veya onkolojide hücre motilitesini araştıran projeler genelinde tekrarlanan kullanım için standartlaştırılmış, düşük maliyetli bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Moleküler pertürbasyonları ölçülebilir membran dinamikleriyle doğrudan ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Floresan etiketleme ve pahalı görüntüleme donanımı ihtiyacını ortadan kaldırarak analiz bariyerini düşürür ve erişilebilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Hücre migrasyonuna yönelik öngörücü, fenotipik bir çapa kullanarak hedefleri erken aşamada filtreleyip sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Protrüzyon dinamikleri ile migrasyon potansiyeli arasındaki uyumluluğa dayanarak, hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre görüntüleme, kimograf oluşturma ve manuel veya yarı otomatik çıkıntı analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Faz kontrast mikroskobuna ve yeniden dilimleme (reslice) ile kimograf oluşturma yeteneğine sahip görüntü analiz yazılımına bağlıdır.
- Tekrarlanabilirlik için hücre ekim yoğunluğunun, substrat kaplamasının (fibronektin/BSA) ve çevresel kontrollerin (37°C, %5 CO2) standartlaştırılmasını gerektirir.
- Uygun yayılma evresindeki hücreleri tanımlamak ve çıkıntı ölçümlerini yanıltan konfluent veya temas halindeki hücrelerden kaçınmak için eğitim gerektirir.
- 2D substrata ilişkili yayılma ile sınırlıdır; 3D invazyonu veya kısıtlı migrasyon fenotiplerini tam olarak yakalayamayabilir.
