Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için
March 5th, 2017
Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, proteinin yüksek çözünürlüklü yapı tayinine yönelik ilk adım olarak, negatif leke iletimli elektron mikroskobu ile bir nanodisk membran yüzeyine bir dışsal membran proteininin bağlanmasını görselleştirmektir. Bu yöntem, hücresel zarların içinde ve üzerinde meydana gelen protein aktiviteleri ile ilgili olduğu için çeşitli araştırma alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, proteinin zarlara bağlanamaması durumunda nanodisk formlarının karakteristik yığınlarıdır.
Bu yığınlar, transmisyon elektron mikroskobu ile açıkça görülebilir. Bu tekniğin anlamı, bileşiklerin membran protein etkileşimlerini bloke etme veya etkinleştirme yeteneği için kolayca taranabilmesi nedeniyle ilaç geliştirmeye doğru uzanır. Bu yöntem, monotopik proteinin zarınıza bağlanması için en uygun koşullar hakkında bilgi sağlayabilse de, aynı zamanda protein nanodisk kompleksinin düşük çözünürlüklü bir yapısını da sağlar.
Prosedüre başlamak için, MSP1E3D1 gibi membran iskele proteinini eksprese edin ve saflaştırın. Daha sonra, metal iğneli bir cam şırınga kullanarak, kloroformda mililitre POPC başına 305 mikrolitre 25 miligram cam yuvarlak tabanlı bir şişeye dağıtın. Kloroformu, çeker ocakta hafif bir nitrojen gazı akışı altında buharlaştırın.
Kalan lipiti gece boyunca bir vakumlu desikatörde kurutun. Daha sonra kurutulmuş lipit kekini, deterjan olarak 100 milimolar sodyum kolat ile zenginleştirilmiş 200 mikrolitre MSP standart tamponunda çözün. Tamponda 50 milimolar POPC'lik bir süspansiyon elde etmek için karışımı şeffaf olana kadar vorteksleyin.
Daha sonra, beş gram hidrofobik boncukları 30 mililitre% 100 metanol, ardından 40 mililitre ultra saf su ve son olarak 10 mililitre MSP standart tamponu ile yıkayın. Boncukları dört santigrat derecede 15 mililitre standart tamponun altında saklayın. Daha sonra 190 mikrolitre 0.124 milimolar MSP1E3D1 çözeltisi ve 61.5 mikrolitre 50 milimolar POPC süspansiyonunu tamponda birleştirin, bu da MSP'nin POPC'ye bir ila 130 molar oranı ve 25 milimolar'lık bir sodyum kolat konsantrasyonu ile sonuçlanır.
MSP başına ideal lipid oranı, her lipid tipi ve MSP lensi seçimine göre değişir ve homojen bir nanodisk hazırlığı elde etmek için optimize edilmelidir. Karışımı ıslak buz üzerinde bir saat inkübe edin. Daha sonra çözeltiyi, nanodiskin kendi kendine montajını başlatmak için mililitre sulandırma karışımı başına 0.5 gram yıkanmış hidrofobik fasulye içeren bir tüpe ekleyin.
Karışımı dakikada yedi ila sekiz dönüşle 16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra, boncukların yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Süpernatanı, boyut dışlama kromatografisi yapmaya hazır olana kadar dört santigrat derecede çıkarın ve saklayın.
Boyut dışlama kromatografisinden önce, karışımı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 13.000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve peleti atın. 280 nanometredeki taban çizgisi stabil olana kadar bir boyut dışlama kromatografi kolonunu MSP standart tamponu ile dengeleyin.
Süpernatanı kolona enjekte edin ve ürünü 0,5 mililitrelik fraksiyonlar halinde toplayın. UV vis spektrofotometresi ile 280 nanometrede fraksiyonların absorbansını ölçün. Seçilen MSP için molar sönme katsayısını kullanarak nanodisklerin konsantrasyonunu hesaplayın.
Denatüre olmayan jel elektroforezi gerçekleştirmek için, önce 15 mikrolitre numuneyi beş mikrolitre uygun yükleme tamponu ile karıştırın. Katot tankını hafif katot tamponu ile ve anot tankını çalışan tampon ile doldurun. Numuneyi dört ila %16'lık bir Bis-Tris jele yükleyin ve çalışmaya başlayın.
Jeli jel üreticisinin talimatlarına göre boyayın. Protein olarak beş lipoksijenaz içeren bir nanodisk monotopik protein kompleksinin hazırlanmasına başlamak için, 1.5 milimolar kalsiyum klorür ile zenginleştirilmiş bir grup MSP standart tamponu hazırlayın. 5LO proteinini eksprese edin ve saflaştırın.
Hemen kalsiyumla zenginleştirilmiş MSP standart tamponunda 0.8 mikromolar 5LO ve 0.8 mikromolar nanodisklerden oluşan 100 mikrolitrelik bir karışım hazırlayın. Monotopik bir proteinaz olan beş lipoksijenaz örneğimiz, zara bağlanacak kalsiyum miktarlarına bağlıdır. 5LO oldukça hassastır ve hazırlandıktan sonraki birkaç saat içinde kullanılmalıdır.
Karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Elde edilen nanodisk protein kompleksi örneğini dört santigrat derecede bir aya kadar saklayın. TEM analizine hazırlanmaya başlamak için, bir gram fosfotungstat sodyum tuzunu oda sıcaklığında 50 mililitre ultra saf suda çözün.
Bir molar sodyum hidroksit çözeltisi ile çözelti pH'ını 7.4'e ayarlayın. Fosfotungstat sodyum çözeltisini 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün ve çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın. Daha sonra, ızgara yüzeyini hidrofilik hale getirmek için 400 gözenekli karbon kaplı bakır ızgaranın 30 miliamperde 20 saniye boyunca kızdırma deşarjı.
Nanodisk monotopik protein kompleksi örneğinin 2,5 ila beş mikrolitresini ızgaraya yerleştirin ve numunenin 30 saniye oturmasına izin verin. Ardından, ızgaradaki fazla çözeltiyi temizlemek için filtre kağıdı kullanın. Hemen bir damla fosfotungstat sodyum çözeltisi uygulayın ve çözeltiyi 30 saniye
bekletin.Fazla çözeltiyi kurulayın ve ızgaranın kurumasına izin verin. 120 ila 200 kilovolt arasında hızlandırılmış bir voltajla transmisyon elektron mikroskobu gerçekleştirin. Uzun yığınları gösteren görüntüleri sonraki görüntü işlemenin dışında tutun.
Seçilen görüntüler için, sınıf ortalamalarını belirlemek ve nanodisk monotopik proteinin düşük çözünürlüklü bir 3D modelini oluşturmak için standart işleme yöntemlerini kullanın. Bu yöntem kullanılarak, boş nanodiskler, membran iskele proteinlerinin lipitlere oranı bire 130 olacak şekilde hazırlandı. Boyut dışlama kromatografisi sırasında sadece bir ana tepe gözlendi ve mavi doğal jel elektroforezinde sadece bir bant gözlendi.
Boş nanodiskler bir fosfotungstat sodyum tuzu çözeltisi ile muamele edildiğinde, istifleme indüklenir. Bu uzun yığınlar daha sonra TEM tarafından gözlemlenebilir. Bu istifleme, fosfotungstat sodyum çözeltisinin uygulanmasından önce nanodisk çözeltisine kalsiyum iyonlarının dahil edilmesiyle bozulmadı.
Beş lipoksijenaz gibi monotopik bir protein nanodisk yüzeyine bağlandığında, istifleme, protein tarafından stearik tıkanıklık ile engellenir. Nanodiskin her iki tarafı, bir ila bir ve iki ila bir 5LO nanodisk komplekslerinin oluşumuna izin verecek şekilde bağlanma için kullanılabilir. İki ila bir 5LO nanodisk kompleksinin örneği, bire bir örnekten daha az istifleme sergiledi.
5LO bağlanması, kalsiyum iyonlarının varlığını gerektirir. Bu, 5LO'nun zar yüzeylerine bağlanmadığını gösteren kalsiyum içermeyen 5LO ve nanodisklerin bir karışımında istiflenmenin gözlemlenmesiyle doğrulandı. Monotopik protein ve nanodiskler hazırlandıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa proteinin zarınıza bağlanmasının değerlendirilmesi bir öğleden sonra yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, doğru MSP uzunluğunu seçmek için proteinin nanodisk üzerindeki alanını tahmin etmek önemlidir. İyi eşleşen boyutlar için, diskin her iki tarafında bir tane olmak üzere maksimum iki ekstrinsik protein bağlanabilir. Ayrıca, maksimum istiflemeyi sağlamak için negatif stand için fosofotenin sodyum tuzunun kullanılması da önemlidir, çünkü bağlama, yığınların yokluğunun monotopik bir protein içermeyen bir numunenin uzun yığınlarıyla karşılaştırılmasıyla doğrulanır.
Lipozomlar yerine nanodisklerin kullanılması, numune homojenliği boyutu veya moleküler yapı ile ilgili ek soruları yanıtlamak için dinamik ışık saçılımı, küçük açılı x-ışını saçılımının kullanılmasını sağlar. Bir nanodiske bağlı monotopik zar proteininin düşük çözünürlüklü 3D yapısı, bu bağlı proteinlerin yüksek çözünürlüklü yapısına giden yolda kolayca erişilebilir bir ilk adım olabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, ekstrinsik zar proteinlerinin nanodisk zarlarına bağlanmasını görselleştirmek için negatif boyalı iletim elektron mikroskobu kullanımını gösteren bir yöntem sunmaktadır. Teknik, protein bağlanmasının nanodisklerin karakteristik yığılmasını nasıl önleyebileceğini ortaya koyarak, protein-zar etkileşimlerine dair içgörüler sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Yapısal Biyoloji
Arka Plan
- Ekstrinsik proteinler, hücresel zar fonksiyonlarında önemli roller oynamaktadır.
- Negatif boyalı iletim elektron mikroskobu, değerli bir görüntüleme tekniğidir.
- Nanodiskler, protein etkileşimlerini incelemek için model zarlar olarak kullanılır.
- Protein bağlanmasını anlamak, ilaç geliştirme ve yapısal biyoloji için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Ekstrinsik proteinlerin nanodisk zarlarına bağlanmasını görselleştirmek.
- Protein etkileşimlerinin ilaç taraması için olan etkilerini keşfetmek.
- Protein-nanodisk kompleksinin düşük çözünürlüklü yapısını sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Negatif boyalı iletim elektron mikroskobu.
- Nanodisk zarlarının hazırlanması.
- Ekstrinsik proteinler için bağlanma analizleri.
- Nanodisk yığılma kalıplarının analizi.
Ana Sonuçlar
- Ekstrinsik proteinlerin bağlanması, nanodisk yığılmalarının oluşumunu önler.
- Proteinler bağlanmadığında karakteristik yığılma kalıpları görülebilir.
- Yöntem, protein bağlanması için optimal koşulları anlamak için içgörüler sağlar.
- İlaç geliştirmedeki potansiyel uygulamalar vurgulanmaktadır.
Sonuçlar
- Bu teknik, protein-zar etkileşimlerini incelemek için etkilidir.
- Yüksek çözünürlüklü yapı tayini için bir yol sunar.
- Bulgular, zar protein fonksiyonlarını anlamak için önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables visualization of extrinsic membrane protein binding to nanodiscs via negative stain TEM, where protein binding prevents characteristic nanodisc stacking. It provides a rapid, low-resolution structural readout to de-risk target validation and inform early-stage drug screening for membrane-associated proteins. The approach supports go/no-go decisions by confirming binding under defined lipid and ionic conditions before committing resources to high-resolution structural work.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms membrane binding of extrinsic proteins through direct visualization of inhibited nanodisc stacking.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein-lipid interactions in a controlled membrane mimetic system.
- Predictive Value: Supports target validation by demonstrating binding dependence on cofactors such as calcium ions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows screening of compounds that modulate protein-membrane binding by measuring changes in nanodisc stacking patterns.
- Operational Value: Uses accessible negative stain TEM infrastructure for high-contrast imaging without cryo-EM requirements.
- Assay Readiness: Generates samples compatible with downstream structural workflows including single-particle analysis and non-denaturing gels.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides low-resolution structural insights that can guide higher-resolution cryo-EM studies of protein-nanodisc complexes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies steric and spatial constraints of protein binding on both sides of the nanodisc.
- Disease-Relevant System: Models peripheral membrane protein interactions relevant to signaling pathways in inflammation and lipid metabolism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical mechanistic studies, offering a bridge between biochemical binding assays and high-resolution structure determination.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by visualizing whether a protein binds to a membrane surface under defined conditions.
- Screening: Produces quantitative imaging readouts (stacking vs. non-stacking) that can be scored for compound effects on membrane binding.
- Analytics: Enables class averaging and 3D modeling of protein-nanodisc complexes to generate low-resolution structural data for target characterization.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical work by providing structural context for protein function in lipid environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing multiple peripheral membrane proteins across different lipid compositions and buffer conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct visualization of binding events and low-resolution structural insights reduce ambiguity in mechanistic models.
- Operational Value: Leverages widely available TEM equipment and standard negative staining protocols for broad accessibility.
- Strategic Value: Increases confidence in target engagement data, reducing failure rates in downstream structural and functional validation.
- Portfolio Impact: Enables early triage of targets based on confirmed membrane binding, improving capital efficiency in discovery pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, nanodisc reconstitution, and negative stain TEM sample preparation.
- Dependent on access to transmission electron microscopy and UV-Vis spectroscopy for nanodisc quantification.
- Necessitates optimization of lipid-to-scaffold ratios and buffer conditions for each protein-lipid system.
- Involves handling of air-sensitive lipids and phosphotungstate stain under controlled conditions.
- Limited to proteins that do not induce stacking themselves; binding is inferred from absence of stacks relative to controls.
