Name: Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Öğrenin, negatif boyama transmisyon elektron mikroskobisi kullanarak nanodisk membranlara ekstrinsik membran proteinlerinin bağlanmasını nasıl görselleştireceğinizi. Bu yöntem, protein-membran etkileşimlerini incelemek ve ilaç geliştirme için düşük çözünürlüklü yapı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, desteklerinden dolayı İsveç Araştırma Konseyi, Stockholm İl Konseyi ve KI fonları teşekkür ederiz. MSP ifadesi ve saflaştırılması Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Bilim Core Tesisleri&#39;nde (http://PSF.ki.se) yapıldı. Yazarlar ayrıca, teknik uzmanlık paylaşımı için ve onların zamanında yardım için Dr. Pasi Purhonen ve Dr Mathilda Sjöberg teşekkür etmek istiyorum.

Nanodiscs hazırlanması 1. <ol><li> Ekspresyon ve membran iskele protein 8 saflaştırılması, 35 <ol><li> E. coli BL21 içinde His-etiketli MSP1E3D1 (DE3) şişelerde T1R pRARE2 gerginlik ifade eder. 37 ° C&#39;de 50 ug / ml kanamisin ile desteklenmiş LB ortam maddesi ile 50 mL&#39;lik bir gece boyunca başlatıcı kültür hazırlayın. 50 ug / ml kanamisin ile takviye edilmiş müthiş bir broth ortamına 2 L gece boyunca başlatıcı kültür ile seyreltilir. </li><li> Yaklaşık 3 18 ° C &#39;de 3 saat boyunca, 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile, protein ifadesini uyarmak ulaştığında 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk kadar 37 ° C&#39; de hücreler büyütün. </li><li> liziz tamponu (100 mM NaCI,% 10 gliserol, 100 mM Tris-HCI, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce hemen 1 mM TCEP ekleyin. </li><li> 18 ° C &#39;de indüksiyon 3 saat sonra, 4500 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücreler hasatve 4 ° C&#39;de. Süpernatantı atın hasat hücreleri tartmak ve hücrelerin gramı başına 2 ml lizis tampon oranında lizis tamponu onları yeniden askıya. </li><li> Lyse darbeli sonikasyon (tekrarlama oranı: 4 s AÇIK, 4 s KAPALI) tarafından hücreler% 80 genlik 3 dakika boyunca. </li><li> 49.000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca lizatları santrifüjleyin. Bu santrifujlemeden elde pelet atılır. </li><li> Tercihen 4 ° C&#39;de muhafaza otomatik bir sıvı kromatografi sistemine bağlı bir 5 ml Ni içine süpernatant + kenetleme sütun enjekte edilir. </li><li> His-etiketli MSP dışındaki tüm proteinleri kaldırmak için aşağıdaki 3 - elüsyon adım (adım 1.1.9) önce, tamponlar 1 ile sütun yıkayın. arıtma süreci takip etmek 280 nm&#39;de protein içeriği izlemek; 280 nm&#39;de UV kayıt her yıkamadan sonra geri başlangıca gitmeli. <ol><li> 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol,% 1 Triton pH 8.0: yıkama tamponu 1 ile yıkayınız. </li><li> 40 mM Tris-HCI, 300 mM: yıkama tamponu 2 ile yıkayınNaCl, 20 mM imidazol, ve 50 mM sodyum kolat, pH 8.0. </li><li> 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 50 mM imidazol, pH 8.0: yıkama tamponu 3 ile yıkayınız. </li></ol></li><li> 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0 ile MSP yıkayın. </li><li> Jel filtrasyonu 8, 35, standart tampon (0.5 mM EDTA, 100 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5) MSP tampon değiştirme; parti başına verim yaklaşık 7 mg L-olmalıdır -1. </li></ol></li><li> Fosfolipid stok çözeltisi hazırlanması <ol><li> Bir cam behere 25 mg / mL&#39;lik bir konsantrasyonda kloroform içinde çözülmüş 1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin (POPC) 305 ul ekleyin ve hafif bir nitrojen akımı ile tasfiye ederek kloroform buharlaşması . bir vakum kurutucu içinde yağ gece boyunca kurutun. Not: Bu adım cam kabın altındaki lipid ince bir film bırakır lipid, çözücünün kaldırmak için yapılır.</li><li> çözüm şeffaf hale gelinceye kadar tüp vorteks 100 mM sodyum kolat içeren MSP standart tampon 200 uL lipid pasta yeniden süspanse; Bu 50 mM POPC konsantrasyonuna sahip bir çözüm sağlayacaktır. Not 2 (lipit: deterjan) 8 Genel olarak, bu noktada, deterjan lipidin mol oranı 1 olmalıdır. Bu lipid, deterjan karışımı yaklaşık 2 ay için -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Deterjan çıkarılması için hidrofobik tanelerin hazırlanması <ol><li> 50 mL&#39;lik bir tüp içinde tanelerin 5 g (kuru ağırlık) yerleştirin. </li><li> ultra saf su 40 mL, sonra% 100, 30 mL metanol ile boncuk yıkayın. </li><li> 10 ml MSP standart tampon maddesi ile boncuk yıkayın. Son olarak, 4 ° C &#39;de MSP standart tampon maddesi 15 mL boncuk saklayın. </li></ol></li><li> Nanodisc sulandırma <ol><li> Bir mikrofüj tüpüne MSP1E3D1 (0.124 mM) 190 ul dağıtmak ve fosfolipid stok çözeltisi (50 mM P 61.5 mcLAynı tüp OPC). 1 saat boyunca ıslak buz üzerinde sulandırma karışımı inkübe edin. Not: 130 (MSP1E3D1: POPC) 1 bir mol oranına eşittir. </li><li> Otomatik birleştirme işlemi başlatmak için yeniden oluşturma karışımının mL&#39;si başına boncuk 0.5 g bir konsantrasyonda hidrofobik boncuk ekleyin. 4 ° C sıcaklıkta 16 saat için bir döner bir inkübatörde inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, 13.000 x g&#39;de 10 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj çökeltilerini ve agrega kaldırma. pelet atın ve süpernatant kaydedin. </li><li> 280 nm&#39;de absorbans stabil hale gelene kadar MSP standart tampon maddesi ile (otomatik bir sıvı kromatografi sistemine monte) boyut çıkarım kromatografi kolonuna dengelenmesi. sütuna süpernatan enjekte edilir ve zirve fraksiyonları toplayın. </li><li> 280 nm &#39;de pik fraksiyonlarda nanodiscs konsantrasyonlarını ölçmek. Nanodisc konsantrasyonunun hesaplanması için MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm-1 M-1) molar sönüm katsayısı kullanarak. NOT:nanodisc için lipid sayısı radyo-etiketli lipitlerin ve fosfat analizi 4 bir kombinasyonu ile ya da tek başına fosfat analizi ile ölçülebilir. </li></ol></li></ol> Monotopic Proteininin 2. 5-lipoksijenaz 35 <ol><li> bir gecede starter kültür hazırlayın. 100 ug / ml ampisilin ile LB ortamında 50 mL Supplement. 5-lipoksijenaz geni (ALOX5) plasmid içeren E. coli BL21 (DE3) &#39;e sahip ortamı aşılamakta. 42 mM Na-2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCI, 19 mM NH4CI, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM CaCl2,% 0.2, D-glikoz, 0.1 ihtiva eden sentezleme ortamı içinde bir gece boyunca starter kültür seyreltilir % 5 uM FeSO 4 ve 100 ug / ml ampisilin. 600 OD ~ 0.5 25 ° C kadar hücreleri büyür. 20 ° C&#39;de 35 16 saat 0.2 mM IPTG ile protein sentezlenmesinin neden. </li><li> 7.000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 10 dakika süre ile santrifüjleme ile hasat ve supernatant atın. proteaz inhibitörü ve 0.5 ihtiva eden (ve 1 mM TCEP, 100 mM NaCI,% 10 gliserol, 100 mM Tris-HCI, pH 8.0) içinde liziz tamponu içinde hasat hücreleri ve tekrar süspansiyon hasat hücreleri içeren tüpün alt kısmında bulunan pelet tartılır mg / ml hücre gramı başına liziz tamponunda 2 mL bir oranda 35 lizozim. </li><li> % 80 genlik, 5 x 15 sn boyunca sonikasyon ile Hücreleri,. 7.000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak. Çözelti 35 proteinleri çökeltmek için% 60 doygunluk - 30 amonyum sülfat çökeltme gerçekleştirin. 16.000 x g&#39;de 15 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj. Not: 5LO pelet hızla dondurulmuş ve 6 ay boyunca -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> 40.000 x g&#39;de 15 dakika 4 ° C&#39;de lisis tamponu ve santrifüj 20 mL pelletini. </li><li> üzerinde supernatant inkübe<html> 30 dakika süre ile 4 ° C&#39;de bir ATP agaroz sütunu. 0.5 M NaCl ihtiva eden liziz tampon maddenin bir sütun hacim ile bir kez kolon yıkayın. 10 uM FeSO 4 ve 20 ug / ml katalaz ihtiva eden liziz tamponu içinde 20 mM ATP ile 5LO yıkayın. ATP 35 kaldırmak için jel filtrasyon kromatografisi gerçekleştirin. NOT: 5LO kararsız ve ürün arıtıldıktan hemen sonra kullanılmalıdır. Aksi takdirde, amonyum sülfat çökeltmesi aşama (aşama 2.1.3 sonra nota bakınız) durmasına önerilir. </li></ol> Nanodisc-protein kompleksinin 3. hazırlanması <ol><li> kompleks, 100 uL toplam hacim hazırlayın. MSP, standart tampon maddesi içinde 1 mM Ca2 + mevcut 0.8 uM, ikinci ve 0.8 uM 5LO karıştırın (20 mM Tris-HCI, pH 7.5; 100 mM NaCI, 0.5 mM EDTA, 1.5 mM CaCl2) ve 10 dakika boyunca inkübe buzda. NOT: Numune bir aya kadar C 35 ° 4 de saklanabilir. </li></ol>Numune ove_title &quot;&gt; 4. Analiz <ol><li> Jel elektroforezi <ol><li> Denatüre edici olmayan elektroforez <ol><li> 5 yükleme tamponu uL (50 mM BisTris, 6 N HCI, 50 mM NaCI,% 10 (ağırlık / hacim) gliserol ve% 0.001 Ponceau S, pH 7.2) 49 ile numune 15 uL karıştırın ve 4 üzerinde yük -% 16 Bis-Tris jel elektroforezi gerçekleştirmek için. </li><li> Işık katod tamponu ile katot tankı doldurun (50 mM Trişin, pH 6.8; 50 mM Bis Tris ve% 0.002 Coomassie G-250) ve tampon (50 mM Bis Tris, 50 mM Trişin, pH 6.8) ile çalışan anot tankı. 150 V sabit bir gerilim kullanılarak ayrımı başlayın </li><li> Coomassie ön jel sonuna ulaştığında elektroforetik ayrımı durdurun. </li><li> Standart bir Coomassie mavi protokolü ile jel Leke. </li></ol></li><li> denatüre elektroforez <ol><li> ((SDS içeren yükleme tamponu 10 uL,% 0.05, numunenin 40 uL karışımı / V) bromfenol mavisi a; 0.2 M Tris-HCI,pH 6.8; % 20 (h / h) gliserol; % 10 (ağırlık / hacim) SDS; elektroforez gerçekleştirmek için% 20 Tris glisin jeli - 10 mM 2-merkaptoetanol) ve 4 üzerine yerleştirin. </li><li> Çalışan tampon katot ve anot tankları doldurmak (25 mM Tris-HCI, pH 6.8; 200 mM glisin ve% 0.1 (w / v) SDS). 150 V sabit bir gerilim kullanılarak ayrımı başlayın </li><li> Yükleme boya ön jel sonuna ulaştığında elektroforetik ayrımı durdurun. </li><li> Standart bir Coomassie mavi protokolü ile jel Leke. </li></ol></li></ol></li><li> NAPT çözeltisinin hazırlanması <ol><li> (Ağırlık / hacim) asidik çözelti, bir% 2 vermek üzere, oda sıcaklığında çalkalama ile 50 mL su içinde fosfotungstad sodyum tuzu, 1 g çözündürülür. </li><li> 1 M NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlayın. 0.22 mikron şırınga filtresi kullanılarak partiküllerini. Oda sıcaklığında ya da 4 ° C&#39;da, çözelti saklayın. </li></ol></li><li> TEM analizi için numune hazırlanması <ol><li> Glow-deşarj karbon kaplı bakır ızgaralar (430 mA, 20 s için 00 göz) numunenin yüze çekilmesinden önce hidrofilik ızgaraları işlemek için. ızgara örnek (nanodiscs göre 0.8 uM) 3.5 uL yerleştirin ve 30 s için inkübe edilir. Not: uygulanan hacimli bir numunesi konsantrasyonuna bağlı olarak, 2,5 ila 5 uL değişebilir. 1 uM - nanodiscs için uygun konsantrasyon aralığı 0.5 olduğunu. </li><li> Filtre kağıdı kullanarak fazla solüsyonu kapalı kurulayın. </li><li> Hemen 30 sn için% 2 NAPT bir damla ızgara leke. Fazla solüsyonun kapalı kurulayın ve kuru hava ızgara bırakın. </li><li> TEM ile ızgaraları değerlendirin. 120-200 keV gerilimi hızlanan bir mikroskop istifleme boyutlarını tahmin etmeye yeterlidir. NOT: Bu protokolü için, kalibre edilmiş bir transmisyon elektron mikroskobu kullanılmıştır 200 keV alan emisyon tabanca ile donatılmıştır. </li><li> TEM görüntüleri kaydetmek. Uzun yığınları gösteren görüntüler için daha fazla işlem yoktur; Fotoğraflar bir kaç içerebilir dışsal proteinle nanodiscs kompleksi göstermektedirkısa yığınlar, ancak çoğu parçacıkların kompleksi bulunmaktadır. Tutanak birkaç görüntü ve süreç sınıf ortalamaları ve düşük çözünürlük, kompleksin 3 boyutlu model elde etmek için standart yöntemlere göre bu. NOT: negatif leke verilerinin toplanması için, ızgaralar, en az üç farklı günde yapılmıştır. Negatif boyama işleminden önce her gün için, taze örnek inkübasyonlar (adım 3.1 gibi) yapılmıştır. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Boş nanodiscs yeniden oluşturulması, protein nanodisc komplekslerinin hazırlanması ve bu komplekslerin TEM için negatif boyama: Yöntem, üç bölüme ayrılabilir. Her bölüm tekniği, kritik adımlar ve kullanışlı değişiklikler sınırlamaları ile ilgili ayrı ayrı ele alınacaktır. Boş nanodiscs sulandırıldıktan. üretim ve nanodiscs kullanımında kritik adımlar ve sınırlamalar. Boş nanodiscs hazırlanması için, MSP-to-lipit oranını optimize esastır. En yaygın MSP ve (bir deterj...

araştırmalarda, çok dikkat lipit etkileşimi, çeşitli yer içsel veya dışsal da zar proteinleri, odaklanmıştır. Lipid etkileşen proteinleri ile çalışma ya deterjanlar gibi lipidler, bir yerine seçilmesi 1 amphipols veya küçük proteinler 2, ya da çözünür ve aktif proteini tutan bir membran yerine bulmak içerir. Lipoik membran yerine lipozomlar ve nanodiscs (ND) 3, 4 içerir. Nanodiscs doğal kanda meydana gelen, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), proteinin bir parçası, Apo-1 mühendisliği tarafından geliştirilen yakın yerli membran platformudur. Apo A-1 kısa amfipatik α-helikslerin 243 kalıntı uzun zincirli ve bir lipit içermeyen çözünebilir bir biçime sahiptir. İn vitro lipid varlığında, protein Apo-1 iki kopya kendiliğinden hydr çevrelemek için yeniden zamanbir lipid iki katmanlı yamanın 5 ophobic asil zincir bölümü. ApoA-1 Engineered Bunlar genellikle membran iskele proteinleri (MSP) olarak adlandırılır ve artan sayıda plazmid ya da arıtılmış, proteinler gibi ticari olarak temin edilebilir. 6 uzun veya daha kısa 7 membran iskele proteinler Apo AI 1 sonuç tekrarlar veya α-sarmal silmeler. Bu da bu mümkün 7 8 mil 17 çapı 6 nm civarında diskleri izin vermektedir. Nanodiscs 3, 9 başvurularının farklı türleri vardır. En yaygın olarak kullanılan uygulama, daha önce 3, 9 yorumlanan bütünsel zar proteini 8 stabilizasyonu için bir yakın yerel membran ortamı sağlamaktır. Daha az keşfedilen kullanımı çalışma için nano ölçekli zar yüzeyi temin etmektirperiferal membran proteinleri 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Protokolün Bölüm 1 Aşağıdaki fosfolipidler ve membran iskele protein oluşan nanodiscs yapmak için prosedürü görüntüler. Numune hazırlama çoğu yöntemleri bir darboğaz olduğunu. Yöntem özgü örnekleri belirli bilgileri eklemek olabilir, ama aynı zamanda sonuçların karşılaştırılması zorlaştırmaktadır. örnekler modelli ve çok sayıda farklı yöntem doğrudan kullanılabilir, bu nedenle, daha basit bir. Nanodiscs kullanımı ile bir avantajı, lipozomlar (örneğin, numuneler, doğrudan bu protokolde olduğu gibi, TEM ve denatüre edici olmayan jel elektroforezi her ikisi için de kullanılabilir) ile karşılaştırıldığında nanodisc küçük boyutudur. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; veziküller ve lipozomlar, uzun zar etkileşen proteinlerin fonksiyonunun anlaşılması için kullanılmıştır. Yapısal çalışmalar ve görselleştirme için lipozomlar içinde bir transmembran proteini yapısal kararlılığının bir örnek kullanılabilir 18&#39;dir. Ancak, bir lipozom membranı üzerinde yerleştirilmiş monotopic membran proteini herhangi bir yüksek çözünürlüklü 3D yapı bildiğimiz kadarıyla, henüz yayınlanmıştır. Altın nano parçacıklar veya antikorlar TEM 19 kullanılarak lipozomlar veya veziküller bağlayıcı proteinleri görselleştirmek için kullanılabilmektedir. bu problar çok özel olsa da, bunlar membran bağlanma bölgeleri örterek ya da esnek parçalar ile ilgi alanları maskeleyerek-membran birleştirme proteinleri engelleyebilir. Altın etiketli veya antikor-kompleks proteinler muhtemelen jel üzerinde analiz edilebilir, ancak bu deneyde maliyetini arttıracaktır. lipozomlar mükemmel bir platform olmasına rağmen, bir pop emin olamazulation lipozom başına protein belirli bir oranı, nanodiscs 20 kullanımı ile keşfedilebilir bir özelliği vardır. bir lipozom içinde, kofaktör ve alt tabakalar çözünür iç sıkışıp edilebilir. zar-çözünen maddeler membran taklitlerinin her iki tür için aynı kaderi paylaşacak. iki tabakalı alanı nanodiscs daha küçük olduğu Bununla birlikte, maddenin daha az miktarda nanodisc membranlar doyurulması için gereklidir. atom yapısı belirlenmesi yoluyla anlama protein işlev araştırmanın pek çok alanında için gerekli olmuştur. Protein yapı tayini için yöntemler röntgen 21 arasında; nükleer manyetik rezonans (NMR) 22, 23; ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) sirojenik sıcaklıkta 24 cryoEM. cryoEM tarafından çözünürlüğü son zamanlarda büyük ölçüde kaynaklanmaktadır doğrudan elektron de kullanımına, geliştirilmiş26, 25 dedektörler. Makromoleküller yakın bir yerli devlet ince, vitreus buz 27 görüntülenmiş. 200 kDa - Bununla birlikte, biyolojik moleküllerin düşük kontrast nedeniyle, bunlar 100 boyut aralığında tespit etmek zor olur. Uygun büyüklükte numuneler için, veri toplama yapılan ve tek parçacık yeniden yöntemi, bir yapı 28 elde etmek üzere uygulanabilir. Ancak, TEM ile protein yapısının belirlenmesi çok aşamalı bir süreçtir. Genellikle negatif leke TEM 29 phosphotungsten (PT) 30 veya uranyum 31 gibi ağır metallerin tuzları kullanarak örnek monodispersiteye değerlendirilmesi ile başlar. Olumsuz lekeli makromolekülün düşük çözünürlüklü bir modeli İmar genellikle yapılır ve moleküler yapı 29 hakkında önemli bilgiler verebilir. Paralel,cryoEM başlayabilir kullanarak veri toplama. eser oluşum yanlış yorumlanmasından kaçınmak için negatif leke TEM verilerini değerlendirirken dikkatli olunmalıdır. Belirli bir artefakt fosfolipidler PT leke etkisi ve yan 33 bakıldığında jeton yığınları benzeyen, uzun çubukların oluşumu ile sonuçlanan, 32 lipozomlar. Bu tür &quot;rouleau&quot; veya &quot;yığınları&quot; (bundan sonra &quot;yığınları&quot; olarak belirtilir) nanodiscs 35 daha sonra da HDL 34 için erken gözlenen ve bulundu. membranların istif ve yeniden şekillendirme çeşitli nedenlerle oluşabilir. Örneğin, bir amonyum molibdat leke 36 TEM görüntülemede bakır gibi ko-faktörler tarafından indüklenebilir. lipozomlar membran lipitlerinin bir kısmı böylece bakır iyonlarının eklenmesinden sonra lipozomlar istifleme, EDTA metal kompleks oluşturmayı taklit bir iminodiacetic asit kafa grubu içerdiği <sclass = &quot;xref&quot;&gt; 36 kadar. İstifleme da bağlı olarak ya da lipid çift tabakaları bir protein ile, protein-protein etkileşimi olabilir 37 (kullanılmış leke söz konusu değildir). PT tarafından fosfolipidlerin yığın oluşumu erken gözlendi; Ancak, daha sonra çalışma kaldırma veya bu eser oluşumu 38 kaldırılmasına odaklanmıştır. Burada, TEM ile membrana bağlanma proteinlerinin çalışma için istifleme NAPT&#39;yi kaynaklı nanodisc yararlanmak için bir yöntem önerilmektedir. Kısacası, nanodiscs üzerinde bağlayıcı protein istifleme gelen nanodiscs önleyecektir. Istifleme nedenleri açık değildir rağmen, birbirlerine (Şekil 1A) sopa diskleri neden fosfolipid ve PT fosforil grubu arasında bir elektrostatik etkileşim olduğunu 39 önerilmiştir. Protokolde arkasındaki hipotezi, bir protein, bir nanodisc bağlandığında, fosfolipid yüzeyinde en availa olmadığıdır<html> bağlı proteini ile sterik engelleme, PT ile etkileşim için ble. Bu yığın oluşumunu (Şekil 1B) önleyecektir. İki sonuçlar çıkarılabilir. İlk olarak, istifleme önlenmesi ilgili protein ile membrana bağlı olduğu anlamına gelir. İkinci olarak, protein ND kompleksi kompleks kaba morfoloji elde etmek için standart tek parçacık işleme yöntemleri 24, 40 ile muamele edilebilir. Ayrıca, sigara denaturasyon jel elektroforezi ya da dinamik ışık saçılımı gibi yöntemlerle analiz gerçekleştirilebilir. Bu hipotezi göstermek için, bir çok iltihaplı hastalık 41, 42 yer almaktadır membran bağlayıcı protein 5-lipoksigenaz (5LO) kullanılmıştır. Bu 78-kDa &#39;lık proteinin zar 43 bağlamak için kalsiyum iyonu gerektirir. Bu zar dernek çalışılmış olmasına rağmen yoğun lipozomlar kullanılaraks = &quot;xref&quot;&gt; 44, 45, 46 ve membran fraksiyonları 47, bu TEM analizi ve yapı belirlenmesi için kullanılamaz. nanodiscs hazırlanması deterjan ise sodyum kolat içinde yeniden süspansiyon haline lipid ile MSP karıştırılmasıyla başlar. 1 saat boyunca buz üzerinde kuluçkalamadan sonra, deterjan yavaş bir adsorban reçinesi kullanan bir çözme karışımından çıkarılır. Bu tür malzemenin genellikle küçük boncuk halinde şekillendirilir polistiren yapılır. Bunlar nispeten hidrofobik ve lipidler 48 oranla deterjan bağlanması için güçlü bir tercih var. hidrofobik tanelerden ayrılması ve santrifüj kullanılarak açıklık yaptıktan sonra, nanodiscs boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. Saflaştırılmış nanodiscs (a titrasyonu için ya da daha fazla oranlarda) eşit molar orandaki bir monotopic membran proteini (ve olası yardımcı faktörler) ile karıştırılır ve r bırakılıreact (15 dakika). TEM ile analiz parlayan taburcu karbon kaplı ızgaralar üzerine numune ul-miktarlarda uygulayarak ve daha sonra NAPT ile negatif boyama yaparak gerçekleştirilir. alikotları TEM ızgaraların uygulandığı zaman, aynı örnek büyük bir değişiklik, denatüre edici olmayan ya da SDS-PAGE jel elektroforezi gibi göre aktivite ölçümleri çeşitli ile analiz için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu: JEOL2100F</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Tiez Video ve Görüntüleme İşleme Sistemi GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kızdırma deşarjı</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM ızgarası: 400 ağ</td><td>TAAB</td><td>GM016 / C</td><td></td></tr><tr><td>Boyut dışlama kromatografisi: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriler: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriler: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Bilimi Tesisi, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırma Matrisi: ATP agaroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırma Matrisi: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipid: POPC</td><td>Avanti polar lipidler</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL kloroform içinde</td></tr><tr><td>Hidrofobik boncuklar: Biyo-Boncuklar, SM-2 Reçine</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm şırınga filtresi: 0.2 &mu; m</td><td>Pall yaşam bilimleri</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Boya: Sodyum fosfotungstat tribazik hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Deterjan: Sodyum kolat hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Kolat</td><td></td><td></td><td>500 mM Sodyum kolat. MiliQ suyunda tekrar süspanse edin ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Lipid Stoku</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM sodyum kolat, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. <bt />4 &°C'de saklayın; Bir hafta boyunca C; veya Mağaza -80 > Çözeltiyi azotla temizledikten sonra bir ay boyunca C.</td></tr><tr><td>MSP standart tampon</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>İndenaturaing Olmayan Elektroforez Anot Tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Trisin, pH 6.8</td></tr><tr><td>İnatüre Olmayan Elektroforez Katot Tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Trisin, pH 6.8, %0.002 Coomassie G-250</td></tr><tr><td>İnattüre Olmayan Elektroforez 4x Örnek yükleme Tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, %10 (a/h) gliserol, %0.001 Ponceau S</td></tr><tr><td>İnaturalama Elektroforezi Çalıştırma Tamponu</td><td></td><td></td><td>Ev içi tarif: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glisin, %0.1 (a/h) SDS</td></tr><tr><td>İndenaturalama Elektroforezi 5x Numune yükleme Tamponu</td><td></td><td></td><td>Ev içi tarif: %0,05 (a/h) Bromofenol mavisi, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, %20 (h/h) gliserol, % 10 (a / h) SDS, 10 mM 2-merkaptoetanol</td></tr><tr><td>Müthiş et suyu</td><td></td><td></td><td>Tripton - 12.0 g, Maya Özü - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO <> sub4 ve 0.72 M K 2 HPO4, Gliserol - 4 mL. Tripton, maya ekstraktı ve gliserol 900 mL'ye kadar hazırlandı ve ayrı ayrı otoklavlandı. KH2PO4 ve K2HPO4 ayrı ayrı hazırlandı ve otoklavlandı. Her ikisi de ortamı kullanmadan önce karıştırıldı.</td></tr></tbody></table>

yöntem gözünüzde canlandırın ve transmisyon elektron mikroskobu membran etkileşen proteinler analiz için

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopik proteinler, bir zar yüzeyine bağlandıklarında işlevlerini yerine getirirler ve bu tür etkileşimler, spesifik lipid bileşimine ve işlevi yerine getirmek için yeterli alanın mevcudiyetine bağlıdır. Nanodiskler, kontrollü boyut ve lipit içeriğine sahip bir zar yüzeyi sağlamak için kullanılır. Bağlı ekstrinsik proteinlerin yokluğunda, sodyum fosfotungstat lekeli nanodiskler, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile yandan bakıldığında madeni para yığınları olarak görünür. Bu nedenle bu protokol, istiflemeyi kasıtlı olarak teşvik etmek için tasarlanmıştır; Sonuç olarak, istiflemenin önlenmesi, zar bağlayıcı proteinin nanodiske bağlanması olarak yorumlanabilir. Bir sonraki adımda, protein-nanodisk komplekslerinin TEM görüntüleri, daha yüksek çözünürlüklü kriyoEM çalışması için bir temel olarak düşük çözünürlüklü yapılar elde etmek için standart tek parçacıklı yöntemlerle işlenebilir. Ayrıca, nanodiskler TEM veya denatüre olmayan jel elektroforezi için uygun numuneler sağlar. Yöntemi göstermek için, nanodiskler üzerinde 5-lipoksijenazın Ca2 + ile indüklenen bağlanması sunulmaktadır.

önerdiğimiz metot olup, bağlama monotopic membran proteini için membran yüzey sağlamak için nanodiscs hazırlanması bağlıdır. Nanodisc çift katlı lipid içine gömülü herhangi bir transmembran proteini olduğu gibi, nanodiscs burada &quot;boş nanodiscs&quot; (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir. Bu iki MSP1E3D1 iskele proteinleri ve POPC 8 yaklaşık 260 molekül bir kompozisyon için 256 kDa bir hesaplanmış molekül ağırlığına sahiptir. Bu protein kullanıla...

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bu prosedürün genel amacı, proteinin yüksek çözünürlüklü yapı tayinine yönelik ilk adım olarak, ekstrinsik bir membran proteininin nanodisk membran yüzeyine bağlanmasını negatif boyama transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirmektir. Bu yöntem, hücresel membranlarda ve üzerinde meydana gelen protein aktiviteleriyle ilgili olduğu için birçok araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, proteinin membranlara bağlanamadığı durumlarda ortaya çıkan karakteristik nanodisk formu istifleridir.Bu yığınlar, transmisyon elektron mikroskobu ile net bir şekilde görülebilmektedir. Bu tekniğin önemi, bileşiklerin membran protein etkileşimlerini engelleme veya etkinleştirme yetenekleri açısından kolayca taranabilmesi nedeniyle ilaç geliştirmeye kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, monotopik proteinlerin membranınıza bağlanması için optimal koşullar hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, protein nanodisk kompleksinin düşük çözünürlüklü bir yapısını da sunar.Prosedüre başlamak için, MSP1E3D1 gibi bir membran iskelet proteinini eksprese edin ve saflaştırın. Ardından, metal iğneli bir cam şırınga kullanarak, kloroform içinde 25 mg/mL POPC'den 305 µL'

method-to-visualize-analyze-membrane-interacting-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Daha fazla protein yarısından elektron mikroskobu görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hem de zor küçük proteinler (moleküler kütle &lt;200 kDa) 'dir. Optimize negatif boyama, yüksek kontrast ve nispeten yüksek çözünürlük (~ 1 nm) farklı fizyolojik koşullar altında, küçük, asimetrik proteinlerin ya da komplekslerin görüntüleri elde etmek için güçlü ve yüksek verimli bir protokoldür.

Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Biz msn zamansal çözünürlüğe sahip membran dinamiklerinin görüntülenmesini sağlayarak elektron mikroskobu, "flaş-and-donması" içinde yeni bir teknik geliştirdi. Bu teknik, yüksek basınçlı dondurma nöron Optogenetic uyarılmasını birleştirir. Burada, prosedürleri göstermek ve ayrıntılı protokolleri açıklar.

Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Öğrenin, negatif boyama transmisyon elektron mikroskobisi kullanarak nanodisk membranlara ekstrinsik membran proteinlerinin bağlanmasını nasıl görselleştireceğinizi. Bu yöntem, protein-membran etkileşimlerini incelemek ve ilaç geliştirme için düşük çözünürlüklü yapı sağlar.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Daha fazla video keşfet