İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda Kaspaz Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Bağışıklık hücrelerinde, inflamatuar bir kaspaz olan kaspaz-1, inaktif bir formda bulunan bağışıklığa duyarlı önemli bir bileşendir. Bu aktif olmayan formlar, katalitik bir alanla kaynaşmış bir pro-alandan oluşur ve yakınlık kaynaklı dimerizasyon yoluyla aktif hale gelir.

Kaspaz aktivasyonunu in vivo olarak görselleştirmek için, kırmızı floresan proteinleri ve bir çift floresan tamamlama raportör proteinini eksprese eden, transfekte edilmiş insan monositinden türetilmiş makrofajların bir kültürü ile başlayın. Raportör proteinler, Venüs proteininin floresan olmayan fragmanları, Venüs-N veya Venüs-C ile kaynaşmış bir kaspaz-1 pro-alanı içerir.

Hücreleri, bakteri kaynaklı bir inflamatuar uyarıcı olan lipopolisakkaritler ve potasyum iyonoforlar - nigerisin içeren bir görüntüleme ortamı ile tedavi edin.

Lipopolisakkaritler, makrofaj üzerindeki örüntü tanıma reseptörleri ile etkileşime girerek bir inflamatuar kompleksin montajını başlatır.

Nigerisin molekülleri hücreye girer ve potasyum iyonlarına bağlanarak hücre dışı ortama akışlarına neden olur ve hücre içi potasyum iyon konsantrasyonunu azaltır. Bu, enflamatuar sensör proteinlerinin, sensör proteini ile prokaspaz-1 arasında bir köprü proteini olan ve kompleksi oluşturan adaptör proteinlerle hazırlanmasına yol açar.

Venüs parçalarını içeren pro-alanlar, kompleksin adaptör proteinleri ile etkileşime girer. Bu, iki parçayı birbirine yaklaştırır ve onları yeniden canlandırmaya ve floresan vermeye zorlar.

Hücreleri bir epifloresan mikroskobu altında görselleştirin.

Kesilen hücreler, kaspaz aktivasyonunu doğrulayan yeşil floresan lekeleri ile kırmızı görünür.

Transfeksiyon başına 1.5 mililitrelik steril bir mikrotüp alın ve davlumbaza uygun raportör plazmid ve kaspaz-BiFC plazmitlerini ekleyin. Pipet istasyonunu, cihazı, uçları, elektroporasyon tüplerini ve pipeti steril bir laminer akış başlığına yerleştirin. Nükleofeksiyon cihazını bağlayın ve açın.

Görüntülenen başlangıç ekranına transfeksiyon parametrelerini girin. Voltaj'a basın, 1,000 girin ve 1000 volta ayarlamak için Bitti'ye basın. Genişlik'e basın, 40 girin ve darbeyi 40 milisaniyeye ayarlamak için Bitti'ye basın. Son olarak, # Darbeler'e basın, iki girin ve elektrik darbesi sayısını 2'ye ayarlamak için Bitti'ye basın.

Elektroporasyon tüplerinden birini alın ve oda sıcaklığında üç mililitre elektrolitik tampon E ile doldurun. Elektroporasyon tüpünü, tüpün yan tarafındaki elektrotun içe baktığından ve tüp yerleştirildiğinde bir klik sesi duyulduğundan emin olarak pipet istasyonundaki pipet tutucusuna yerleştirin.

Hücre peletini alın ve beşinci hücrelere her 1 ila 2 kez 10 için 10 mikrolitre önceden ısıtılmış yeniden süspansiyon R-tamponu ekleyin ve bir P20 mikropipet ile hafifçe karıştırın. Her transfeksiyon tüpüne 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve bir P20 mikropipet ile hafifçe karıştırın. Push düğmesine ikinci durdurucuya kadar basarak pipete bir uç yerleştirin ve kelepçenin uçtaki pistonun montaj milini tamamen aldığından emin olun.

Ardından, pipet üzerindeki Push düğmesine ilk durağa kadar basın ve numuneyi aspire etmek için hücre veya plazmit DNA karışımı içeren ilk tüpe daldırın. Pipetin tık sesi geldiğinden ve uygun şekilde yerleştirildiğinden emin olarak, numunenin bulunduğu pipeti çok dikkatli bir şekilde pipet tutucusuna yerleştirin. Dokunmatik ekranda Başlat düğmesine basın ve elektrik darbeleri verilene kadar bekleyin.

Pipeti yavaşça istasyondan çıkarın ve ilk durdurmaya kadar Push düğmesine yavaşça basarak, transfekte edilmiş hücre süspansiyonunu önceden ısıtılmış, antibiyotik içermeyen ortamla ilgili kuyucuğa hemen ekleyin. Plakayı transfekte edilmiş hücrelerle nazikçe sallayın ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe bir ila üç saat inkübe edin. Ardından, her bir oyuğa 200 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.

Çanağı inkübatöre yerleştirin ve gen ekspresyonu için en az 24 saat bekleyin. Ertesi gün, bir epifloresan mikroskobu kullanarak hücre canlılığını ve transfeksiyon verimliliğini inceleyin.

Ortamı bir P1000 mikropipet ile hücrelerden dikkatlice çıkarın ve kuyu kenarına 500 mikrolitre uyarıcı solüsyon ekleyin. İşlenmemiş kontrol kuyularını çalıştırmak için, uyaran olmadan bir görüntüleme ortamı ekleyin.

Hücreleri bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak görselleştirmek için, üreticinin talimatlarını izleyerek mikroskobu ve floresan ışık kaynağını açın. 10 kez veya 20 kez objektifi seçin ve kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin.

Göz merceği ile 568 nanometre filtrenin altındaki hücreleri bulun ve raportör kırmızı hücrelerini ifade eden hücrelere odaklanın. Görme alanındaki tüm kırmızı hücreleri sayın. Aynı görsel alandayken, 488 veya 512 filtrelerine geçin. Aynı zamanda yeşil olan kırmızı hücrelerin sayısını sayın. En az üç alandan en az 100 kırmızı hücre sayın.