İnsan Epitelyal Enteroid Modelinde Nekrotizan Enterokolit İndüksiyonu

İnsan ince bağırsak dokusundan türetilmiş kriptler elde edin - kök hücreler ve çeşitli epitel hücreleri içeren tübüler istilalar.

Bağırsak kriptlerini soğutulmuş bir bodrum matrisine ekleyin.

Bu karışımı çok kuyulu bir plakaya aktarın ve üç boyutlu bir kubbe oluşturun.

Büyüme ortamı ekleyin ve inkübe edin.

Kök hücreler kendi kendini organize eder, çoğalır ve enterosferler oluşturarak birden fazla bağırsak hücresi tipine farklılaşır.

Zamanla, enterosferler enteroidlere dönüşür – bağırsak kriptlerine benzeyen üç boyutlu kendi kendini yenileyen yapılar.

Enteroid içeren kuyucuğa lipopolisakkaritler veya bakteriyel bir endotoksin olan LPS ekleyin ve inkübe edin.

LPS molekülleri, enteroiddeki toll benzeri reseptöre bağlanarak bir pro-inflamatuar yanıt başlatır ve reaktif oksijen türlerinin birikmesine neden olur. Bu, apoptoza yol açan bir dizi olayı tetikler.

Sonuç olarak, enteroidin bütünlüğü tehlikeye girer, bu da LPS'nin lümene nüfuz etmesine yol açarak enflamatuar yanıtı daha da yoğunlaştırır.

Bu, prematüre bebeklerin bağırsaklarında ciddi bir iltihaplanma olan nekrotizan enterokolit gelişimini taklit eder.

Ameliyat odasında toplama sırasında, insan ince bağırsak dokusu örneğini soğuk DPBS'ye yerleştirin. Numuneyi kan ve dışkı temizlenene kadar soğuk DPBS'de yıkayın.

Numuneyi, kript izolasyonu için hazır olana kadar RPMI 1640 ortamında dört santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, numunenin dışkı ve kan içermediğinden emin olmak için tekrar kontrol edin. Hassas diseksiyon makası kullanarak fazla yağı veya cerrahi klipsleri ve zımbaları çıkarın. Numuneyi tartın ve yaklaşık 0,75 ila 2,5 gramlık bir parça hedefleyin.

Daha sonra, dokuyu 0,5 santimetrelik parçalar halinde kesin ve bunları 30 mililitre şelatlama tamponu #1 içeren bir tüpe yerleştirin. Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca düşük hızda çalkalayın. Ardından, dokuyu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün ve akışı atın.

Filtrelenmiş dokuyu 30 mililitre şelatlama tamponu #2 içeren bir tüpe ekleyin. Dört santigrat derecede 15 dakika boyunca düşük hızda çalkalayın. Dokuyu 100 mikrometrelik bir filtreden süzün ve akışı atın.

Bundan sonra, daha sonra kullanmak üzere 500 mikrolitre bazal membran matrisini buz üzerinde çözdürün. 50 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre soğuk DMEM'e biraz doku ekleyin ve 10 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın. Bu süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün ve akışı toplayın. Bu tüpü buz üzerinde tutun.

Ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpte 10 mililitre soğuk DMEM'e biraz doku ekleyin ve 10 saniye boyunca elle kuvvetlice çalkalayın. Bu süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün ve akışı toplayın.

Birden dörde kadar etiketlenmiş akış içeren dört konik tüp olana kadar bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, çözeltiyi 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden bir numaralı tüpte süzün ve akışı yine bir numaralı etiketli 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Bu işlemi iki ila dört arasındaki tüpler için tekrarlayın.

15 mililitrelik tüpleri 200 kez g ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Laminer akış başlığında, süpernatanı her tüpten çıkarın ve atın. Topağın hemen üzerindeki doku bulutunu bozmaktan kaçının, bu geride bir süpernatant bırakmak anlamına gelse bile. Her tüpte, peleti kalan süpernatant ile karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.

Karışımı her tüpten tek bir 2 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 200 kez g ve dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti 500 mikrolitre önceden çözülmüş bazal membran matrisinde yeniden süspanse edin.

Bu süspansiyonun 50 mikrolitresini 24 oyuklu bir plakadaki bir kuyunun merkezine uygulamak için soğutulmuş bir pipet ucu kullanın. Bu örnek kubbe şeklinde görünmelidir. Toplam 10 kuyuyu doldurmak için bu uygulama işlemini dokuz kez tekrarlayın.

Polimerizasyona izin vermek için 24 oyuklu plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne aktarın. Ardından, her bir kuyucuğa 500 mikrolitre insan mini bağırsak ortamı ekleyin. Aynı koşullar altında inkübe etmeye devam edin, bu ortamı iki günde bir değiştirdiğinizden emin olun.