Çoklu Sitokin Hedeflerini Ölçmek için Multipleks Boncuk Bazlı İmmünoassay

Tabanda filtreleri olan çok kuyulu bir plaka alın.

Farklı sitokinler içeren bir test örneği ekleyin.

Boyut ve iç floresan yoğunluğuna göre farklılaşan farklı mikro küre setleri ekleyin.

Her set, belirli bir sitokini hedefleyen bir antikora konjuge edilir.

Plakayı karanlıkta çalkalama altında inkübe edin.

Antikorlar hedef sitokinlerine bağlanarak onları mikroküreler üzerinde hareketsiz hale getirir.

Bağlanmamış sitokinleri çıkarmak için bir vakum uygulayın. Mikroküreye bağlı sitokinler, zarın daha küçük gözenek boyutu nedeniyle korunur.

Mikroküre bağlı sitokinlere bağlanan biyotin konjuge tespit antikorlarından oluşan bir kokteyl ekleyin.

Bir floresan muhabir konjuge streptavidin ekleyin ve çalkalama altında karanlıkta inkübe edin. Streptavidin biotin'e bağlanır ve muhabiri mikroküre kompleksi üzerinde hareketsiz hale getirir.

Bağlanmamış molekülleri çıkarın ve mikro küreleri yeniden süspanse edin.

Akış sitometrisini kullanarak, mikrokürelerin boyutunu ve iç floresansını belirleyerek bağlı sitokinleri tanımlayın.

Belirli bir sitokin miktarını belirlemek için, raportörün floresan yoğunluğunu ölçün.

Testi gerçekleştirmek için, kullanmadan önce tüm reaktiflerin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.

Bu gösterimde polipropilen filtre plakaları kullanılmıştır. Boncukların kaybolmasını önlemek için, yıkama adımları da dahil olmak üzere tüm tahlil prosedürü boyunca plakanın dik tutulması kesinlikle önemlidir.

Her bir kuyucuğa 100 mikrolitre 1x yıkama tamponu ekleyerek filtre kağıdını önceden ıslatın ve plakayı oda sıcaklığında 1 dakika bekletin. Vakum manifoldunu kullanarak tampon hacmini çıkarın. Plakayı bir yığın temiz kağıt havluya bastırarak plakanın altındaki fazla yıkama tamponunu kurulayın. Ardından plakayı ters çevrilmiş plaka kapağının üzerine yerleştirin.

Hücre kültürü süpernatan numuneleri için, tüm kuyucuklara 25 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Standart kuyucuklara her standarttan 25 mikrolitre ekleyin. Son olarak, numune kuyucuklarına her numuneden 25 mikrolitre ekleyin. Karışık boncukları 30 saniye boyunca girdaplayın. Ardından, boncukların çökmesini önlemek için boncuk şişesini aralıklı olarak sallayarak her bir oyuğa 25 mikrolitre karışık boncuk ekleyin.

Plakayı bir plaka kapatıcı ile kapatın. Mühürlendikten sonra, ters çevrilmiş plaka kapağı da dahil olmak üzere tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın. Plakayı bir tabak çalkalayıcıya yerleştirin, sabitleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca yaklaşık 500 RPM'de çalkalayın. Ters çevirmeden, plakayı vakum manifoldunun üzerine yerleştirin ve vakumu daha önce olduğu gibi uygulayın. Ardından, her kuyucuğa 200 mikrolitre 1x yıkama tamponu ekleyin.

Tahlil plakası kuyucuklarının içeriğini vakumlu filtrasyon ile çıkarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlamadan önce plakanın altındaki fazla yıkama tamponunu emici bir ped veya kağıt havluyla kurulayın. Daha sonra, her oyuğa 25 mikrolitre tespit antikoru ekleyin. Plakayı yeni bir plaka kapatıcı ile kapattıktan sonra, ters çevrilmiş plaka kapağı da dahil olmak üzere tüm plakayı alüminyum folyo ile sarın.

Plakayı bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaklaşık 500 RPM'de çalkalayın. Vakumlamadan, her bir oyuğa doğrudan 25 mikrolitre streptavidin fikoeritrin reaktifi ekleyin. Plakayı daha önce olduğu gibi kapatın ve sarın. Sonra. Plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yaklaşık 500 RPM'de çalkalayın.

Vakum filtrasyon adımını iki kez tekrarladıktan sonra, her kuyucuğa 200 mikrolitre 1x yıkama tamponu ekleyin. Boncukları bir tabak çalkalayıcı üzerinde 1 dakika boyunca tekrar askıya alın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, numuneleri bir akış sitometresinde okumak için numuneleri filtre plakasından FACS tüplerine aktarın.