İmmünofloresan Kullanılarak Fare Hipokampal Dilimlerinde Sinapsların Mikroskobik Analizi

Bir fare beyninden alınan hipokampal bir dilimi tampon içeren bir kuyuya yerleştirin. Dilim, sinapslar aracılığıyla iletişim kuran bir nöron ağı içerir.

Presinaptik nöron terminalleri, karakteristik transmembran taşıyıcılara sahip nörotransmitter dolu veziküller içerirken, postsinaptik terminaller, nörotransmitter reseptörlerini düzenleyen karakteristik iskele proteinlerine sahiptir. Her ikisi de sinaptik yapılar için anahtar belirteçler olarak hizmet eder.

Tamponu geçirgenliği bloke eden bir solüsyonla değiştirin ve hücresel zarları geçirgen hale getirmek ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için çalkalama ile inkübe edin.

Presinaptik ve postsinaptik belirteçleri hedefleyen primer antikorları ekleyin ve bağlanmaya izin vermek için ajitasyon ile inkübe edin.

Dilimi yıkayın, primer antikorlara özgü florofor konjuge ikincil antikorları ekleyin ve karanlıkta çalkalama ile inkübe edin.

Dilimi yıkayın, ardından bir slayta monte edin.

Konfokal bir mikroskop kullanarak, ilgilenilen bölgeyi belirleyin ve sinapsları görselleştirmek için büyütün.

Floresan etiketli presinaptik ve postsinaptik belirteçleri tanımlamak ve sinapslardaki kolokalizasyonlarını değerlendirmek için görüntüler yakalayın.

İmmünofloresan boyamaya başlamak için, dilim oyuklarındaki PBS'yi bloke edici ve geçirgen hale getirici tamponla değiştirin ve çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 4 ila 6 saat inkübe edin. Blokaj adımının sonuna doğru, antikoru bloke edici ve geçirgen hale getiren tamponda VGLUT1 1 ila 2000'e seyreltin. Bu seyreltmenin şirkete ve kullanılan antikorun miktarına bağlı olarak değişebileceğini lütfen unutmayın. Dilimleri birincil antikor çözeltisinde gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Güçlü hareket eden sallanan bir platform kullanın.

Primer ve sekonder antikorların eşit dağılımı optimal boyama için önemlidir. Deneyimlerimize göre, kuvvetli çalkalama en iyi antikor penetrasyonunu sağlar.

Primer antikorda inkübasyondan sonra, dilimleri PBS'de daha önce olduğu gibi her seferinde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkama sırasında, uygun ikincil antikorları bloke edici tamponda 1 ila 500 arasında seyreltin. Daha sonra dilimleri bu çözeltide oda sıcaklığında 2 ila 3 saat inkübe edin. İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu için dilimlerin ışıktan korunduğundan emin olun.

Dilimleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, dilimleri 24 oyuklu plakadan dikkatlice çıkarmak için bir fırça kullanın ve önceden etiketlenmiş cam slaytlara eşit şekilde yerleştirin. Her dilimin üzerine bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için dikkatli olarak dilimlerin üzerine nazikçe bir cam lamel yerleştirin.

Işıktan koruyun ve slaytların oda sıcaklığında en az üç ila dört gün kurumasını bekleyin. Slaytları kısa vadede 4 santigrat derecede saklayın. Ancak uzun süreli depolama için eksi 20 santigrat derecede tutun. Görüntülenecek hipokampus bölgesini tanımlamak için 10x veya 20x'lik bir hedef kullanarak başlayın - bu durumda, CA1 piramidal nöronları ve Schaffer kollateral aksonları arasındaki sinapslar.

40x veya 63x yağa daldırma hedefine geçin ve sürekli nöritleri ve organize bir yapıyı tanımlayarak dilim anatomisinin sağlam olduğundan emin olun. Referans olarak MAP2 gibi bir nöronal belirteç kullanın. 1024 x 1024 piksel çözünürlükle optimum sinyal ve kontrast elde etmek için her kanalın ayarlarını yapın. Herhangi bir pikselin doygunluğunu önlemek için her lazerin yoğunluğunu ayarlayın.

Lekelenmenin eşit olduğu derinliği değerlendirin ve ardından yazılımı en az sekiz eşit uzaklıkta 250 nanometre düzlemden oluşan görüntü yığınlarını elde edecek şekilde ayarlayın. Ardından, her dilim için aynı ilgi alanından üç bitişik temsili görüntü yığını alın. Edinimi koşul başına en az üç dilimde ve tedavi grubu başına altı ila sekiz hayvanda tekrarlayın.