Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, sıçan hipokampal CA bir parametal nöronlarında sinaptik proteinlerin ultra yapısal lokalizasyonunu belirlemek için ImmunoGold etiketlemesi yapmaktır. Bu, önce organotipik dilimin bir bölgesi olan CA'nın çıkarılması, doğru oryantasyonu hatırlamak için üst köşenin kırpılması ve buz üzerinde osmiyum içermeyen bir fiksatif içinde inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, sabit dokuyu dehidre etmek ve reçine ile sızarak sertleşmesine izin vermektir.

Daha sonra reçineye gömülü dokulardan ultra ince kesitler kesilir ve nikel ızgaralara yerleştirilir. Son adım, kesit dokuları üzerinde immünohistokimya yapmaktır. Sonuç olarak, sinapstaki proteinlerin lokalizasyonunu belirlemek için immünoelektron mikroskobu kullanılır. Tamam.

Bu yöntem, dendritik dikenler içindeki proteinlerin lokalizasyonlarının sinaptik fonksiyondaki rollerini anlamaya nasıl yardımcı olabileceği gibi sinaptik plastisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem organotipik hipokampus dilimleri için optimize edilmiş olsa da, akut beyin dilimleri ve birincil nöronal kültürler dahil olmak üzere diğer nöronal preparatlar için de son derece değerli olabilir. Bu prosedüre, organotipik hipokampal dilimi taze buz gibi soğuk sorensen fosfat tamponu içeren bir polistiren Petri kabına yerleştirerek başlayın.

Doğrudan dilimlerin üzerine bir ila iki mililitre daha buz gibi soğuk tampon ekleyin. Dilimin CA bir alt alanını izole etmek için, CA bir hücre katmanına paralel olan dentat girusun yanındaki dilimi nazikçe kesmek için tek kullanımlık bir neşter kullanın. Ardından, CA üç alt alanını ve sulu'yu çıkarmak için kalan dilimi dikey olarak kesin.

Daha sonra, dokunun üst yüzeyini tanımlamaya yardımcı olmak için CA'nın bir köşesini bir dilim kesin ve neşterin arka tarafını kullanarak dokuyu zardan dikkatlice çıkarın. Dokuyu nazikçe buz gibi soğuk sorensen tamponu içeren 12 oyuklu bir plakaya aktarın. Tamponu çıkarın ve numuneyi yeterince kaplayacak şekilde Sorensen'in tamponunda seyreltilmiş pH 7.3'te 0.5 ila bir mililitre buz gibi soğuk fiksatif ekleyin.

Daha sonra dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, fiksatifi kuyudan çıkarın ve numuneleri buz gibi soğuk sorensen tamponunda 20 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra numuneyi, 6.0 pH'ta 0.1 molar malat tamponunda hacim başına% 1 Tanik asit ağırlığında inkübe edin.

40 dakika sonra, numuneyi malat tamponunda 20 dakika boyunca iki kez yıkayarak tanik asidi durulayın. Daha sonra, numuneyi malat tamponunda %1 pisuar asetat içinde 40 dakika inkübe edin, pisuar asetat ışığa duyarlıdır ve radyoaktiftir. Bu nedenle dikkatli bir şekilde kullanın ve inkübasyon sırasında numuneyi karanlıkta dört santigrat dereceye yerleştirin.

İnkübasyonun ardından, numuneleri buz gibi soğuk malat tamponunda her biri 20 dakika boyunca iki kez durulayın, ardından mahkum tamponunda% 0.5 platin klorür içinde 20 dakika inkübe edin. Son olarak, 20 dakika boyunca iki kez yıkayarak kalan platin klorürü durulayın. Her mahkum tamponu, numuneleri daha sonraki işlemlere hazır olana kadar dört santigrat derecede malat tamponunda saklar.

İmmünohistokimyaya başlamak için, sabit CA bir bölgeleri önce susuz reçine gömülür ve bu videonun metin protokolünde açıklandığı gibi nikel ızgaralar üzerinde 60 nanometre ultra ince kesitler elde etmek için kesilir. Daha sonra, bir parça temiz paraform üzerine pH 7.5'te% 1 ara 20 fosfat tamponu damlatın. Daha sonra ızgarayı temiz forseps ile nazikçe alın ve inkübasyonu takiben oda sıcaklığında 10 dakika bu şekilde inkübe ederek bölüm aşağı gelecek şekilde tampon üzerinde yüzdürün, bölüm tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştirerek fazla sıvıyı ızgaradan boşaltın.

Ayrıca, bölümlerin tamamen kurumamasını sağlarken, bir şerit filtre kağıdı ile hafifçe fitilleyerek EM forsepsin kolları arasında sıkışan herhangi bir çözeltiyi çıkarın. Daha sonra para filmin üzerine 50 milimolar glisin damlatın ve ızgara bölümünü oda sıcaklığında glisin çözeltisi üzerinde aşağı bakacak şekilde yüzdürün. Numune 15 dakika inkübe edilirken, ikincil antikorun hayvanından %2.5'lik bir serumu %2.5'lik bir BSA çözeltisine ekleyin ve bu karışımın bir damlasını para film üzerine yerleştirin.

15 dakikalık inkübasyondan sonra, ızgarayı filtre kağıdı ile kurutun ve 30 dakika boyunca bloke edici çözelti üzerinde yüzdürün. Oda sıcaklığında, temiz bir plastik petri kabının içine sarılmış Kim mendillerini yerleştirerek inkübasyon odasını hazırlayın. Petri kabının ortasına bir parça temiz param yerleştirin ve ardından Kim mendillerine filtrelenmiş su ekleyin.

Daha sonra paraform üzerine bir damla birincil antikor çözeltisi koyun ve numuneyi oda sıcaklığında veya gece boyunca yüzdürün Dört santigrat derecede, inkübasyonun optimal süresi ve sıcaklığının yanı sıra antikor konsantrasyonunun deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Birincil antikor ile inkübe edildikten sonra, ızgarayı her biri% 1 ara 20 fosfat tamponu ile iki dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, bir saat sonra 10 nanometre altına bağlı olarak bir ila 20 anti tavşan veya anti-US kullanarak ikincil antikor ile inkübe edin.

Oda sıcaklığında, her birini% 1 ara 20 fosfat tamponu ile iki dakika boyunca üç kez yıkayın. Ardından numuneyi beş dakika boyunca tamponlu %2 glutaraldehit içinde sabitleyin. %1 ara, 20 fosfat tamponu ile üç kez ve ardından filtrelenmiş su ile üç kez her seferinde iki dakika durulayarak fazla gluar aldehiti çıkarın.

Durulandıktan sonra, ızgarayı %2 pisuar asetat içinde 10 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, bir cam petri kabının ortasına bir parça paraform yerleştirerek CO2 içermeyen bir oda hazırlayın. Ardından, havadaki CO2'yi emmek için paraformun etrafındaki tabağa 10 ila 15 pelet sodyum hidroksit yerleştirin.

Üst kısmı birkaç dakika kapalı tutun. Daha sonra, bir mera pipeti kullanın ve küçük bir hacimde taze hazırlanmış Reynolds kurşun sitrat çözeltisini hızlı bir şekilde paraforma aktarın. CO2'nin hazneye yeniden girmesini en aza indirmek için mera pipetini yerleştirecek kadar üst kısmı açın.

Üç küçük beherde, ılık, taze kaynatılmış deiyonize su hazırlayın, ızgarayı ilk gagaya batırarak pisuar asetatını yıkayın ve 30 saniye boyunca hafifçe döndürün. Bu adımı diğer iki beherde de tekrarlayın. Durulandıktan sonra, cam Petri kabının üst kısmını, ızgarayı Reynolds kurşun sitrat çözeltisinin üzerine yerleştirecek kadar açın.

Mümkünse, kurşun sitrat üzerinde nefes almamak ve çökelti oluşumunu önlemek için bunu yaparken maske takın. 10 dakika sonra üst kısmı hafifçe açın ve ızgarayı çıkarın. Üç taze ılık damıtılmış suya sırayla batırarak üç kez yıkayın.

Ardından ızgarayı bir parça filtre kağıdı bölümünde kurumaya bırakın. Numune artık elektron mikroskobu ile görüntülenmeye hazırdır: Burada bir transmisyon elektron mikrografı olarak gösterilen hipokampusun ca bir bölgesinin ultra ince doku bölümleri, kolayca ayırt edilebilen dendritler ve parametal nöronların dikenlerini içerir. T ile gösterilen aksonal terminal ve S ile gösterilen dendritik dikenler arasındaki asimetrik sinapsların tanımlanması, post-sinaptik yoğunluğun ve iyi tanımlanmış bir plazma zarının varlığı ile kolaylaştırılır.

Nöro Grandin'in dendritik dikenlerdeki dağılımı, ImmunoGold EM etiketlemesi yardımıyla görülebilir ve bu TEM görüntülerinde oklarla vurgulanır. Nöro grandinin omurganın merkezinden omurganın plazma zarına olan radyal mesafesi normalleştirilmiş radyal mesafe olarak ölçülebilir. Sıfır mesafesi, zar üzerinde yatan bir parçacığa karşılık gelir ve bir uzaklık değeri, omurganın merkezindeki bir parçacığı temsil eder.

Nöro grandin'in dendritik omurgaya olan mesafesi daha sonra grafiksel olarak gösterilebilir. Burada normalleştirilmiş bir radyal mesafe olarak dağılımı mavi ile gösterilmiştir ve pembe ile gösterilen rastgele bir dağılımla karşılaştırıldığında, bu grafik nöro Grandin'in plazma zarına yakın olduğunu göstermektedir. Bu teknik, sinir sistemini inceleyen araştırmacıların, reseptörlerin, reseptör etkileşimli proteinlerin, taşıyıcıların ve iyon kanallarının ve korteks, talamus, koku soğanı ve beyincik dahil olmak üzere farklı beyin dokularındaki diğer pek çok şeyin lokalizasyonunu ve dağılımlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Fiksatiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek ve fiksatifleri film başlığında tutmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.