İmmünofloresan Kullanarak Fare Beynindeki Bir Presinaptik Proteinin Dağılımının Ölçülmesi

Doku gömülü bir ortama gömülü kimyasal olarak sabitlenmiş bir fare beyni dilimini alın.

Ortamı çıkarmak için dilimi tamponla yıkayın.

Membranlara nüfuz eden ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke eden bir çözelti ekleyin.

Çözeltiyi çıkarın.

Nöronal sinaptik proteinleri görselleştirmek için, dilimi birincil antikorlarla inkübe edin.

Bu antikorlar, belirli beyin bölgelerinin sinapslarında eksprese edilen bir presinaptik proteini ve referans belirteç olarak her yerde eksprese edilen bir sinaptik proteini hedefler.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın.

Primer antikorları hedef alan florofor işaretli ikincil antikorları tanıtın.

Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için tampon ile yıkayın.

Çekirdekleri DNA bağlayıcı bir boya ile boyayın.

Tampon ile yıkayın ve dilimi uygun bir montaj ortamı kullanarak monte edin.

Dilimi konfokal bir mikroskop altında görselleştirin.

Hedef proteinin farklı beyin bölgelerindeki dağılımını analiz etmek için hedef proteinin ortalama floresan yoğunluk oranlarını ve referans işaretleyiciyi hesaplayın.

Dilimleri immün boyama için hazırlamak için, PB çözeltisini beyin dilimlerini çizmeden bir kuyudan çıkarmak için plastik bir pipet kullanın. Ardından, fazla OCT'yi yıkamak için 250 mikrolitre taze PB eklemek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Dilimlerin kurumasını önlemek için her seferinde her kuyu için bu yıkamayı tekrarlayın.

Ardından, PB çözeltisini ilk kuyucuktan çıkarmak için plastik bir pipet kullanın. Kuyucuk başına 1,000 mikrolitre engelleme tamponu eklemek için 250 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve tekrar iyi çalışın. Plakayı oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde üç saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında, bir reaksiyon tüpüne kuyucuk başına 250 mikrolitre antikor tamponu.

Ardından, uygun miktarda antikor eklemek için 2 mikrolitrelik bir pipet kullanın, doğrudan çözeltiye pipetleyin ve karıştırmak için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, uygun karışımı sağlamak için bu seyreltilmiş antikoru girdaplayın.

İyice çalışarak, bloke edici tamponu plastik bir pipetle çıkarın ve kuyucuk başına 250 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Plakayı gece boyunca 4 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Ertesi gün, antikor solüsyonunu plastik bir pipetle çıkarın. Dilimleri 300 mikrolitre yıkama tamponu ile kuyucuk başına 1 yıkayın, her yıkamada üç kez 10 dakika oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda yıkayın. Yıkama sırasında, karanlıkta çalışarak, floroforla birleştirilmiş ikincil antikoru, daha önce birincil antikorla yapıldığı gibi bir reaksiyon tüpünde seyreltin.

Yıkama tamamlandıktan sonra, yıkama tamponunu plastik bir pipetle çıkarın ve oyuk başına 250 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, antikor çözeltisini plastik bir pipetle çıkarın. Bölümleri yıkama tamponu 2 ile yıkama tamponu 1 ile aynı şekilde üç kez yıkayın.

Bu yıkama sırasında, 1 ila 2000 konsantrasyon elde etmek için DAPI lekesini 0.1 molar PB ile seyreltin. Yıkama tamponunu plakadan çıkardıktan sonra, 250 mikrolitre DAPI çözeltisi ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.

DAPI çözeltisini plastik bir pipetle çıkardıktan sonra, oyuk başına 500 mikrolitre 0.1 molar PB eklemek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Stereoskopun altına bir mikroskop lamı yerleştirin. Slayta üç ayrı damla 0.1 molar PB eklemek için ince bir fırça kullanın. Fırçayı kullanarak, slayta damla başına bir dilim yerleştirin ve ardından dilimleri düzleştirin ve yönlendirin.

Tüm dilimler doğru şekilde yerleştirildikten sonra, fazla PB'yi çıkarmak için bir kağıt mendil kullanın ve dilimleri tamamen kurutmadan dikkatlice kurulayın. Ardından, slaytın üzerine 80 mikrolitre gömme ortamı ekleyin ve beyin dilimlerini gömmek için dikkatlice bir lamel ile örtün.

Işığa maruz kalmamak için slaytları örtün ve çeker ocakta bir ila iki saat kurumaya bırakın ve ardından konfokal mikroskopi için hazır olana kadar 4 santigrat derecede bir mikroskop slayt kutusunda saklayın.

El yazmasında anlatıldığı gibi farklı kanallar için tüm beyin diliminin sanal dokularını aldıktan sonra, Dosya'ya ve ardından Aç'a tıklayarak bir görüntü için tüm tek kanalları Fiji'ye yükleyin. Ardından, DAPI kanalındaki bir yarım küreyi tanımlamak için serbest seçim aracını kullanın. Düzenle'ye, ardından Seçim'e tıklayın ve ardından seçilen bölgenin maskesini oluşturmak için maske oluştur'a tıklayın.

Ardından Analiz Et'e ve ardından tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için Parçacıkları Ölç'e tıklayın, her kanal için ortalama floresan yoğunluğu değerlerini belirlemek için farklı kanallar seçtiğinizden emin olun.

Bundan sonra, tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu bir elektronik tabloya kopyalayın. İlgilenilen bir alandaki tek kanallar için ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için, alanı serbest seçim aracıyla tanımlayın.