Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

Bu prosedürün genel amacı, bir mikro RNA mikrodizi deneyi yapmaktır. Bu, önce bir mikro RNA probları kütüphanesi içeren basılı mikrodizi slaytlarının elde edilmesi ve uygun kalite ve miktarda RNA örneklerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, RNA ve A kontrollü DNA örneği floresan boyalarla etiketlenir.

Daha sonra etiketli nükleik asitler, hibridizasyon için bir mikrodizi lamına eklenir. Son olarak, mikrodizi lamı yıkanır ve taranır ve slayt yeniden oluşturulur. Sonuç olarak, tek tek mikro RNA problarının hibridizasyon yoğunlukları için slaydın analizi yoluyla mikroRNA'ların genom çapında ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, normal fizyolojik koşulların veya patolojik koşulların farklılaşmasının küresel ölçekte ifade mikro ihtiyaçlarını nasıl etkilediği gibi gen ekspresyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikrodizi üretiminin kalitesi, bir mikrodizi deneyinin başarısı için en kritik faktörlerden biridir. Küçük RNA'ları koruyan bir yöntem kullanarak RNA'yı izole ettikten ve mililitre başına iki miligrama eşit veya daha büyük bir konsantrasyonda yeniden askıya aldıktan sonra, önce yaklaşık 25 mikrogram toplam RNA'yı 0.5 mikrogram beş asal P-C-U-D-Y 5 4 7 3 asal ile karıştırarak RNA'yı 20 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde etiketleyin. ve bir TP. Daha az RNA mevcutsa, RNA miktarını ve reaksiyonu azaltın.

RNA çok seyreltikse, çökelmeye yardımcı olması için maya, TRNA gibi bir taşıyıcı ekleyin, reaksiyonu bir buzdolabının içinde buz üzerinde iki ila 24 saat inkübe edin. Daha sonra, 0.3 molar'a sodyum asetat ve ardından üç hacim etanol ekleyin ve RNA'yı gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökeltin. Slaytları ilk kez kullanmak için, 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika boyunca üç XSSC, %0,1 SDS ve %0,2 BSA'dan oluşan filtrelenmiş bir çözelti içinde önceden hibritleştirin.

Ardından, slaytları birkaç kez suya batırın. Daha sonra izopropanolde, slaytları 22 santigrat derecede beş dakika boyunca 100 kez G'de bir slayt adaptörlü bir santrifüj kullanarak kurutun. Kaldırıcı şeritleri suyla durulayın.

Daha sonra havada kurutmadan önce etanolde, bir mikrodizi hibridizasyon odası tabanının içine bir sürgü ve sürgünün üstüne bir kaldırıcı kızağı yerleştirin, böylece kaldırıcı kızağı prob alanını ve beyaz şeritlerini kaplar. Slaytla karanlıkta temas edin, çökeltilmiş etiketli RNA'yı aşağı doğru döndürün, bir kez %70 etanol ile yıkayın ve peleti havayla kurutun. Pelet kırmızımsı renkte olmalıdır.

RNA numunesi başına saflaştırılmış etiketli referans DNA'nın hacminin 15'te biri ila 100'de birini kullanarak bir hibridizasyon solüsyonu hazırlayın Hibridizasyon solüsyonunun kurumamasını sağlamak için RNA peletini yaklaşık 60 mikrolitre hibridizasyon solüsyonu ile tamamen çözün. Kuluçka sırasında, nemlendirme kuyularının her birine 20 mikrolitre su ekleyin. Mikrodizi hibridizasyon odası tabanında.

Slayta etiketli RNA ve referans DNA karışımını ekleyin. İnce bir pipet ucu kullanarak, kaldırıcı kızağının kenarına hafifçe dokunun ve emme yoluyla. Çözeltinin kaldırıcı kayması ile sürgü arasındaki boşluğa girmesine izin verin.

Hibridizasyon odası kapağını tabanın üzerine yerleştirin. Ardından hazneyi metal klipslerle kapatın. Tüm hazneyi, hazne kaseti ile birlikte gelen plastik torbanın içine koyun.

Son olarak, hazne kasetini ıslak bir kağıt havluyla bir kabın içine yerleştirin. Daha sonra kabı streç filmle örtün ve yaklaşık 24 saat boyunca 37 santigrat derece nemli hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hibridizasyondan sonra slaytları işlemek için, hazne kasetlerini tek tek sökün, bir slaytı batırın ve kaldırıcı kızağını 22 santigrat derecede iki XSSC'ye batırın.

Kaldırıcı kızağı doğal olarak kaydıraktan düşecek, kızakları 0,8 XSSC'de iki kez, ardından 0,4 XSSC'de üç kez toplam bir ila iki dakika boyunca yıkayacaktır. Slaytları, slayt adaptörlü bir santrifüj kullanarak kurutun. Ardından, slaytları bir mikrodizi tarayıcı ile tarayın ve görüntü dosyalarındaki yoğunlukları ölçmek için mavi sigorta gibi bir program kullanın.

Hibridizasyondan sonra genellikle gözenekli slayt baskısı veya slayt kullanımından kaynaklanan anormal noktaları dışlamak için tek tek noktaları inceleyin. Veri analizi ve sunumu için, mikrodiziyi yeniden kullanmak için gen yaylama ve excel gibi programları kullanın. Slaytı suyla durulayarak soyun, ardından 10 ila 20 dakika boyunca 62 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir milimolar NAOH ve 0.1 XSSC'den oluşan bir boyama kabına daldırın.

Kuluçka işlemini ikinci kez tekrarlayın. Slaytları 22 santigrat derecede hafifçe sallayarak 60 dakikaya kadar suda birkaç kez yıkayın. Slaytları bir santrifüj kullanarak kurutun ve 22 santigrat derece saklayın.

Slaytlar ön hibridizasyon olmadan kullanılabilir. Bu şekil, çok hassas ve güçlü hibridizasyon sinyallerini gösteren bir mikrodizinin taranmış bir görüntüsünü göstermektedir. Kırmızı noktalar, DY 5 47 etiketli RNA örneğinden referans DNA yeşil noktalarının hibridizasyonundan kaynaklandı ve sarı noktalar, hem DNA hem de RNA'nın aynı problara hibridizasyonundan kaynaklandı.

Mikrodizi hibridizasyonunun teknik kopyaları arasındaki Pearson korelasyon katsayıları yaklaşık 0.99'dur ve bu da mükemmel tekrarlanabilirliği gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, yalnızca mikronazı ölçmek için değil, aynı zamanda mRNA'lar gibi diğer nükleik asit türlerini ölçmek için de özel bir mikro ışın deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.