Name: Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Öğrenin, özel microRNA mikroarray deneyleriyle genom çapında microRNA ifadesini analiz etme yöntemini. RNA izolasyonu, floresan boyama ile etiketleme ve hibridizasyon adımlarını kapsar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uyuşturucu Merkezi Ulusal Enstitüsü (P50 DA 011.806) ve Amerika Birleşik Devletleri Ordusu Milli Savunma Bakanlığı (W81XWH-07-1-0183) tarafından desteklenmiştir.

1. Özel miRNA microarrays yazdırma <ol><li> Mikroarray bir üniversite veya bir şirket mikroarray çekirdek tesisi hizmetleri kullanarak slaytlar yazdırın. Mikroarray imalat kalitesi mikroarray deneyinin başarısı için en önemli faktörlerden biridir. Mümkünse birkaç hizmetleri deneyin. İdeal olarak, bir seferde 50-100 slayt yazdırmak, ve tüm slaytları iyi ayrılmış, tek tek noktalar ile aynı bakacağız. </li><li> Mikroarray destek için, biz EKSİKLİK II kaplı slaytlar kullanın. </li><li> MiRNA probları için, NCode Multi-Türlerin Mikroarray Probe V2 Set miRNA kullanın. </li><li> 10 mcM 3 x SSC oligonükleotidler çözülür ve quadruply slaytları yazdırmak. GAAPS II slaytlar için talimatlara göre ultraviyole ışınlama slaytlar sabitleyin. Elmas kalemle basılı problar ile alan ve yan işaretlemek için bir slayt etiketleyin. Mağaza at 22 ° C </li></ol> 2. Örnek hazırlama <ol><li> Herhangi bir yöntemveya reaktif sürece küçük RNA'lar korur, RNA izole etmek için kullanılan olabilir. Biz genellikle Trizol (Invitrogen), A 260nm ve A 280nm okumaları ile ölçülen RNA hazırlıkları yeterli miktar ve kalitede, toplam RNA ayıklamak için kullanın . </li><li> RNA etiketleme, 1 x tamponu (50 mM HEPES, pH 7.8, 20 mM MgCl 2, 10 mg / ml BSA,% 10 5'-PCU-DY547-3 '6 0.5 mikrogram ile toplam RNA karışımı ~ 25 mg için DMSO) içeren ~ 20 adet T4 RNA ligaz 1, ~ 10 mM DTT ve ATP için 10 x T4 RNA ligaz 1 tampon ~ 0,02-0,03 son hacmi ile desteklenebilir. </li><li> 2-24 saat boyunca bir buzdolabı içinde buz üzerinde devam etmek için etiketleme İzin. 0,3 M sodyum asetat ve etanol 3 cilt RNA çöktürün. Verimli ligasyonu ve yağış için, üzerinden 2 mg / ml total RNA çözülür ve ~ 20 ul toplam ligasyonu hacmi tutmak. <ol><li> Az RNA varsa, giriş RNA ve 5'-PCU-DY547-3 'Küçülmüş olabilir miktarı &lt;/ Li&gt; </li><li> RNA çok seyreltik ise, yağış yardım etmek için maya tRNA gibi taşıyıcı ekleyin. </li></ol></li><li> Referans DNA oligonükleotidler memeli miRNA'lar Ulysis Alexa Fluor 647 Nükleik Asit Etiketleme Seti 6 hibridizasyon işlemi için bir kontrol olarak kullanarak bir alt kümesine karşılık gelen toplam 1 mcg birleştirin ve etiket . CentriSep bir sütunu kullanarak işaretli DNA arındırmak ve -20 ° C'de karanlıkta kaydetmek </li></ol> 3. Mikroarray hibridizasyon <ol><li> Ilk kez slayt kullanmak için, 37 3 x SSC,% 0.1 SDS, 30-60 dakika süreyle% 0,2 BSA filtrelenmiş bir çözüm slaytları önceden melezleşme ° C Batmak su birkaç kez, sonra izopropanol. Az 5 dakika boyunca 22 100 g slayt adaptör ° C ile bir santrifüj kullanarak slaytları Kuru </li></ol> Not: Biz mikroarray hibridizasyon gerçekleştirmek için Corning mikroarray hibridizasyon odaları ve Lifterslips Erie Bilimsel mSeries kullanın. <ol start="2"><li> Li durulayınhava kurumadan su fterslips, daha sonra etanol,. Mikroarray hibridizasyon odasının tabanı içinde bir slayt ve slayt bir lifterslip üstüne yerleştirin. Lifterslip slayt iletişime beyaz şeritler ile prob alanı kapsayacaktır. </li><li> Karanlıkta, etiketli RNA çöktürülmüş aşağı doğru döndürün. % 70 etanol ile bir kez yıkayın ve hava pelet kuru. Pelet kırmızımsı olmalıdır. </li><li> 400 mM Na 2 HPO 4, pH 7.0,% 0.8 BSA,% 5 SDS,% 12 saflaştırılmış 1/15-1/100 ul formamid 6, RNA örnek başına etiketli referans DNA (2.4) içeren bir melezleşme çözüm hazırlayın. Eklendi referans DNA miktarı farklı oligonükleotidler (2.4) kaç etiketlenir bağlıdır. 100'ün üzerinde varsa, daha az seyreltme gereklidir. </li><li> RNA pelet ~ 60 ul hibridizasyon solüsyonu ile iyice eritin. </li><li> Corning mikroarray hibridizasyon odasının tabanı nemlendirici kuyuların her biri 20 ul su ekleyin. </li><li> T ekleslayt etiketli RNA ve referans DNA karışımı. Ince bir pipetlemeyin ucu kullanın lifterslip kenarına hafifçe dokunmak ve çözüm emme yoluyla lifterslip ve slayt arasındaki boşluk girmek için izin verir. </li><li> Hibridizasyon odasının tabanı üzerinde kapak yerine metal klipler, daha sonra Odanın mühür. </li><li> Corning oda kaset ile gelen plastik torba içinde bütün odasına koyun. </li><li> Islatılmış kağıt havlu ile bir kap içinde oda kaset (ler) yerleştirin; plastik wrap ile kabın kapağı ve 37 iç ° C ~ 24 saat boyunca nemli, hücre kültürü inkübatör. Bu önlemler (3.6, 3.9, 3.10), hibridizasyon çözüm inkübasyon sırasında kurumasına olmadığını garanti eder. </li></ol> 4. Post-hibridizasyon işleme <ol><li> Oda kasetleri tek tek sökün. 22 2 x SSC Batmak bir slayt ve onun lifterslip ° C Lifterslip doğal slayt kapalı düşecek. 0.8 x SSC yerleştirin. Yıkamaiki kez, daha sonra 0.8 x SSC slaytlar 0,4 x SSC, toplam 1-2 dakika içinde üç kez. Slaytları slayt adaptör ile bir santrifüj kullanarak kurutun. Lifterslips su ile yıkayın ve daha sonra yeniden kullanmak için kaydedin. </li><li> Slaytlar uygun herhangi bir tarayıcı, örneğin, Perkin Elmer ScanArray 5000 veya Moleküler Cihazlar Axon GenePix 4000B mikroarray tarayıcı ile tarayın. Ilgili görüntü dosyalarını elde etmek için dalga boyları yaklaşık 547 nm ile 647 nm tarayın. </li><li> Girişi, 4.2 'den resim dosyaları) piksel yoğunlukları ölçmek için bu BlueFuse gibi programlar kullanın. Daha fazla dikkate mikrodizinlerinde anormal noktalar hariç programı ile tek tek noktalar kontrol edin. Bu anormal lekeler genellikle kötü slayt baskı veya slayt işleme hibridizasyon sonra ortaya çıkar. </li><li> Veri analizi ve sunumu için, GeneSpring ve Excel gibi programları kullanın. Mikroarray veri normalleşmesi için Genel hususlar geçerli olan bu yazının kapsamı dışındadır. </li><li> Bir kez tatmin edici sinyaller af elde edilirter 4.3), 7 için yeniden mikroarray slaytlar şerit. 10-20 dakika sonra önceden ısıtılmış 62 bir boyama çanak, 1 mM NaOH ve 0,1 x SSC ° C batırmayın, su kaydırağı durulayın. Inkübasyon kez tekrarlayın. 22 nazik sallayarak 60 dakika kadar su birkaç kez slaytlar ° C yıkayın Santrifüj kullanılarak slaytlar, ve 22 mağaza ° C kurulayın </li><li> Rejenere slaytlar kullanmak için, onları tekrar ön melezleşme gerekli değildir. Sadece izopropanol tarafından takip suda yıkayın ve slaytlar sağ hibridizasyon önce kuru. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Biz büyük ölçüde küresel miRNA ifade binlerce örnek profil açıklanan prosedürleri takip, yani, pek çok farklı koşullar altında insan örnek zebrafish izole RNA'lar. Şekil 1 çok hassas ve güçlü bir hibridizasyon sinyalleri göstermek için bir mikroarray taranmış bir görüntü gösterir kaydırın. Pearson correlatimükemmel tekrarlanabilirlik gösteren ~ 0.99 7, teknik arasındaki katsayıları mikroarray hibridizasyon, çoğaltır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Hibridizasyon sonra taranan miRNA mikroarray slayt 1 Kompozit görüntü Şekil. Kırmızı noktalar, sarı lekeler, DNA ve RNA aynı sondaları tarafından döllemeler iken, referans DNA DY547 etiketli RNA örnek yeşil noktalar, döllemeler sonuçlandı.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li>
<li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li>
<li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li>
<li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li>
<li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe%3Aslide+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li>
<li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs%3A+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Mikroarray derin sıralama teknolojilerindeki son gelişmelere rağmen, DNA ve RNA yüksek verimlilik analizi için uygun bir seçenek kalır. Derin bir sıralama ile karşılaştırıldığında, mikroarray deneyler ucuzdur ve tipik bir moleküler biyoloji laboratuvarı deney ve esneklik sağlar ve zaman kazandırır veri analizi, in-house, en gerçekleştirebilirsiniz. Gelecekte, muhtemelen mikroarray&#39;ler uygundur genler, örneğin setleri yoğun sorgulamak için, bir genom veya miRNA&#39;lar transkripsiyon faktörlerinin tümünü ya da bir al...

<table border="1"><tbody><tr><th> Öğeler </th><th> Satıcı </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> NCode Multi-Türlerin Mikroarray Probe Set V2 miRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> MiRBase Sürüm 9.0 (Ekim 2006) göre tasarlanmıştır. ~ Değiştirilmeden 1140, 34-44 nt uzunluğunda oligonükleotidler, solucan, sinek, zebrafish, fare, sıçan, ve insan miRNA&#39;lar probları olarak ve iç kontrol probları gibi snoRNAs gibi bir dizi içerir. MiRNA probları dolayısıyla olgun miRNA&#39;lar ~ 44 nt boyutu tamamlayıcı dizilerinin çiftlerin. Analizi için bir ilgi belirli bir gen (ler) den miRNA&#39;lar odaklanmak. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> Toplam RNA örnekleri hazırlamak ve ölçmek için daha hızlı ve daha kolay ve mRNA analizi gibi downstream uygulamalar için uygun olmasına rağmen Ayrıca, etiketleme için küçük RNA fraksiyonu zenginleştirmiş. </td></tr><tr><td> T4 RNA ligaz 1 </td><td> Yeni İngiltere Biolabs </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis Alexa Fluor 647 Nükleik Asit Etiketleme Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> Bu kit veya benzer ürünlerin yanı sıra deneysel RNA örnekleri ya da bir kontrol RNA (yerine kontrol DNA) etiket kullanılabilir. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &#39; </td><td> Dharmacon </td><td> Özel yapılmış </td><td> Küçük RNA fraksiyonu benzer ligasyonu ile etiketli olabilir. </td></tr><tr><td> CentriSep sütunlar </td><td> Princeton Ayrımları </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII kaplı slayt </td><td> Corning </td><td> 40004 </td><td> Slayt Diğer tür de kullanılıyor olabilir. </td></tr><tr><td> Mikroarray hibridizasyon odaları </td><td> Corning </td><td> 2551 ya da 40.080 </td><td> Hibridizasyon odaları ve lamelleri başka türlü de çalışması gerekir. ~ 2 saat piyasada bulunan hibridizasyon makineleri kullanma, belirgin örneğin hibridizasyon zamanı azaltabilir. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ThErmo / Erie Bilimsel </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Özel microrna mikroarray deneyler gerçekleştirme

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNA (miRNA&#39;lar), yaygın olarak ökaryotlarda 1 olarak ifade edilir ~ 22 nükleotidler (nt) uzun RNA molekülleri büyük bir aileyiz . Kompleks genomların öncelikle bir çok sayıda post-transkripsiyonel hedef genlerin 2, 3 ekspresyonunu inhibe kullarak en az yüzlerce kodlayın. miRNA&#39;lar biyolojik süreçlerin 1 geniş bir kontrol eder. Buna ek olarak, değişen miRNA ifadesi, bu tür kanserleri gibi insan hastalıkları ile ilişkili olduğu ve miRNA&#39;lar hastalıkları ve prognozu 4, 5 biyobelirteçleri olarak hizmet edebilir. Bu nedenle, ifade ve pek çok farklı koşullar altında miRNA&#39;lar fonksiyonları anlamak önemlidir. Real-time PCR, mikroarray ve derin sıralama: Üç büyük yaklaşımlar profil miRNA ifade istihdam edilmiştir. MiRNA mikroarray tekniği yüksek verimli olma avantajı, genellikle daha az pahalı, deney ve analiz adımları carr olabilirüniversiteler, tıp fakülteleri ve ilişkili hastaneler, bir moleküler biyoloji laboratuvarı ied. Burada, özel miRNA mikroarray deneyler için bir yöntem açıklanmaktadır. MiRNA miRNA mikroarray&#39;ler prob seti üretmek için cam slaytlar basılacaktır. RNA küçük RNA türleri koruyan bir yöntem ya da reaktif kullanılarak izole edilmiş, ve ardından floresan bir boya ile etiketlenmiş. Kontrol olarak, miRNA&#39;lar bir alt kümesi karşılık gelen referans DNA oligonükleotidler de farklı bir floresan boya ile işaretlenmiştir. Referans DNA slayt ve melezleşme kalitesini göstermek için hizmet verecek ve aynı zamanda veri normalleşmesi için kullanılacaktır. RNA ve DNA karışık ve veritabanı miRNA&#39;lar en problar içeren bir mikroarray slayt melezleşmiştir. Yıkadıktan sonra, slayt görüntüler elde etmek için taranmış ve şiddetleri sayısal tek tek noktalar. Bu ham sinyalleri, ileri işlenmiş ve ilgili miRNA&#39;lar ifade veri olarak analiz edilecektir. Microarray slaytlar microarrays maliyetini azaltmak ve tutarlılık mikroarray deneyler geliştirmek için elimden ve rejenere olabilir. Aynı usul ve esaslar özel mikroarray deneylerin diğer türleri için geçerlidir.

Özel microRNA mikroarray deneyler basit bir prosedür açıklanmıştır. Adımlar, RNA, etiketleme RNA ve referans DNA izole mikroarray&#39;ler için örnekleri literatürde, mikroarray&#39;ler tarama ve niceleme hibridizasyon sinyalleri analiz içerir.

Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

mikroRNA'lar (miRNA'lar), ökaryotlarda yaygın olarak eksprese edilen, yaklaşık 22 nükleotid (nt) uzunluğundaki RNA moleküllerinden oluşan geniş bir ailedir 1. Kompleks genomlar ...

Bu prosedürün genel amacı, bir mikro RNA mikroarray deneyi gerçekleştirmektir. Bu işlem; öncelikle mikro RNA prob kütüphanesi içeren basılı mikroarray lamlarının temin edilmesi ve uygun kalite ile miktarda RNA örneklerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, RNA ve kontrol DNA örneği floresan boyalarla işaretlenir.Ardından, işaretlenmiş nükleik asitler hibridizasyon için bir mikroarray lamına eklenir. Son olarak, mikroarray lamı yıkanır, taranır ve lam yeniden üretilir. Nihayetinde, münferit mikro RNA problarının hibridizasyon yoğunlukları için lamın analizi yoluyla microRNA'ların genom genelindeki ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, normal fizyolojik koşulların veya patolojik durumların, küresel ölçekte mikro ifade gereksinimlerini nasıl farklı şekilde etkilediği gibi gen ekspresyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikroarray üretiminin kalitesi, bir mikroarray deneyinin başarısı için en kritik faktörlerden biridir. Küçük RNA'ları koruyan bir yöntem kullanarak RNA'yı izole ettikten ve 2 mg/mL veya daha yüksek bir konsantrasyonda yeniden süspanse ettikten sonra; yaklaşık 25 µg toplam RNA'yı, T4 RNA Ligaz 1D TT ve ATP ile desteklenmiş 1X HEPs tamponu içinde 0,5 µg 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' ile karıştırarak 20 µL reaksiyon hacminde RNA'yı işaretleyin. Eğer daha az RNA mevcutsa, RNA miktarını ve reaksiyonu orantılı olarak azaltın.RNA çok seyreltikse, çöktürmeye yardımcı olması için maya tRNA'sı gibi bir taşıyıcı ekleyin ve reaksiyonu bir buzdolabının içinde buz üzerinde iki ila 24 saat boyunca inkübe edin. Ardından, sodyum asetat ekleyerek 0,3 molar düzeye getirin, ardından üç hacim etanol ekleyin ve RNA'yı -20 °C'de gece boyunca çöktürün. Slaytları ilk kez kullanmak için, 37 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca 3 XSSC, %0,1 SDS ve %0,2 BSA içeren filtrelenmiş bir çözeltide ön hibritleme yapın.Ardından, lamları birkaç kez suya daldırın. Daha sonra izopropanol içerisinde, lam adaptörü bulunan bir santrifüj kullanarak 22 °C'de 5 dakika boyunca 100 ×g hızında lamları kurutun. Kaldırıcı şeritleri suda durulayın.Ardından, havada kurutmadan önce etanol içinde, bir lamı bir mikro-dizi hibridizasyon odası tabanına ve lamın üzerine, yükseltici şerit prob alanını ve beyaz şeritlerini kapatacak şekilde bir yükseltici şerit yerleştirin. Lamla karanlıkta temas kurun, çöktürülmüş işaretli RNA'yı santrifüjleyerek çöktürün, bir kez %70 etanol ile yıkayın ve peleti havada kurutun. Pelet kırmızımsı renkte olmalıdır.RNA örneği başına, saflaştırılmış işaretli referans DNA'nın hacimce 15'te birinden 100'de birine kadar olan miktarıyla bir hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. Hibridizasyon çözeltisinin kurumasını önlemek için, RNA peletini yaklaşık 60 µL hibridizasyon çözeltisi ile tamamen çözün. İnkübasyon sırasında, mikroarray hibridizasyon odası tabanındaki nemlendirme kuyucuklarının her birine 20 µL su ekleyin.İşaretli RNA ve referans DNA karışımını lamın üzerine ekleyin. İnce bir pipet ucu kullanarak, kaldırıcı lamın kenarına hafifçe dokunun ve vakum yoluyla çözeltinin kaldırıcı lam ile lam arasındaki boşluğa girmesini sağlayın.Hibridizasyon odası kapağını tabanın üzerine yerleştirin. Ardından odayı metal klipslerle mühürleyin. Tüm odayı, oda kasetiyle birlikte gelen plastik torbanın içine koyun.Son olarak, oda kasetini ıslak bir kağıt havlu bulunan bir kabın içine yerleştirin. Ardından kabın üzerini streç filmle kapatın ve yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C'lik nemli bir hücre kültürü inkübatöründe bekletin. Hibritleşme sonrası slaytları işlemek için, oda kasetlerini tek tek sökün; bir slaytı ve beraberindeki kaldırıcı lamı 22 °C'de iki XSSC içine daldırın.Kaldırıcı şerit slayttan kendiliğinden düşecektir; slaytları iki kez 0,8 XSSC ile, ardından toplam bir ila iki dakika boyunca üç kez 0,4 XSSC ile yıkayın. Slaytları, slayt adaptörlü bir santrifüj kullanarak kurutun. Ardından, slaytları bir mikroarray tarayıcı ile tarayın ve görüntü dosyalarındaki yoğunlukları nicelleştirmek için blue fuse gibi bir program kullanın.Hibridizasyon sonrası genellikle gözenekli slayt basımından veya slayt taşıma işlemlerinden kaynaklanan anormal spotları dışlamak için bireysel spotları inceleyin. Veri analizi ve sunumu için, mikro diziyi yeniden kullanmak üzere gene springing ve excel gibi programlar kullanın. Slaydı suyla durulayarak temizleyin, ardından 62 °C'ye önceden ısıtılmış 1 mM NaOH ve 0.1 X SSC içeren bir boyama kabına 10 ila 20 dakika boyunca daldırarak sıyırın.İnkübasyonu ikinci kez tekrarlayın. Lamları, 22 °C'de hafifçe çalkalayarak 60 dakikaya kadar suyla birkaç kez yıkayın. Lamları bir santrifüj kullanarak kurutun ve 22 °C'de saklayın.Slaytlar ön hibridizasyon yapılmadan kullanılabilir. Bu şekil, oldukça hassas ve güçlü hibridizasyon sinyallerini gösteren bir mikro-dizinin taranmış görüntüsünü sunmaktadır. Kırmızı noktalar referans DNA hibridizasyonundan, yeşil noktalar DY 5 47 ile işaretlenmiş RNA örneğinden ve sarı noktalar ise hem DNA hem de RNA'nın aynı problara hibridizasyonundan kaynaklanmıştır.Mikrodizi hibridizasyonunun teknik tekrarları arasındaki Pearson korelasyon katsayıları yaklaşık 0,99'dur ve bu da mükemmel bir tekrarlanabilirliğe işaret eder. Bu videoyu izledikten sonra, sadece mikronazı miktarını belirlemek için değil, aynı zamanda mRNA'lar gibi diğer nükleik asit türlerini belirlemek için de özel bir mikrodizi deneyinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

performing-custom-microrna-microarray-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Bu videoda, spesifik gen ekspresyonunu ölçmek için antikor mikrodizisi kullanarak miRNA transfekte edilmiş akciğer kanseri hücrelerindeki protein ekspresyonunu inceleme tekniği açıklanmaktadır. Özellikli protokolde, hücre döngüsünü ve anjiyogenezi durdurmada kombinatoryal bir miRNA tedavisinin aktivitesinin tanımlanması için antikor mikrodizisi gerçekleştiriyoruz.

Antikor mikrodizisi: miRNA ile tedavi edilen akciğer kanseri hücrelerinin protein ekspresyonunu incelemek için bir teknik

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Burada, BioMILD kabul edilen detaylı Protokolü deneme erken akciğer kanseri teşhis için dolaşımdaki mikroRNA imza Sınıflandırıcısı sınama gerçekleştirmek için eleme mevcut.

MikroRNA tabanlı sıvı biyopsi: Plazma miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC) akciğer kanseri süzmek için bir deneyim

Burada biz akciğer ifade değerlendirmek için bir yöntem tarif tahmin edilmektedir miRNAs inflamatuar genler düzenleyen fare kullanarak ozon için maruz veya hava estrous döngüsünün farklı aşamalarında filtre.

Akciğer mikroRNA profil oluşturma arasında Estrous döngüsünde ozon maruz fareler

Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Öğrenin, özel microRNA mikroarray deneyleriyle genom çapında microRNA ifadesini analiz etme yöntemini. RNA izolasyonu, floresan boyama ile etiketleme ve hibridizasyon adımlarını kapsar.

Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

Daha fazla video keşfet