Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA'lar ve microRNA, Profilleme
3 Aralık 2010
Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.
Bu prosedürün genel amacı, QPCR tabanlı dizilerin hızlı ve güvenilir bir şekilde otomatik kurulumuna izin vermektir. Bu, önce dizi için astar setlerinin hazırlanması ve taranacak örnek ana karışımların ayarlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna Eloqua numune ana karışımını ve astar setlerini doğru bir şekilde Eloqua numunesi, ana karışım ve astar setlerini doğru bir şekilde yerleştirmek için otomatik bir robotik PCR kurulumu veya bir matris elektronik pipet sistemi kullanılır.
Hazırlandıktan sonra, 384 kuyulu PCR reaksiyonu, ışık döngüleyici dört 80 siber tabanlı PCR programı ile çalıştırılır. Prosedürün son adımı, QPCR verilerini analiz etmek ve her biri belirli bir mRNA'yı hedefleyen, test edilen her bir primer çifti için göreceli ekspresyon seviyelerini belirlemektir. Sonuç olarak, büyük mRNA kümelerinin ekspresyonundaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Bu nedenle, özel olarak geliştirilmiş diziler, QPCR tabanlı profilleme yoluyla viral enfeksiyonun anahtarı olan tüm pre mikro RNA profillerini, spesifik yolları veya molekülleri hedefleyebilir. Merhaba, ben Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nden Dirk DMA. Bugün size gerçek zamanlı QQPC rra'yı nasıl kuracağınızı göstereceğiz ve size iki yöntem göstereceğiz.
Biri düzensiz pipet kullanıyor, diğeri ise robot kullanıyor. Bu teknolojiyi, insan tümörlerindeki pre mikroRNA'ları ve olgun mikroRNA'ları ölçmek için kullanıyoruz. Bugünkü gösteri Pauline Chu ve Kristen bu tarafından yapılacak.
Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, 96'da 186 primer çifti içeren astar plakalarını alın. Eksi 20 santigrat derecede saklanan 0,5 pikamol'de iyi biçimlendirin.
Plakaları oda sıcaklığında çözdürdükten sonra, kısa bir süre vorteksleyin ve santrifüjleyin. Ayrıca, siber yeşili oda sıcaklığında iki kez PCR karışımını çözdürün, her 96 kuyulu astar plakasının kurulumu için dört ana karışım tüpüne ihtiyaç duyulacaktır. Dört adet iki mililitrelik einor tüpünün her birinde reaksiyon başına dört mikrolitre siber yeşil karışımı, üç mikrolitre PCR sınıfı su ve 10 ila 20 nanogram numune DNA'sı veya CDNA'yı birleştirerek ana karışımı hazırlayın.
Her tüp, yaklaşık 100 reaksiyon için yeterli ana karışım içermeli ve pipetleme atıkları için fazlalığa izin vermelidir. Karıştırmak için einor tüplerini girdaplayın. Robotun başlatılması ve EVO aşınma programının yüklenmesi ile özgürlük Tecan EVO robotunu kullanarak öncü mikro RNA testinin kurulumuna başlayın.
Ardından, pipetleme doğruluğunu engelleyecek hava kabarcıklarını temizlemek için robotu 30 mililitre sistem sıvısıyla üç kez yıkayın. Ardından, robot platformunu 384 kuyulu bir plaka ve 96 kuyulu astar plakası içerecek şekilde ayarlayın. Master, %2 çamaşır suyu içeren bir tekneyi, dolu bir sistemi, sıvı kabını ve boş bir atık kabını karıştırır.
Programın sonunda iki kez çalıştır'ı seçerek otomatik robot çalışmasına başlayın. 384 kuyulu plakayı çıkarın ve hafif döngüleyici dört adet 80 tavan folyosu ile kapatın. Ardından plakayı santrifüjleyin.
Mühürlü 384 kuyulu plakayı kısaca otelin birinci konumuna yerleştirin. Ardından, yeni ana karışımlar ve yeni bir 384 kuyulu plaka ile ikinci astar plakası için bu işlemi tekrarlayın. Ortaya çıkan mühürlü 384 dünya plakasını otelin ikinci konumuna yerleştirin.
Light cycler'ı otelden yüklemek için yeni bir EVO aşınma programı açın ve döngü parametrelerini ayarlayın. Ardından iki kez çalıştır'ı seçin. Freedom Evo, her plakayı otomatik olarak ışık döngüleyiciye yükleyecek ve siber yeşil olan HRM döngü programını çalıştıracaktır.
Tamamlandığında. Robotu kullanmaya alternatif olarak yazılı protokolde açıklandığı gibi sonuçları gözden geçirin ve analiz edin. Ana karışım tüpünün içeriğini bir hazneye yerleştirmeye başlamak için bir matris elektronik çok kanallı pipet kullanılabilir.
Elektronik pipeti, iki adet sekiz mikrolitrelik dağıtım adımı ve ardından bir temizleme adımı ile 16 mikrolitre ana karışımı aspire edecek şekilde ayarlayın. Pipeti ayarladıktan sonra 16 mikrolitre ana karışımı aspire edin ve 384 tekerlek plakasına dağıtmaya başlayın. İlk sekiz mikrolitreyi, A'dan O'ya kadar olan satırları kullanarak birinci sütundaki diğer her satıra dağıtın ve sonraki sütunu boş bırakın.
İkinci sekiz mikrolitreyi üçüncü sütunun aynı sıralarına dağıtın. Ardından bir atık kabının üzerini boşaltın ve bu alternatif satırlar ve alternatif sütunlar bırakma düzenini izleyerek uçları atın. Ana karışım ikisini pipetlemek için plakaya beş döngü daha dağıtın.
Ana karışım ile aynı satırları kullanın, ancak ikinci sütunla başlayın. Bu prosedürü, sırasıyla birinci ve ikinci sütunlardan başlayarak, üçüncü ve dördüncü ana karışımlar için tekrarlayın, ancak bu sefer gül B'den P'ye kullanın. İki mikrolitreyi aspire etmek için bir elektronik pipet ayarlayın ve takip edilecek bir temizleme adımıyla iki mikrolitreyi dağıtın.
96 kuyulu bir astar plakasının bir satır A'dan H'ye kadar olan iki mikrolitre astarı diğer her bir kürek sütununa, 384 kuyulu plakadan birine aktarın, bir atık kabı üzerinden boşaltın ve uçları atın. Birinci ve ikinci sütunların kalan üç ana karışımı için quatt astar için bu deseni tekrarlayın. Ardından, her bir astar sütunu için 384 kuyulu plakadaki her iki sütunun üzerinden hareket eden 96 kuyulu astar plakasının iki ila 12 numaralı sütunları için bu işleme devam edin.
Ardından, plakaları hafif bir döngüleyici tavan, folyo ve santrifüj ile kapatın. Santrifüjlemeyi kısa bir süre sonra. Plakaları dört 80 hafif bir döngüleyiciye yerleştirin ve siber yeşil olanı kullanarak plakaları döndürün HRM algılama formatı.
Daha önce olduğu gibi aynı döngü koşullarını kullanarak, taze hazırlanmış ana karışımları kullanarak taze bir 384 oyuklu plakaya iki Eloqua astar plakası kullanarak bu prosedürü tekrarlayın. Öncü mikro RNA imzaları, yeni bir QPCR tabanlı dizi kullanılarak profil oluşturma yoluyla ortaya çıkar. U altıya normalize edilen ortalama delta BT hesaplandı ve standardize değerler diziye yüklendi.
Isı haritaları olarak görüntülenen üç farklı küme veren küçük yazılım. Her bir öncü mikro RNA'nın nispi ekspresyonu gösterilir, kırmızı ve mavi sırasıyla nispi ekspresyonda bir artış ve azalmayı temsil eder. Renk yoğunluğu, ifade değişikliğinin derecesini gösterir.
Öncü mikroRNA'ların çoğu, beklendiği gibi küçük, önemsiz değişiklikler geçirdi. Bununla birlikte, öncü mikroRNA'ların küçük bir kısmı, zaman seyri deneyi boyunca önemli ölçüde artmıştır. Ek olarak, bazı öncü mikroRNA'ların nispi seviyesi önemli ölçüde azaldı.
Bazı durumlarda. Ayrıca ısı haritası analizinde bir araya gelirler. Deneye bağlı olarak, viral enfeksiyona, öncü mikroRNA'ların hücre tipine özgü ekspresyonuna veya ortak bir molekül veya sinyal yolu tarafından düzenlenen öncü mikroRNA'lara bağlı kümeler ortaya çıkabilir.
Posey sarkomu ile ilişkili herpes virüsü negatif örneklemden elde edilen ortalama döngü eşikleri veya cts, dörtlü kopya çalıştırılarak gösterilir. Daha da önemlisi, Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsü gecikmesi ile ilişkili nükleer antijen veya KSHV Lana, bu örnekte oldukça hassas QPCR dizisi tarafından tespit edilmedi. Bununla birlikte, hem iç kontrol U altı hem de let yedi, yüksek oranda eksprese edilen bir insan öncüsü mikro RNA, tespit edilebilir seviyelerde eksprese edildi.
Son olarak, beklendiği gibi, PCR dereceli suyun negatif kontrolü A-Q-P-C-R ürünü vermedi. İki farklı primer için erime eğrisi analizi. Aynı örnekleme kopyası kullanılarak gösterilir.
Erime sıcaklığının iki primer çifti için farklı olduğu açıktır, ancak numune her kopya için tam olarak aynı sıcaklıkta ermektedir. Kötü veya potansiyel olarak kontamine olmuş bir numunenin belirtileri, iki farklı girdi kaynağının varlığını düşündüren birkaç erime zirvesi içerebilir. Size bir robot kullanarak gerçek zamanlı bir QPCR deneylerinin nasıl kurulacağını gösterdik.
Tüm kontrolleri ve mümkün olduğunca çok sayıda temizlik genini dahil etmeniz önemlidir. Bu yüzden izlediğiniz için teşekkür ederim ve deneylerinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hem otomatik hem de manuel yöntemler kullanılarak QPCR için ön-mikroRNA 96 kuyuluk dizilerin kurulumunu ve analizinin nasıl yapıldığını gösterir. Prosedür, QPCR tabanlı dizilerin hızlı ve güvenilir bir şekilde otomatik kurulumunu sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoteknoloji
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- QPCR dizileri için primer setlerinin hazırlanması.
- Tarama için numune master karışımlarının kurulumu.
- Doğruluk için robotik sistemlerin veya elektronik pipetlerin kullanımı.
- mRNA ekspresyon seviyelerini belirlemek için QPCR verilerinin analizi.
Çalışmanın Amacı
- QPCR dizilerinin kurulumunu otomatik hale getirmek.
- Doğru numune hazırlığını sağlamak.
- Çoklu mRNA'ların ekspresyon seviyelerini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Primer setlerinin ve numune master karışımlarının hazırlanması.
- Otomatik robotik PCR kurulumu veya manuel pipetleme.
- Bir ışık döngüsü kullanarak PCR reaksiyonlarının çalıştırılması.
- mRNA'ların göreceli ekspresyon seviyeleri için veri analizi.
Ana Sonuçlar
- Her iki yöntem kullanılarak QPCR dizilerin başarılı kurulumu.
- mRNA ekspresyon seviyelerinin doğru belirlenmesi.
- Büyük mRNA setlerini analiz etme kabiliyeti.
- Güvenilir otomatik süreçlerin gösterimi.
Sonuçlar
- Otomatik kurulumlar QPCR'de verimliliği artırır.
- Manuel yöntemler doğru sonuçlar için geçerli olmaya devam ediyor.
- Sonuçlar mRNA ekspresyon değişiklikleri hakkında bilgiler sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Profiling pre-microRNAs and mature microRNAs using qPCR arrays enables biopharma R&D teams to interrogate post-transcriptional regulatory networks with high sensitivity and low input requirements. This approach supports target validation by linking miRNA expression changes to disease-relevant pathways, particularly in oncology and infectious disease models. The method’s cost-effectiveness and compatibility with automated workflows enhance reproducibility and scalability for screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of miRNA processing stages by profiling both precursor and mature forms to identify regulatory bottlenecks.
- Operational Value: Uses SYBR-based chemistry and internal controls (e.g., U6) to reduce variability and improve data reliability across replicates.
- Predictive Value: Simultaneous detection of pre-miRNA and mature miRNA changes provides insight into Dicer activity and pathway-specific regulation, supporting mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The 186-primer array allows high-throughput profiling of miRNA precursors across disease models, such as human tumors or virus-infected cells.
- Operational Value: Compatible with automated robotic setup (e.g., Tecan EVO) or matrix electronic pipettes, ensuring precise reagent dispensing into 384-well plates.
- Scalability: Enables rapid screening of large sample sets with minimal hands-on time, supporting assay standardization and cross-lab reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Detected changes in pre-miRNA levels (e.g., let-7a) reflect mature miRNA expression, serving as early biomarkers in preclinical models.
- Pathway Insight: Clustering of miRNA expression patterns (via heat maps) reveals co-regulated networks linked to viral infection (e.g., KSHV latency) or cell-type-specific signaling.
- Risk Mitigation: Absence of false positives (e.g., no KSHV Lana detection in negative controls) confirms assay specificity, reducing off-target concerns in target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early-stage hypothesis testing and assay readiness for downstream target validation and lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports functional interrogation of miRNA biogenesis pathways by quantifying precursor accumulation or processing defects.
- Screening: Generates quantitative CT values normalized to housekeeping genes, enabling comparative expression analysis across conditions.
- Analytics: Delta-CT calculations and heat map visualization facilitate identification of significantly altered miRNAs for follow-up validation.
- Translational Research: Links miRNA expression changes to biological phenotypes (e.g., viral infection response), supporting biomarker relevance assessment.
- Enterprise Reuse: Array design can be adapted to custom pathway- or pathogen-specific miRNA libraries, promoting reuse across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into miRNA regulation, reducing ambiguity in target pathway analysis.
- Operational Value: Automated setup improves reproducibility; manual pipetting option ensures accessibility for low-throughput labs.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions based on miRNA expression signatures, reducing investment in poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying miRNAs with consistent, significant expression changes across replicates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR design, including primer validation and normalization strategy selection.
- Needs access to real-time PCR systems with HRM or fluorescence detection capabilities (e.g., LightCycler 480).
- Demands standardized sample preparation (RNA quality, cDNA synthesis) to ensure comparable results across runs.
- Requires optimization for different input types (e.g., tumor tissue, cell lines) and adaptation to alternative miRNA libraries.
- Limited to relative quantification; absolute quantification requires standard curves not described in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
3:03
Setup of the Pre-miRNA Assay Using the Freedom Tecan Evo Robot
2:00
qPCR Reaction Sample Setup
8:00
Representative Results for Profiling of Pre-micro RNAs and MicroRNAs using qPCR Arrays
5:17
Setup of the Pre-miRNA Assay Using the Matrix Electronic Multichannel Pipette
1:21
Introduction
