Name: Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, yeni doğan sıçan kardiyomiyositlerini fibrin hidrojel içinde kapsülleyerek kalp doku mühendisliği uygulamaları geliştirmeyi. Bu yöntem, miyokard infarktüsü tedavileri için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (Ödül # R00HL093358 için LDB) - Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
<li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li>
<li>Krebs, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+poly%28lactic-co-glycolic%29+acid+scaffolds+with+in+situ+pore+formation+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering.</a> Acta. 5, 2847-2859 (2009).</li>
<li>Zimmermann, W. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li>
<li>Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+distension+of+fibrin-based+tissue+constructs%3A+evidence+of+adaptation+during+growth+of+engineered+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).</li>
<li>Jockenhoevel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+gel+-+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cardio-thoracic+surgery+%3A+official+journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).</li>
<li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sourcing+and+culture+conditions+for+fibrin-based+valve+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs.</a> Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).</li>
<li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin-based+arterial+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+66+%28Part+A%22%5BJournal%5D)">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Miyokard sistemi in vitro model tutarlı ve uygulanabilir bir üç boyutlu fibrin jeller sonuçları yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde kapsülleme. Hücreleri sürüklenmiş, metabolik olarak aktif ve doğal kalp dokusu 12 ile uyumlu bir ekstrasellüler matriks remodeling, sıkıştırma ve yeniden yeteneğine çünkü Fibrin tercih edilen bir biyomateryal. Kardiyomiyositlerde bu ortamda kendilerini hizalamak için izin verdiği için, kendi işlevselliği, izotropik dokuların 6 ile karşılaştırıldığında daha büyük kasılma gücü ile sonuçlanan kalp kasının daha karakteristik. Potansiyel terapötik uygulamalar için, canlılığı ve işlevsellik hem de teşvik eden bir malzeme içinde hücreleri kapsüllemek için gerekli. Protokolleri fibrin ağ oluşturarak bir üç boyutlu mikroçevresinin kardiyak hücre davranışını kontrol etmek için verimli ve doğru yolu göstermek sundu. Birkaç olası sorunları bu yapıları oluşturma ve kültür sırasında ortaya çıkabilir. Bir yapı işlevselliği önemli ölçüde etkileyecek önce kapsülleme hücre canlılığı bakım, olası sorunu. Çaba, izolasyon ve fibrin jel içindeki hücrelerin kapsülleme arasındaki süreyi azaltarak yalıtım hücre ölümü sınırlamak için yapılmalıdır. Oluşturur sıkı bir zamanlamaya göre her gün medya sağlanmalıdır. Buna ek olarak, kullanılan tüm çözümler homojenliği sağlamak için önemlidir. Fibrinojen, trombin ve hücrelerin karışımı heterojen bir ortam oluşturur, ECM bozulmasina hücrelerinin yeteneği, mekanik çift ve sözleşme potansiyel tıkalı. , Mühendislik doku devamlılığı bozuklukları önlemek için yapıları enjeksiyon sırasında hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için ayrıca önemlidir. Bu sorunu hafifletmek için bir yolu, enjektörün içine inşa yapmak ve yavaş yavaş enjekte etmek için gerekli olandan daha fazla jel beraberliktir. Son olarak, bir kez fibrin matriks kurdu ve 24 saat boyunca kültür ortamı olmuştur, fibrin jel hücre tabanlı sıkıştırma teşvik etmek için halka kalıbın kenarlarından inşa ayırmak için esastır. Kalıp ortasında inşa tutulması, gaz ve besin alışverişi kolaylaştırır. Halka kalıp iki bağlılık da istenilen hücre hizalama bozabilir. Sağlık ve Veteriner Hekimler Birliği Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüleri kuralları uyarınca kabul edilebilir bir yöntemdir bu protokolü euthanization yöntemi, bu bilinçli dekapitasyon olarak kullanılır dikkat etmek önemlidir. Ancak, bazı kurumlar, yenidoğan sıçanlar için dekapitasyon anestezi kullanımı tavsiye ederiz. Hipoksik koşullar altında eksize kalp doku / hücreler için zaman az miktarda olması nedeniyle bilinçli dekapitasyon seçtiniz. Nispeten küçük miktarda hipoksi, iskemi ve bu protokol sonuçlarını önemli ölçüde etkileyecek potansiyel miyosit ölüm, miyosit yol açabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Potasyum klorür </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Sodyum fosfat dibazik </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat tekbazlı </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91308-12 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> ince cımbız </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-20 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> büyük makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91401-14 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> mikro-makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91501-09 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> bisturi sapı </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10008-13 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> neşter bıçak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-918-5A </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> Emici tezgah underpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> steril örtüyü </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> otoklav torbası </td><td> Balıkçı </td><td> 01-812-54 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> gazlı bezle </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> betadin </td><td> Purdue Ürünler </td><td> 67618-150-01 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> steril eldiven </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> steril transferi pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> kollajenaz </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Izolasyon </td></tr><tr><td> Teflon çubuk 1 / 4 inç çapında </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Kalıp parçası </td></tr><tr><td> Teflon tüp, 1 / 4 inç ID, 1 / 2 inç OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Kalıp parçası </td></tr><tr><td> Silikon O-Ring 1 / 4 inç kimliği, 1 / 2 inç OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Kalıp parçası </td></tr><tr><td> Teflon tüp 1 / 4 inç kimliği, 5 / 16 inç OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Kalıp parçası </td></tr><tr><td> Kendall monoject şırınga 6cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Kalıp parçası </td></tr><tr><td> BD şırınga 3cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Kalıp parçası </td></tr><tr><td> Sığır Fibrinojen </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> Sığır Trombin </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> 1 M Hepes </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> 0.2 mikronluk filtre </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> 40 mikron hücre süzgeçler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> 0.45 mikron şişe top filtre </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> cam ön filtre </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 inç uzunluğunda iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-5D </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> 21G 1 inç iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> kavanoz inşa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Kurmak </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Medya </td></tr><tr><td> at serumu </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Medya </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Medya </td></tr><tr><td> aminocaproic asit </td><td> Acros Organics </td><td> 103305000 </td><td> Medya </td></tr><tr><td> askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Medya </td></tr><tr><td> insülin </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Medya </td></tr><tr><td> Paraformaldehit,% 16 </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 15710 </td><td> Histoloji </td></tr><tr><td> Optimal kesme sıcaklığı (OCT) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Histoloji </td></tr><tr><td> 2-methylbutane </td><td> Balıkçı </td><td> 03551-4 </td><td> Histoloji </td></tr><tr><td> Fare MYH1/2/4/6 birincil antikor </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji </td><td> SC-32.732 </td><td> Histoloji </td></tr><tr><td> Tavşan Konneksin 43 primer antikor </td><td> Hücre Sinyal Teknolojisi </td><td> 3512 </td><td> Histoloji </td></tr><tr><td> Dylight 549-konjuge eşek anti-fare sekonder antikoru </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratuvarları </td><td> 715-505-151 </td><td> Histoloji </td></tr><tr><td> Dylight 488-konjuge Donke anti-tavşan ikincil antikor </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratuvarları </td><td> 711-485-152 </td><td> Histoloji </td></tr><tr><td> Ölü / Canlı tahlil </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Analiz </td></tr></tbody></table>

kalp doku mühendisliği fibrin hidrojel kardiyomiyositlerinin kapsülleme

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Üç boyutlu hidrojel ortamda kültür hücreleri, doku mühendisliği yapıları geliştirmek ve bunun yanı sıra, çeşitli in vitro kültür koşullar altında hücresel yanıtları eğitim için önemli bir tekniktir. Üç boyutlu ortamda hücrelerin daha yakından gözlemlemek tüm boyutları 1 mekanik ve kimyasal uyaranlara uygulama nedeniyle, in vivo olarak ne taklit eder. Üç boyutlu hidrojeller ya PEG-DA, 2 ve PLGA 3 ya da doğal olarak meydana gelen proteinler, kolajen 4, hyaluronik asit 5 veya fibrin 6,7 gibi bir dizi olarak sentetik polimerler yapılabilir. Fibrin, doğal olarak meydana gelen kan pıhtılaşma proteini, oluşturulan Hidrojeller, vücudun doğal yara iyileşmesi 8 süreçleri bir parçası olan bir ağ oluşturmak için polimerize . Fibrin doku mühendisliği için ideal bir geçici iskele yapımı, hücre parçalanabilir ve 9 potansiyel otolog. Burada üç gün eski sıçan yavrularının ve fibrin doku mühendisliği için hidrojel yapıları kapsülleme hücreleri hazırlık yenidoğan kardiyomiyositlerinin izolasyon detaylı olarak açıklanmaktadır. Yenidoğan miyositler kalp dokusu oluşumu ve mühendislik 4 in vitro çalışmalarda kullanılan ortak bir hücre kaynağı. Fibrin jel enzim trombin ile karıştırılarak fibrinojen tarafından oluşturulur. Trombin, fibrinojen, diğer monomerlerin 10 ile etkileşim bağlayıcı siteleri ifşa fibrinopeptides FPA ve FPB keser . Bu etkileşimler monomerlerin hidrojel örgü oluşturan liflerin içine kendini monte neden olur. Fibrinojen için trombin oranı değiştiren, ya da trombin kalsiyum oranı bu enzimatik reaksiyon zamanı ayarlanabilir olduğundan, tek enjeksiyon bir dizi farklı geometrileri 11,12 yapıları kalıp yapabilirsiniz. Ayrıca biz 13 kültür sırasında jel sınırlamak nasıl ortaya çıkan doku uyumuna üretebilirsiniz. Kültür için tasarlanmış kardiyak doku yapıları statik koşullar altında iki hafta sonra kalp hücrelerinin yapı modelini yenilemeye başladı ve 6 elektrik pacemaker koşulları altında bir daralma güç oluşturabilir. Bu protokolün bir parçası olarak, biz de miyokardın fonksiyonel kalp kası tarafından üretilen etkin bir güç analizi (Canlı-Dead son hücre canlılığını belirlemek için elektrik stimülasyonu gibi yöntemler üzerine inşa dahil olmak üzere kültür süre sonra doku mühendisliği analiz yöntemleri tanımlamak assay) ve daralma (miyozin ağır zincir veya MHC) ve miyositler arasında hücresel kaplin (43 veya Cx43 Konneksin) için önemli tipik proteinlerin ifade ve morfolojisini incelemek immünohistolojik boyama.

Biz yenidoğan kardiyomiyositlerde izolasyonu ve doku mühendisliği için fibrin hidrojel yapıları kapsülleme hücrelerin hazırlanması açıklar. Biz elektrik stimülasyonu ve hücre canlılığı ve immünohistolojik boyama üzerine oluşturulan etkin bir güç de dahil olmak üzere kültür süre sonra doku mühendislik miyokardın analiz yöntemleri açıklanmaktadır.

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Hücrelerin üç boyutlu bir hidrojel ortamında kültüre edilmesi, doku mühendisliği için konstrüktlar geliştirmenin yanı sıra ... incelemek için önemli bir tekniktir.

Bu prosedürün genel amacı, kardiyak doku mühendisliği için neonatal sıçan kardiyomiyositlerini bir FI hidrojeli içine kapsüllemektir. Bu işlem, öncelikle iki ila üç günlük neonatal sıçan yavrularının kalplerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kalpler kollajenaz ile sindirilir.Kardiyak hücreleri hücre dışı matriksten ayırmak için, kardiyak hücreler daha sonra bir fibrin hidrojeline kapsüllenir. Son olarak, konstrüktler iki hafta boyunca kültüre edilir. Nihayetinde sonuçlar, konstrüktlerin elektriksel stimülasyona yanıt olarak yaklaşık 1.3 milli Newton'luk bir seğirme kuvveti üretme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.Ayrıca, konstrüktün hizalanmış yapısı, miyosit proteinlerinin histolojik boyaması aracılığıyla gözlemlenebilir. Mühendislik ürünü miyokardiyal konstrüktler, skarlaşmış dokunun mühendislik ürünü dokuyla onarılmasına veya değiştirilmesine olanak tanıyarak, yaralanma veya hastalık sonrası kardiyak fonksiyonu iyileştirip miyokard enfarktüsü için potansiyel bir tedavi yöntemi olarak hizmet edebilir. Bu konstrüktler, çeşitli stimülasyonların kontraktil kuvvetler üzerindeki etkilerini ve normal ile patofizyolojik kardiyak gelişimi incelemek için değerli bir in vitro model sistemi olarak kullanılabilir.Her kişi için besiyerini hazırlayıp cerrahi aletleri sterilize ettikten sonra, davulbaşlı çekerlecin çalışma yüzeyine emici bir tezgah pedi yerleştirin ve üzerini steril bir örtüyle örtün. Steril cerrahi aletleri ve 4x4 boyutunda bir gazlı bezi steril örtünün üzerine yerleştirin. Aletlere dokunmadan, steril bir 20 numara bistüri bıçağı açın ve örtünün üzerine yerleştirin.Yavrunun başı kesildikten sonra, göğüs bölgesini Betadine emdirilmiş gazlı bezle silin. Kürek kemiklerini birbirine doğru sıkıştırarak yavruyu sabitleyin. Kalbi açığa çıkarmak için kısmi torakotomi gerçekleştirin; kürek kemiklerine uygulanan basıncı artırmak, kalbin kaburgaların ötesine geçmesini sağlayacaktır.Skapular diseksiyon için, büyük damarları kesmek ve organı çıkarmak amacıyla kalp arkasında bisturi bıçağını gezdirin. Kalbi, PBS glukoz içeren bir Petri kabında buz üzerine yerleştirin. Kalpler izole edildikten sonra, buz soğukluğundaki PBS glukoz ile durulayarak tüm kalıntı kanı ve bağ dokusunu temizleyin.Her bir kalbin üst üçte birlik kısmını çıkararak alt üçte iki kısmının kalmasını sağlayın. Sadece ventriküler dokunun büyük kısmını izole etmek için dokuyu, buz gibi soğuk PBS glikoz içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin. Steril mikro makas ve pens kullanarak, kalpleri dikkatlice yaklaşık bir kübik milimetrelik parçalar halinde doğrayın.Dokuyu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tamponun 10 mililitresi hariç tamamını uzaklaştırın. Yedi mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin. Kollajenaz-doku karışımını 37 degrees Celsius sıcaklıkta yedi dakika boyunca çalkalayın.Doku parçalarını dağıtmak için nazikçe 10 kez pipetleyin. Parçaların çökmesini bekleyin, ardından sıvıyı aspire edip atın. Doku parçalarına yedi mililitre kollajenaz ekleyin ve yedi dakika boyunca tekrar sindirin.Kalan her adım için, doku parçalarını parçalamak amacıyla nazikçe 10 kez pipetleme yapın. Parçalar çöktükten sonra, süpernatantı çekip ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpe toplayın. Doku parçalarına yedi mililitre kollajenaz ekleyin ve yedi dakika boyunca tekrar sindirin. Her bir süpernatant tüpüne, sindirimden elde edilen süpernatantın her eklemesinden sonra farklı bir serolojik pipet kullanarak 10 mililitre durdurma çözeltisi ekleyin.Fibrin jel yapıların dökümüne hazırlanmak için lütfen protokolün yazılı bölümüne bakınız. Önceden hazırlanmış mandrelleri, O-ringler ile Teflon pullar arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için üç cc'lik şırıngayı piston olarak kullanarak altı cc'lik şırınga gövdelerine yerleştirin. Bir mililitre fibrin jel hazırlamak için, konik tüp içerisinde 558 µL 20 mM HEPES'e 112 µL fibrinojen stoğu ekleyerek F solüsyonunu oluşturun.Ayrı bir konik tüpte %0,9'luk salyen çözeltisi içinde tampon hazırlayın. 135 µL DMEM'e 17 µL trombin stoğu ve 1,3 µL iki normal kalsiyum çözeltisi ekleyerek T çözeltisi oluşturun. Üçüncü bir konik tüpte hücreleri çöktürün ve mililitre başına 29,4 milyon hücre veya konstrükttyeki istenen nihai hücre konsantrasyonunun altı katı olacak şekilde yeniden süspanse edin.Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler konstrükt fabrikasyon aşamasında zorluk yaşayacaklardır. Fibrinojen ve trombin çözeltileri birbirine karıştırıldıktan sonra, fibrinin polimerizasyonu hızla gerçekleşir. Bu nedenle, kalıba enjekte ederken hidrojelin içine hava kabarcıklarının girmesini önleyerek homojen bir çözelti elde etmek için hızlı çalışılmalıdır.Fibrin jel konstrüktünü dökme aşamasına gelindiğinde, 18 gauge 1,5 inçlik bir iğne ile bir mililitrelik şırıngayı hazırlayın. Ayrıca 21 gauge 1 inçlik bir iğneyi de hazır bulundurun. Bir mililitre fibrin jel solüsyonu hazırlamak için, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 667 µL F solüsyonu ve ardından 167 µL hücre solüsyonu ekleyin.Ve son olarak, 167 µL T çözeltisi. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek karışımı dikkatlice pipetleyin. Bu noktada reaksiyon başlamıştır ve konstrüktin enjeksiyonu derhal gerçekleştirilmelidir.Şırıngayı ve 18 gauge iğneyi kullanarak fibrin solüsyonunu çekin. İğneye hava kabarcıklarının girmesini önlemek için şırıngayı ters çevirmemeye dikkat edin. 18 gauge iğneyi 21 gauge bir iğne ile değiştirin.Hava kabarcıklarını dışarı atmak için şırıngaya hafifçe vurun. Ardından, şırıngayı Teflon O-ring'deki kanalı takip ederek tıpayla çevrelenen kalıba yerleştirin ve çözeltiyi kalıba enjekte edin. Tam dolumu sağlamak için kalıbı eğik tutun.Ardından kalan kalıpları doldurun. Kalıpları üçerli gruplar halinde parafilm ile sarın ve 37 °C'deki inkübatöre veya fırına yerleştirin. Fibrinin tamamen polimerize olması için jelleri 20 dakika boyunca inkübe edin.Her bir kültür kavanozunu, konstrükt başına 21 mililitre miyokardiyal konstrükt besiyeri ile doldurun. Konstrüktün bulunduğu mandreli DMEM içeren büyük bir Petri kabına itmek için steril üç cc şırınga gövdesini piston olarak kullanın. Ardından konstrüktü örnek kavanozuna yerleştirin.Kavanozları iki hafta boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bir fibrin konstrükt klembin analizine başlamak için, stimülatörden gelen iletken üzerindeki timsah klipleri banyodaki elektrot tellerine takın. Veri toplama kartını, darbe üretecini ve kuvvet transdüserini çalıştırın.Kuvvet dönüştürücüyü 5G ayarına getirin ve sıfırlayın. Kuvvet dönüştürücüden gelen verileri görüntüleyen ve kaydeden özel bir lab view programı açın. Veri klasöründe her örnek için yeni ve boş bir metin dosyası oluşturun; cımbız kullanarak, konstrüksiyon halkasını Teflon destekten nazikçe kaydırarak ve kuvvet ölçüm sistemindeki sabit metal direğin üzerine yerleştirerek konstrüksiyonu mandrel desteğinden çıkarın.Besiyeri banyosu. Kuvvet transduseri direği etrafındaki konstrüktü itmek ve kaldırmak için cımbız kullanın. Konstrüktün diğer ucunu transduser kolunun üzerine yerleştirin ve transduser değer okuyana kadar sıkın.Kardiyak stimülatör üzerinden 1,0 G kuvveti uygulayın. Puls voltajını 20 volt, süreyi altı milisaniye ve hızı bir hertz olarak ayarlayın. Çıkış açma-kapama düğmesine basarak elektriksel pacing işlemini başlatın.Dalga formu düzenli hale gelene kadar kayıt almaya başlayın. Kasılma kuvvet hızını ve gevşeme hızını belirlemek için dalga formunu MATLAB'de analiz edin. Kardiyomiyosit fibrin konstrüktü başlangıçta kalıbın tüm genişliğini kaplar.İki haftalık kültürleme süresinin ardından, yapı başlangıç genişliğinin yaklaşık beşte birine kadar daralır. Yapının elektriksel stimülasyonu, burada gösterildiği gibi seğirme kuvveti verilerini oluşturur. Yaklaşık 1,3 millinewton düzeyinde seğirme kuvvetleri beklenir.Oksijenin konstrükte difüzyon kısıtlamaları nedeniyle, hücrelerin canlılığı, hücrelerin kültür ortamıyla temas halindeki konstrükt yüzeyine olan uzaklığına bağlıdır. Konstrükt yüzeyinde, konfokal mikroskopi kullanılarak yüksek hücre canlılığı gözlemlenmiştir. Konstrüktün hizalanmış yapısı, miyozin ağır zincirinin kırmızıya, miyositler arasındaki hücre eşleşmesi için gerekli olan Connexion 43'ün ise yeşile boyanmasıyla gözlemlenmiştir.Yöntem tam olarak öğrenildiğinde, tüm protokol yaklaşık beş saat sürecektir. İzolasyon kısmı yaklaşık üç saat, konstrükt üretimi kısmı ise yaklaşık iki saat sürecektir. Bu prosedür uygulanırken, fibrin ağına hava kabarcıkları girmesini önlemek için iğnenin her zaman aşağıya doğru tutulması önemlidir.Ayrıca, kalıbın eğilmesi, enjeksiyon sırasında iğne deliğinin her zaman en yüksek noktada kalmasını sağlayacak ve böylece kalıp dökümünün fibrin çözeltisi ile tamamen doldurulmasını garanti edecektir. Bu videoyu izledikten sonra, önce neonatal sıçanlardan kardiyomiyositleri izole ederek ve ardından fibrin çözeltisini kolayca monte edilen silindirik kalıplara enjeksiyonla dökerek, kardiyomiyositlerin halka şeklinde fibrin hidrojellerine nasıl kapsülleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.

encapsulation-cardiomyocytes-fibrin-hydrogel-for-cardiac-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Enjektabl bir matris jel decellularized doku hazırlanması ve sıçan miyokardın içine enjekte...

Miyokard Doku Mühendisliği Biyolojik Türetilmiş Enjektabl Malzeme imalatı

Bu protokol çevreleyen hücre dışı matriks gelen ipucu almak ve birden fenotipleri farklılaşması için indüklenebilir kök hücrelerin doğal yeteneği kullanılmasına odaklanmıştır. Bu yöntemler yazının aynı anda yağ kaynaklı kök hücreleri birlikte ayırt etmek için, PEG-fibrin ve kollajen oluşan iki katmanlı hidrojel kullanan bir model, bizim ve nitelendirilmesi...

ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Bir kemirgen modelinde, LAD ligasyonu ile uyarılmış miyokardiyal enfarktüsü tedavi etmeye yönelik bir biograft implantasyonu, geleneksel olarak iki açık kalp ameliyatı gerektirmiştir. Ölümlerini azaltmak ve hücreleri ile ilişkili solid ve jelatinli biyolojik matrisler tespiti için en uygun koşulları sağlamak amacıyla, minimal invaziv prosedürler geliştirilmiştir.

Rat Kalp Yetmezliği Hücre Terapisi: Miyokard İnfarktüsü için çift Torakotomi ve Hücreleri ile BioMatrix arasında Epikardiyal implantasyonu

Bu protokol, miyokard enfarktüslerinin kök hücre tedavisi için bir hidrojel sistemi ve fibrin bazlı bir yapıştırıcı kullanılarak zayıf hücre aşılamasının sınırlamasını hafifletmeyi amaçlamaktadır. Bu yaklaşımla, enfarktüs sonrası hücreden dokuya temas korunabilir ve bu da yaralanma bölgesindeki faydalı ajanların terapötik potansiyelini artırır.

Bir Hidrojel Construct ve Fare Miyokard Enfarktüsü Modeli Therapeutics sunun için Tutkal Yaklaşım Fibrin tabanlı.

Bu iletişim kuralı tam decellularization insan Miyokardiyum, hücre dışı matriks bileşenlerinin koruma sırasında açıklar. Microparticles ve cytoprotective kendi kendine montaj hidrojel üretiminde hücre dışı matriks sonuçlarının daha fazla alay.

İnsan kalp dokusu hücre dışı matriks hidrojel Vitro ve In Vivo uygulamaları için kendi kendine montaj doğru işlenmesi

Burada biz hidrojel tabanlı karmaşık geometriler mühendislik kurcalayarak üretmek için kullanılan özel polydimethylsiloxane kalıpları imalatı için hızlı, facile ve düşük maliyetli bir yöntem mevcut. Ayrıca bu tekniği kullanılarak üretilen mühendislik kalp dokuları üzerinde yürütülen mekanik ve histolojik değerlendirme sonuçları açıklanmıştır.

Özel doku kültürü kalıpları lazer kazınmış ustalardan mühendislik

Kök hücre bazlı tedavi, miyokard enfarktüsünden sonra yaralı kalp dokularını onarmak için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Enzmatik olarak çapraz bağlanabilen jelatin hidrojelleri kullanarak kök hücre nakli için en uygun in vivo uygulamayı sağlıyoruz.

Murine Modelinde Miyokard İnfarktüsünden Sonra MSC Yüklemeli Enjekte Edilebilir Hidrojellerin intramiyokardiyal Transplantasyonu

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF' ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

Eriyik elektrospinning yazma (MEW), polikaprolakton (PCL) iskeleleri ve fibrin hidrojelleri hiPSC türevi kardiyomiyositler ve fibroblastlarla birleştiren 3D miyokardiyal dokular oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Bu teknik, iskele mimarisi üzerinde hassas kontrol sağlar ve klinik öncesi ilaç testlerinde ve kalp hastalığı modellemesinde uygulanabilir.

Polikaprolakton İskelelerinin ve hiPSC'den Türetilmiş Kardiyak Hücrelerin Eriyik Elektrospinning Yazımı Kullanılarak 3D İnsan Miyokard Dokusu Üretimi

Öğrenin, yeni doğan sıçan kardiyomiyositlerini fibrin hidrojel içinde kapsülleyerek kalp doku mühendisliği uygulamaları geliştirmeyi. Bu yöntem, miyokard infarktüsü tedavileri için değerli bir model sunar.

Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Daha fazla video keşfet