Kalp Doku Mühendisliği Fibrin Hidrojel kardiyomiyositlerinin Kapsülleme

Bu prosedürün genel amacı, yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerini kardiyak doku mühendisliği için bir FI hidrojel içinde kapsüllemektir. Bu, ilk önce iki ila üç günlük yenidoğan sıçan yavrularının kalplerini izole ederek gerçekleştirilir. Daha sonra, kalpler kollajenaz içinde sindirilir.

Kardiyak hücreleri hücre dışı matristen ayırmak için, kardiyak hücreler daha sonra bir fibrin hidrojel içinde kapsüllenir. Son olarak, yapılar iki hafta boyunca kültürlenir. Sonuç olarak, sonuçlar, yapıların elektriksel stimülasyona yanıt olarak yaklaşık 1.3 mili Newton'luk bir seğirme kuvveti üretme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.

Ayrıca, yapının hizalanmış yapısı, miyosit proteinlerinden histolojik boyama yoluyla gözlemlenebilir. Tasarlanmış miyokardiyal yapılar, yaralı dokunun tasarlanmış doku ile onarılmasına veya değiştirilmesine izin vererek, böylece yaralanma veya hastalığı takiben kardiyak fonksiyonu iyileştirerek miyokard enfarktüsü için potansiyel bir tedavi görevi görebilir. Bu yapılar, çeşitli uyaranların kasılma kuvvetleri ve normal ve patofizyolojik kardiyak gelişim üzerindeki etkilerini incelemek için değerli bir in vitro model sistemi olarak hizmet edebilir.

Her kişi için orta ve sterilize edici cerrahi aletler hazırladıktan sonra, kapüşonun, çalışma yüzeyinin üzerine emici bir tezgah alt pedi yerleştirin ve steril bir örtü ile örtün. Steril cerrahi aletleri ve dörde dört gazlı bezi steril örtünün üzerine yerleştirin. Aletlere dokunmadan steril bir 20 numara neşter bıçağı açın ve örtünün üzerine yerleştirin.

Bir yavrunun başını kestikten sonra, göğsü Betadine ıslatılmış gazlı bezle temizleyin. Kürek kemiklerini birbirine sıkıştırarak yavruyu sabitleyin. Kalbi açığa çıkarmak için kısmi bir torakotomi yapın, kürek kemiklerine uygulanan basıncı artırın, bu da kalbi kaburgaları geçmeye zorlar.

Skapular diseksiyon için, büyük damarları kesmek ve organı çıkarmak için neşter bıçağını kalbin arkasına geçirin. Kalbi, PBS glikozu içeren bir Petri kabına buzun üzerine yerleştirin. Kalpler izole edildikten sonra, kalan kan ve bağ dokusunu buz gibi soğuk PBS glikozunda durulayarak çıkarın.

Her kalbin üst üçte birini çıkarın, böylece alttaki üçte ikisi kalır. Sadece ventriküler dokunun çoğunu izole etmek ve dokuyu buz gibi soğuk PBS glikozu ile taze bir Petri kabına yerleştirmek için. Steril mikro makas ve forseps kullanarak, kalpleri dikkatlice kabaca bir milimetreküp parçalar halinde doğrayın.

Dokuyu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tamponun 10 mililitresi hariç hepsini çıkarın. Yedi mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin. Kollajenaz doku karışımını 37 santigrat derecede yedi dakika çalkalayın.

Doku parçalarını parçalamak için 10 kez hafifçe pipetleyin. Parçaların çökelmesine izin verin ve ardından sıvıyı aspire edin ve atın. Doku parçalarına yedi mililitre kollajenaz ekleyin ve yedi dakika boyunca tekrar sindirin.

Kalan her adım için, doku parçalarını ayırmak için 10 kez hafifçe pipetleyin. Yerleştikten sonra, süpernatanı çekin ve toplayın 50 mililitrelik ayrı bir konik tüpte, doku parçalarına yedi mililitre kollajenaz ekleyin ve yedi dakika boyunca tekrar sindirin. Her bir süpernatan tüpüne, sindirimden her süpernatan ilavesinden sonra farklı bir serolojik pipet ile 10 mililitre durdurma çözeltisi ekleyin.

Fibrin jel yapılarının dökümüne hazırlanmak için lütfen protokolün yazılı kısmına bakın. Önceden yapılmış mandrelleri altı cc'lik şırınga muhafazasına yerleştirin O-ringler ve Teflon rondelalar arasında sıkı bir sızdırmazlık elde etmek için üç cc'lik şırıngayı bir piston olarak kullanın. Bir mililitre fibrin jeli yapmak için, 558 mikrolitre 20 milimolar yığına 112 mikrolitre fibrinojen stoğu ekleyerek konik bir tüpte F çözeltisi oluşturun.

Ayrı bir konik tüpte% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde tamponlayın. 135 mikrolitre DMEM'e 17 mikrolitre trombin stoğu ve 1.3 mikrolitre iki normal kalsiyum çözeltisi ekleyerek bir T çözeltisi oluşturun. Üçüncü bir konik tüpte, hücreleri döndürün ve mililitre başına 29.4 milyon hücre konsantrasyonuna veya yapıdaki istenen nihai hücre konsantrasyonunun altı katı konsantrasyona yeniden süspanse edin.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, yapı imalat adımında zorlanacaktır. Fibrinojen ve trombin çözeltilerini birlikte karıştırdıktan sonra, fibrinin polimerizasyonu hızlı bir şekilde gerçekleşir. Bu nedenle, bireyler, kalıp dökümüne enjeksiyon üzerine hava kabarcıklarının hidrojele dahil olmasını önlerken homojen bir çözelti sağlamak için hızlı bir şekilde çalışmalıdır.

Fibrin jel yapısını dökmeye hazır olduğunuzda, 18 gauge bir buçuk inçlik bir iğne ile bir mililitrelik bir şırınga hazırlayın. 21 gauge bir inçlik bir iğneyi de hazır bulundurun. Bir mililitre fibrin jel çözeltisi yapmak için, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 667 mikrolitre F çözeltisi ekleyin, ardından 167 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin.

Ve son olarak, 167 mikrolitre T çözeltisi. Hava kabarcıkları oluşmaması için karışımı dikkatlice pipetleyin. Bu noktada reaksiyon başlamıştır ve yapının enjeksiyonu hemen yapılmalıdır.

Şırınga ve 18 gauge iğneyi kullanın ve fibrin çözeltisini hazırlayın. Kabarcıkların iğneye girmesini önlemek için şırıngayı ters çevirmemeye dikkat edin. 18 gauge iğneyi 21 gauge iğne ile değiştirin.

Hava kabarcıklarını zorlamak için şırıngaya hafifçe vurun. Daha sonra, şırıngayı Teflon O-ringdeki oluğu takip eden durdurucu kılıf arasındaki kalıba yerleştirin ve çözeltiyi kalıba enjekte edin. Tam doldurmayı sağlamak için kalıbı eğin.

Sonra kalan kalıpları doldurun. Kalıpları üçlü gruplar halinde para filme sarın ve 37 santigrat derecede inkübatöre veya fırına yerleştirin. Fibrinin tamamen polimerize olması için yeterli zaman tanımak için jelleri 20 dakika inkübe edin.

Her kültür kavanozunu yapı başına 21 mililitre miyokard yapı ortamı ile doldurun. Steril üç cc'lik şırınga muhafazasını, yapıdaki mandreli DMEM ile büyük bir Petri kabına zorlamak için bir piston olarak kullanın. Ardından yapıyı numune kavanozuna yerleştirin.

Kavanozları iki hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir fibrin yapı kelepçesinin analizine başlamak için, timsah, stimülatörlerden banyodaki elektrotlar üzerindeki tellere gelen kurşun üzerine klipslenir. Veri toplama kartına, darbe üretecine ve kuvvet dönüştürücüsüne güç verin.

Kuvvet dönüştürücüyü 5G ayarına getirin ve sıfırlayın. Kuvvet dönüştürücüsünden gelen verileri görüntüleyen ve kaydeden özel bir laboratuvar görünümü programı açın. Cımbız kullanarak her örnek için veri klasöründe yeni bir boş metin dosyası oluşturun, yapı halkasını Teflon destekten nazikçe kaydırarak ve kuvvet ölçüm sistemindeki sabit metal direğin üzerine yerleştirerek yapıyı mandl desteğinden çıkarın.

Orta banyo. Kuvvet dönüştürücü direğinin etrafındaki yapıyı itmek ve kaldırmak için cımbızı kullanın. Yapının diğer ucunu dönüştürücü kolunun üzerine yerleştirin ve dönüştürücü okuyana kadar sıkın.

Kardiyak stimülatör üzerinde 1.0 G kuvvet. Darbe voltajını 20 volta, süreyi altı milisaniyeye ve hızı bir hertz'e ayarlayın. Çıkış açma kapama düğmesine basarak elektrik hızını başlatın.

Dalga formu düzenli hale gelene kadar kayda başlayın. Kasılma kuvvet oranını ve gevşeme oranını belirlemek için MATLAB'daki dalga biçimini analiz edin. Kardiyomiyosit fibrin yapısı başlangıçta kalıbın tüm genişliğini kaplar.

İki haftalık kültürden sonra, başlangıç genişliğinin yaklaşık beşte birine kadar daralır. Yapının elektriksel hızı, burada gösterildiği gibi seğirme kuvveti verileri üretir. Yaklaşık 1.3 milinewtonluk Twitch kuvvetleri bekleniyor.

Yapının hücre canlılığı, oksijenin yapıya difüzyon sınırlamaları nedeniyle hücrelerin kültür ortamı ile temas halinde olan yapının yüzeyinden ne kadar uzakta olduğuna bağlıdır. Yapının yüzeyinde, konfokal mikroskopi kullanılarak yüksek hücre canlılığı gözlemlendi. Yapının hizalanmış yapısı, miyositler arasındaki hücre eşleşmesi için gerekli olan kırmızı Connexion 43 renginde miyozin ağır zinciri için boyama ile gözlenir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm protokol yaklaşık beş saat sürmelidir. I izolasyon kısmı yaklaşık üç saat sürecektir. Yapı imalat kısmı yaklaşık iki saat sürecek olsa da, bu prosedürü denerken, hava kabarcıklarının fibrin ağına girmesini önlemek için iğneyi her zaman aşağı doğru tutmak önemlidir.

Ayrıca, kalıbın eğilmesi, enjeksiyon sırasında iğne deliğini her zaman en yüksek noktada tutacak ve bu da kalıp dökümünün fibrin çözeltisi ile tamamen doldurulmasını sağlayacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, önce kardiyomiyositleri yenidoğan sıçanlarından izole ederek ve ardından fibrin solüsyonunu kolayca monte edilen silindirik kalıplara enjeksiyonla kalıplayarak kardiyomiyositleri halka şeklindeki fibrin hidrojellere nasıl kapsülleyeceğinizi iyi anlamalısınız.