Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, bölümlere ayıran bir mikroakışkan cihaz aracılığıyla kanser hücresi göçünü görsel olarak incelemek ve karakterize etmektir. Bu, serum içermeyen ortamda büyütülen beyin tümörü kök hücrelerinin önceden var olan nörosferlerinin ilk ayrışmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, iki katmanlı bir SU sekiz master imal etmek ve bölümlere ayıran bir tasarıma sahip yumuşak litografi kalıbı A-P-D-M-S damgası kullanmaktır.

Daha sonra, mikroakışkan cihazı birleştirin ve beyin tümörü kök hücreleri ile yükleyin. Son olarak, beyin tümörü kök hücre göçünün uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi, hepsi bir arada mikroskobik bir sistem kullanılarak gerçekleştirilir. Sonuç olarak, sonuçlar, beyin tümörü kök hücrelerinin, ultra kapalı uzayda göçleri sırasında dönen bir morfolojik aşama dizisi sergilediğini göstermektedir.

Bu tekniğin Transwell Boyton Odası gibi mevcut kitlelere göre en büyük avantajı, mikro cihazın migrasyon sürecinin görsel olarak incelenmesine, hücrelerin kontrollü yerleştirilmesine ve faktörlerin kesin olarak verilmesine izin vermesidir. Bu nedenle, mikro forik teknoloji, güvenilir, verimli ve uygun maliyetli tek hücre seçimi ve navigasyon özelliklerine sahiptir. Bu tekniğin etkileri, kanser metastazı ve nüksü tedavisine kadar uzanır, çünkü yüksek oranda göç eden hücrelerin tek hücre analizi, gelecekteki potansiyel kemoterapötik hedefleri belirleyebilir.

Bu yöntem kanser sisteminin göç davranışı hakkında fikir verebilirken, embriyonik gelişim, immün yanıtlar, yara iyileşmesi ve organ rejenerasyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. BTSC türevi nöros mızraklarının hücre süspansiyonu ile başlar. Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 900 RPM'de santrifüjleyin, ancak daha hızlı değil.

Süper natini aspire edin. Daha sonra, nörokürelerin 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 0,5 mililitre ön sıcak Accutane içinde inkübe ederek gevşemesine izin verin. İnkübasyondan sonra, bir P 100 pipetinin 10 ila 20 yumuşak vuruşuyla hücreleri mekanik olarak parçalayın.

Daha sonra, Accutane santrifüjünü, 1300 RPM'de beş dakika boyunca hücre süspansiyonunu nötralize etmek için 1.5 mililitre kök hücre ortamı ekleyin ve hücreleri bir mililitre kök hücre ortamında yeniden süspanse edin. Hücre yoğunluğunu bir hemo sitometre ile kontrol edin ve yoğunluğu mikrolitre başına 20.000 hücreye ayarlayın. SU sekiz master'ın imalatına başlamak için, Adobe Illustrator kullanarak iki fotoğraf maskesi ve Image Setter dahil lazer baskı şeffaf filmi hazırlayın.

İlk katman fotoğraf maskesi, iki referans işaretleyici ve bir dizi mikro kanaldan oluşur ve ikinci katman fotoğraf maskesi, oturma ve alma odalarına sahiptir. Her iki maske katmanını da izopropanol ile temizleyin ve kurumaya bırakın. Şimdi üç mikron kalınlığında SU sekiz foto dirençli saplı bir gofret döndürün, ardından yumuşak pişirme yapın.

Daha sonra ilk katman fotoğraf maskesi ile yakın temas uv ile fotoğrafı ortaya çıkarın, direnin ve kürlenmesine izin verin. Daha sonra pişirin ve kürlenmiş gofreti geliştirin. Saplı gofretin referans işaretleyici alanlarını bantla kapatın.

Daha sonra gofreti 250 mikron kalınlığında foto direnç ile kaplayın. Daha sonra, hizalama amacıyla işaretçileri ortaya çıkarmak için bandı soyun. İkinci fotoğraf direnci katmanını yerleştirin ve referans işaretleyicilerini hizalayın.

Daha sonra ikinci katman fotoğraf maskesini UV'ye maruz bırakın ve sertleştirin, ardından pişirme ve geliştirme sonrası. Şimdi yüzey yapışkanlığını azaltmak için SU sekiz master'ı buhar biriktirme yoluyla kullanın. Gofretleri en az bir saat vakum altında birkaç damla Tri Chloro cline solüsyonu içeren bir kurumaya koyun.

Master daha sonra master ile PDMS'yi kalıplamak için kullanıma hazır olacaktır. Ön polimer bazını 10'a bir oranında kür ile iyice karıştırarak başlayın. Ardından, karışımı hava kabarcığı görünmeyene kadar vakumla gaz giderme için bir kurutucuya koyun.

Karışımı maskenin üzerine dökün ve tekrar gazdan arındırın. Yeni hava kabarcıkları eklenirse, kalıbı 90 santigrat derecede iki saat boyunca düz bir sıcak plaka üzerinde sertleştirin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra PDMS damgasını yavaşça serbest bırakın.

Böylece kültür kanalları PDMS'ye kazınır ve mikroakışkan cihazın montajına hazır hale gelir. Master, çatlayana veya aşınana kadar kalıplama için tekrar kullanılabilir. Master yapışkan hale geldiğinde, yapışma önleyici kaplama yeniden uygulanabilir.

PDMS damgası aracılığıyla mikroakışkan cihazda giriş ve çıkışlar yaparak başlayın. Bir biyopsi deliği delinmesi kullanarak, PDMS damgasını 30 dakika boyunca %70 etanole batırarak ve ardından 10 dakika deiyonize su ile durulayarak temizleyin. Otoklavlama yoluyla PDMS damgasının çapraz bağ reaksiyonlarını sterilize edin ve tamamlayın.

Şimdi PDMS damgasını poli L lizin ile kaplanmış bir cam kapak astarı üzerine yerleştirin. Cihaz daha sonra hazneleri rezervuar girişlerinden laminat çözeltisi ile doldurarak laminat ile kaplanır ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir. Ertesi gün, laminatı cihazdan aspire edin.

Daha sonra cihazı iki kez kök hücre ortamı ile doldurarak yıkayın. Şimdi tohumlama rezervuarlarından birine 11 mikrolitre ayrışmış hücre yükleyin Gerekirse, hücreleri odaya zorlamak için vakum aspirasyonu kullanın. Ardından, bitişik oturma rezervuarına yedi mikrolitre daha hücre yükleyin.

Beş dakika sonra, oturma ve alma rezervuarları medya ile sular altında kalacaktır. Şimdi cihaza 0,5 ila bir milimetre kalınlığında steril bir PDMS sayfası yerleştirin. PDMS'nin kendisiyle doğal yüzey yapışması, cihazı mühürledikten sonra sızdırmaz hale getirecektir, nakliye, inkübasyon ve mikroskobik görüntüleme için hazırdır.

Biot, IM'yi 45 dakika boyunca çalıştırarak önceden dengeleyin. Sıcaklığını, nemini ve hava beslemesini stabilize etmek için, uygun nemi elde etmek için numune odasına birkaç tabak su ekleyin. Hazırlanan cihazı mikroskobun numune haznesine yükleyin.

Mikro cımbız kullanarak cihazı ortalayın. Şimdi Biot yazılımını kullanarak odak konumu noktalarını ve zaman noktalarını ayarlayın ve gerekirse hızlandırılmış kayıtları başlatın. Kültürde beş gün geçirdikten sonra, kültür ortamını değiştirin.

Cihazda tohumlanan BTC'ler, faz görüntüsü ile sürekli olarak kaydedildi. Oturma odasında beş gün boyunca, iğ şeklindeki hücreler göç öncesi aşamada kaldı. Mikrokanal girişine yaklaştıklarında, birkaç hücre genişledi ve yapışkan çıkıntılar oluşturdu.

Sadece bir hücre girişi işgal edebildi ve göç yönünü keşfedebildi. Hücre göç yönünü belirledikten sonra, tüm mikrokanal boyunca sabit yüksek hızda gezinmeye devam etti. Mikrokanalın sonunda, hücre, nihayet içine girmeden önce alıcı odanın açık alanını keşfetmeye devam etti.

Hücreleri iki saniyelik görüntüleme aralıklarıyla gözlemleyerek, göç etme gücünün, çoğunlukla bir OID hücresininkine benzer bir blabbing aktivitesi tarafından üretildiği ortaya çıktı. Prosedürü denerken, cihazın tasarımının o kadar esnek olduğunu hatırlamak önemlidir ki, istenen hücre göçü derecesini elde etmek için mikrokanal boyutları manipüle edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz hücreleri kültürlemek için uygun, benzersiz bir bölümlere ayıran mikroakışkan cihazın nasıl oluşturulacağını iyi anlamalı ve ardından bu hücrelerin göç özelliklerini kalitatif ve kantitatif olarak tanımlamak için uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirmelisiniz.

Yüksek oranda göç eden kanser hücrelerinin genetik olarak ne kadar farklı olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için yeni nesil dizileme veya DNA mikrodizisi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.