Name: Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Öğrenin mikroakışkan cihazlar ve canlı hücre görüntüleme kullanarak kanser kök hücre göçünü değerlendirmeyi. Bu yöntem beyin tümörü kök hücrelerinin metastaz mekanizmalarını anlamak için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PAC kısmen Wisconsin Kök Hücre Eğitim Programı (PA Clark) University of bir NIH T32 hibesi ile desteklenmektedir. JSK kısmen HEADRUSH Beyin Tümörü Araştırma Profesörlük, Roger Loff Memorial GBM Araştırma Fonu ve UW Vakfı / Nöroşirurji Beyin Tümörü Eğitim ve Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. JCW ve YH kısmen NIH hibe NIBIB 1R01EB009103-01 tarafından desteklenmektedir.

1. BTSC cep disosiasyon BTSCs neurospheres gibi serum serbest kök hücre aracı maddesi içinde büyütülmüştür önceden mevcut olan kültürler elde edilmiştir. kültürü önceden 10, 11 tarif edilmiştir. <ol><li> BTSC türevi neurospheres hücre süspansiyonu hazırlayın. BTSC türevi neurospheres bir 15 ml'lik konik bir tüp içinde toplanmış ve 5 dakika için 900 rpm'de santrifüjlenir. Daha hızlı santrifüj kesme ve / veya hasar neurospheres yapabilirsiniz. Süpernatan havalandırılır ve neurosphere kültür önceden ısıtılmış Accutase 0.5 ml içinde tekrar süspanse edilir. Bu çözüm, 37, 5-10 dakika için inkübe edilir ° C neurospheres gevşetmek için izin verir. Hücreler 10-20 mekanik olarak hafif bir P100 pipet vuruş ve daha sonra kök hücre orta 1.5 ml Accutase nötralize etmek için hücrelere ilave edilir ile bozulur. </li><li> BTSCs daha sonra 5 dakika için 1300 rpm'de santrifüjlenmiştir, ve kök hücre orta 1 ml içinde tekrar süspanse edilir. </li><li> Bir 50 ul alikot süspansiyon kaldırılıriyon ve hücre sayımı için bir mikrosantrifüj tüp içine yerleştirilir. Tripan mavi 50 ul Eppendorf tüpüne eklenir ve süspansiyon hücre sayımı bir hemasitometre yerleştirilir. </li><li> Hücre sayımı sonra gerekirse, ek bir kök hücre orta 20.000 canlı hücre / ul medya bir hücre yoğunluğu vermek için BTSC süspansiyonuna ilave edilir. </li></ol> 2. Iki katlı su-8 master ve PDMS damga kalıp İmalatı (bkz. Şekil 1) Biz mikroakışkan cihazların montajı için gerekli olan su-8 master ve PDMS damga, imal optik litografi ve yumuşak litografi kullanın. Standart prosedür 12 'dan biraz farklı, bizim su-8 ana iki katmandan oluşur. 250 mikron boyunda tohum ve alma odaları, ikinci / üst tabakası ise 3-mikron boyunda mikrokanallar, önceki süreçte alt / ilk tabakadaki dökülür. İki kültür bölmeleri (mikrokanal arasındaki doğru bağlantı için içins ve odaları gibi), iki kat birbirine doğru konumda hizalanmış olması gerekir. Bununla birlikte, ikinci tabakanın kalınlığı ve donukluk özelliklerini alt erişmesini optik / indirgeme ortalayıcı engellemek için yeterince büyüktür. Burada konvansiyonel işaretleri uzaktan konumlandırılırken ile maskeler tasarlayabilirsiniz. Ikinci katman eğirme iken Böylece, birinci tabaka, bu belirteçler seçici olarak korunmuş olabilir. Bunun sonucu olarak, özellikleri ve her ikisi de tek bir ana tabaka halinde yapılır ve daha sonra PDMS damga kabartma halinde kalıplanması için hazırdır. <ol><li> Tasarım ve iki fotoğraf maskeler hazırlamak. Bir maske iki konvansiyonel işaretleri ve ilk kat için mikrokanallardaki bir dizi (400 mikron uzun ve 10-50 mikron geniş) oluşmaktadır. Başka mask ikinci kat için kabinler (2 mm uzunluğunda ve 600 mikron genişliğinde) tohum ve alıcı oluşur. Hem maskeleri Illustrator (Adobe, California) tasarlanmış, izopropanol ve hava-kuru temizlenebilir şeffaflık filmler (İnce Metal Parçaları, Colorado), üzerine lazer baskılı. </li><li> Birinci katman ile edinsu-8 fotorezist (MICROCHEM, Massachusetts) tedarikçiden ürün kılavuzuna göre. İlk olarak, spin-kat su-8 (5), 3-mikron kalınlığında fotorezist ile sap gofret (WRS malzemeler, California) yumuşak kabartma izledi. Fotorezist ultraviyole maruz kalan ve post-pişirme ve gelişmekte ardından yakın temas karşılık gelen maske ile kür sonra olduğunu. </li><li> Su-8 (2100) kalın 250 mikron ile Spin-kat, ikinci kat. Birinci tabaka ikinci indirgeme işaretleri bloke kalın fotorezist önlemek için amacıyla, ikinci katman bölgesinin yan kaplama öncesi içinde séloteyip bu bölgeleri kapsar. Kaset daha sonra hizalama amacıyla işaretleri soyulmuş edilir. </li><li> UV maruz ikinci maske ile ikinci kat. Hizalama işaretleri ortaya sayesinde, optik maske hizalama kullanarak ikinci maskesi olanlar onları hizalamak için basittir. Fotorezist ve ikinci kat ultraviyole maruz kalan ve yakın temas içinde tedavi sonrası pişirme ve gelişmekte izledi o zaman. &lt;/ Li&gt; </li><li> Anti-stick kaplama sonuçlandı ustası. Tedavi PDMS giderilmesine yardımcı olmak için, su-8 ana yüzey, bir yapışmaz-tipi kaplama yapmak için buhar çöktürme yolu ile Silanlanmış edilebilir. Bunun için birkaç damla trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) vakum altında silan çözeltisi ile, en az bir saat için bir desikatöre içine yerleştirin. </li><li> Master ile PDMS Kalıp. Prepolimerin baz ve iyice 10:1 oranını içinde PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) ve curer karıştırılır. Hiçbir hava kabarcığı görülür kadar vakumlu gaz giderme için bir desikatörde yerleştirin. Yeni hava kabarcığı geçilirse tekrar maske ve degas üzerine karışımı dökün. Oda sıcaklığına kadar soğuduktan sonra 90 C'de 2 saat boyunca düz bir ocak üzerinde kalıp Cure, yavaşça PDMS damga bırakın. Böylece, kültür kanalları PDMS kazınmış ve cihaz montajı için hazırdır. O kırık veya aşınmış kadar ana kalıplama için tekrar kullanılabilir. Yapışmayı önleyici kaplama yapışkanlık kavuşur tekrar yapılması gerekmektedir. </li></ol> 3.Mikroakışkan cihazları ve hücre kültürü Meclisi (Şekil 2) Kültür hücreleri için, özelliği, oyulmuş-PDMS pul kapalı kanallar oluşturmak üzere bir cam lamel eklenir. Giriş ve çıkışları kültür / medya yükleme için oluşturulur. Bu arada, temizleme ve cam yüzey ve PDMS damgası diğer prosedürler hücre uyumluluk sağlamak için gereklidir. <ol><li> Biyopsi delgeç kullanarak PDMS damga ile rezervuarlar olun. Biz onların çapı 6 mm olarak seçin. Bu tanklar iki amaca hizmet eder. Bir hücre büyümesi için ekstra besin tutmaktır. Diğer pipet yükleme ve vakum aspirasyon erişim içindir. </li><li> 30 dakika için% 70 etanol içinde PDMS pul daldırın ve daha sonra başka bir 10 dakika süreyle de-iyonize su ile durulayın. Amacı üretim sürecinde tanıttı ve PDMS kontaminasyon Çaprazbağlanmamış potansiyel organik artıklardan temizlemek için. Gibi organik ekstraksiyonu 13 gibi daha yoğun ve kapsamlı bir temizlik işlemleri 14 yerde kullanılmıştır. Bununla birlikte, BTSC kültür içinde gereksiz bulundu. </li><li> Otoklav (121 ° C, 35 dk) ile PDMS damga sterilize edin. Bu adım öteye PDMS kroslink reaksiyonu tamamlar. Bu adımdan başlayarak ve adım 3.6 kadar, tüm işlemler steril bir şekilde alınır. </li><li> PDMS damga sonra daha önce poli-L-lisin ile kaplanmış bir cam lamel üzerinde yerleştirilir. 15-17 cihaz daha sonra gece boyunca 37 laminin çözeltisi ile kanal ° C dolgu ile laminin ile kaplanır Laminin cihazdan aspire edilir ve cihaz kök hücre ortamı ile yıkanır. </li><li> Rezervuar ve kanal içine adım 1'den hücre süspansiyonu yükleyin. Ayrılmış hücreleri 11 ul bir tohum rezervuar içine yerleştirilir. Vakum aspirasyon gerekirse, tohum odasına hücreleri zorlamak için kullanılır. Hücrelerin bir ek 7 ul bitişik tohumlama rezervuar yerleştirilmiştir. Not: Ortalama hücre yoğunluğu 20.000 hücre / mikrolitre ortamdır. Kıçtaer beş dakika, tohumlama ve alıcı rezervuarları medya ile su basmış. </li><li> Üstüne 0.5-1 mm ön otoklavlanmış PDMS yaprak yerleştirin. İki PDMS adet arasında doğal oluşmuş yüzey adezyon hücre kültürü mühürlü ve ulaşım, kuluçka ve mikroskopik görüntüleme için hazır hale getirecektir. </li></ol> 4. BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, ABD) ile BTSC göç Uzun vadeli time-lapse görüntüleme. Kamera birleştiren, yazılım ve inkübatör tek bir kutuya, bu mikroskobik sistemi gün boyunca hiçbir rahatsızlık ile görüntü hücresi kültürünü mümkün kılar. Buna ek olarak, eşsiz motor tasarımı objektif lens hareket eder ve nokta-Ziyaret özelliği sabit örnek sahne tutar. Bu high-throughput tahlil görüntü paralel deneyler ve parça hücre lokomosyon için pratik yapar. <ol><li> Pre-denge sıcaklık, nem ve hava besleme stabilize etmek için 45 dakika boyunca Biostation IM. Birçok su işletmelerinin eklenmesiörnek odası içinde ained bulaşık uygun nem sağlamak için kullanılır. </li><li> Mikroskop numune odasında hücre yeten aygıtı yükleyin ve merkezi bu mikro cımbız kullanarak. </li><li> Biostation yazılım odak, pozisyon noktaları ve zaman noktaları ayarlama ve time-lapse başlatın. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: Bir bölümlere Mikroakışkan cihaz kullanarak kanser hücresi göç görsel denetim ve karakterizasyon örnekleri Şekil 3 ve Şekil 4 de gösterilmiştir. Hücre hattı BTSC olduğunu. Mevcut kurulum sayesinde, hücre kültürü faz görüntüleri sürekli 5 gün (Şekil 3) gibi uzun ve her 2 saniyede bir (Şekil 4) gibi sık olarak için kaydedilebilir. 5 gün ötesinde, kültür ortamı kaldırıldı besin ikmal ve atıklar için değiştirilmesi gerekir. Bizim uzun vadeli time-lapse morfolojik değişikliklere göre, geçiş sırasında altı hücreli aşamadan döner bir dizi tanımlar. Illu gibiŞekil 3 'de trated, (i) geçiş öncesi, (ii) başlaması, (iii)-arama yolu, (iv), (v) hedef-exloration ve (vi)-sonrası göç seyir olarak adlandırılmaktadır. Alma odası olarak, iğ şekilli hücreler, büyümek bölmek ve yavaş yavaş göç edebiliyoruz toplu tümörlerde aşama (i) içinde kalmak. Onlar mikrokanal girişinde yaklaşırken, birkaç hücre sahnelemeye devam (ii) yapışkan çıkıntı genişletmek ve oluşturduğunuzda. Sadece biri girişinde işgal ve göç yönünün keşfedebilirsiniz aşaması (iii), devam edebilir. Hücre göçü yönünü belirler sonra, tüm mikrokanal yoluyla taşınan bir sabit ve yüksek hızı, mikrokanal yoluyla seyir (iv) aşamasında ilerler. Aşama (vi) daha sonra oda alma araştırmak açık alan, ve aşama (v) mikrokanal, hücre ilerler sonunda. Mikrokanal olarak, geçiş güç çoğunlukla, şekil 4'te gösterildiği gibi faaliyet blebbing ile amoeboid cel ile benzer oluşturulurl. Hücre blebbing ve membran deformasyon tam burada kaydedilir. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Mikroakışkan cihazın imalat Şemaları. Tüm süreç yumuşak litografi bir modifiye tekniği ile 3-inç silikon kolu gofret üzerinde yapılır. 3-mikron yüksekliğindeki mikro ve hizalama belirteçler birinci tabaka olarak yapılır. Hizalama işaretleri séloteyip ile örtülü iken sonra 250 mikron kalınlığında su-8 daha sonra kalın fotorezist tarafından görme engelleme olmadan ortalayıcı maskelemek için erişilebilir olabilir, öyle ki, spin-kaplamalıdır. Bu nedenle, oda özellikler i ikinci tabaka olarak yapılabilir ve doğru bir şekilde birinci katman ile hizalanır. PDMS damga sonunda çıkan ana kapalı kalıplanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Şekil 2. Cihaz montajı ve hücre ekimi süreci Şemaları. PDMS ve gl ile çevrilieşek lamel, 3D kültür alanı odaları, rezervuarlar ve mikrokanallardaki oluşmaktadır. Alıcı bölme, başlangıçta hücre içermeyen ortam ile dolu iken tohum haznesi, hücre kültürü ile doldurulur. Aralarındaki bağlantı mikrokanallar tarafı alıcı tohumlama taraftan hücre göç rotası sağlar. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Mikrokanal yoluyla Şekil 3. BTSC göç. Üst: time-lapse anlık tek bir hücre (yeşil vurgulanır) tohumlama taraftan alıcı tarafa 400 mikron üzerinde geçirir göstermektedir. Tüm yolculuk hücrenin morfolojik değişikliklerin bir dizi içeren, yaklaşık 2 gün sürer. Ölçek çubuğu 40 mikron. Alt: Altı göç dönemlerinde bir karikatür gösterimi. Pre-migration (i): seeding odasında, iğ şeklinde ve bölünebilir hücrelerinin yavaş yavaş birbiri boyunca göç ederler. Hücre gövdesi ve e kutuplaştırıcı birbirleri ile mikrokanal girişinde yarış yakın hücreler lamellipodia çıkıntı xerting. Başlatma (ii): rakiplerinden geri çekilmek olurken en yüksek kapasiteye sahip göçmen hücresi kanal girişinde kaplar. Yol keşif (iii): az polaritesi ile amoeboid moduna göçmen hücre değişiklikleri. Bu göç modu son derece hareketli ve küçük membran çıkıntılar blebbing bütün yönlerde yol keşfetmek mümkün. Normal (iv): geçiş yolu belirlendikten sonra, hücre ileri gitmeden bir ek büyük çıkıntı koruyarak bir uyarlanmış amoeboid moduna dönüşür. Bu şekilde, yüksek bir hücre hareketliliği hem de sabit bir yönü ve hızının destekler. Hedef keşif (v): yol-sona ermesinde, hücre yavaşlar ve herhangi bir işgali hedef alma odası keşfetmek filopodias geliştirir. Post-göç (vi): Alıcı odasına girdikten sonra, hücre yıldız şeklinde dönüşür ve yüksek motilite ama hiçbir yönü belirlenir korur. "/&gt; . (AB): time-lapse Şekil 4 Anlık bir BTSC aktivite ve membran deformasyon blebbing döngüsünü gösteriyor. başlatılması; (BD). Genleşme; (DF). Retraksiyon. Ok ve eğri çizgiler yön ve membran deformasyon konumu, sırasıyla temsil eder. Anlık her 8 saniyede bir toplanır.

<ol><li>Carke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Stem+Cells-Perspectives+on+Current+Status+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22AACR+Workshop+on+Cancer+Stem+Cells.+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions.</a> AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).</li>
<li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cancer cell invasion.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 15, 87-96 (2005).</li>
<li>Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+Cancer%3A+Cancer+Stem+Cells+versus+Clonal+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution.</a> Cell. 138, 822-829 (2009).</li>
<li>Karnoub, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+within+tumour+stroma+promote+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 449, 557-557 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+Devices%3A+New+Tools+for+Studying+Cancer+and+Cancer+Stem+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li>
<li>Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Tumor+Cell+Cytoskeleton+Organization+on+Invasiveness+and+Migration%3A+A+Microchannel-Based+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).</li>
<li>Irimia, D., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+migration+of+cancer+cells+under+conditions+of+mechanical+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement.</a> Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).</li>
<li>Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).</li>
<li>Clark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cancer+stem+cells+exhibit+decreased+dependence+on+exogenous+growth+factors+for+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).</li>
<li>Regehr, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).</li>
<li>Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Dynamic+Microtubule+Invasion+of+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines.</a> Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Vitzthum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Na%28%2B%29%2FH%28%2B%29+exchange-mediated+pH%28i%29+regulations+in+neuronal+soma+and+neurites+in+compartmentalized+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices.</a> Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).</li>
<li>Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+signaling+pathways+in+brain+tumor-derived+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells.</a> Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).</li>
<li>Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hierarchy+of+Self-Renewing+Tumor-Initiating+Cell+Types+in+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma.</a> Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).</li>
<li>Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+Stem+Cell+Lines+Expanded+in+Adherent+Culture+Have+Tumor-Specific+Phenotypes+and+Are+Suitable+for+Chemical+and+Genetic+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens.</a> Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).</li>
<li>Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The biology of cancer stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).</li>
<li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan mikroakışkan cihaz ve görüntü kayıt tekniği göç sırasında hücresel morfoloji görsel bir karakterizasyonu sağlar. Mevcut konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırıldığında, mikroakışkan platformu maliyet etkinliği, yüksek verimlilik ve tasarım esnekliği avantajları bulunmaktadır. Sunulan mikroskopik görüntüleme sistemi uzun vadeli canlı hücre göçü çalışma ve kayıt verir. Lens motorlu özelliği örnek bozmadan görüntü çözünürlüğü yüksek birden göç yolları izlemek mümkün kılar. Cihazın montaj sırasında, mühür PDMS kalıcı olmayan PDL kaplama kolaylık (adım 3.4) için cam lamel yapıştırılır. Bu protokolün başarısına için iyi bir sızdırmazlık elde etmek için çok önemlidir. Bu tür yüzey üzerine damga veya toz / enkaz içinde hava kabarcığı gibi aygıt fabrikasyonu, tanıttı Kontaminasyon Sızan sıvının içinde yapıştırma ve sonucu tehlikeye atabilir. Bu nedenle, treating tozsuz bir şekilde aygıtı başarısızlığı önlemek için önemlidir. Önceki PDL-kaplama, cam lameller nitrik asit ile tedavi edilir PDL çözelti toz / artıkları yok etmek için santrifüje tabi tutulur. Bir temiz oda erişilebilir değilse biz, alkol durulama, seloteyp bulmak ve PDMS damga toz / enkaz kaldırma su banyosu çok yararlı. PDMS damga cam lamel temas yaptıktan sonra, cımbız ile hafifçe damga vurma mühür kolaylaştırır. BTSCs 10 normal nöral kök hücre kültürüne benzer kök hücre orta alanda kültür yoluyla insan ameliyathane örneklerden zenginleştirilebilir. Bu şekilde zenginleştirilmiş BTSCs tür kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu (CD133, nestin), birden fazla nöral soylar (glial ve nöronal) farklılaşma ve 100 gibi az bir ortotopik immünyetmezligi fare modelinde tümör başlatılması gibi kök hücre benzeri özellikler, göstermek hücreler 18. Bazı tartışmalar purifi hakkında mevcut olmasına rağmenkatyon ve BTSCs 1, 19-21 bakım, küre-yetiştirilen BTSCs iyi ebeveyn tümör 22-24 fenotip ve genotip korumak. Bölümlere alan hücre göçü için fizyolojik ortam taklit eder. Bizim cihazda, BTSC hücresel morfoloji düzenleyerek bir boyut kısıtlı uzayda göç güçlü bir kapasite gösterirler. Hücre morfolojik değişiklik gösterir karakterizasyonu bitişik beyin BTSC işgalinin bir muhtemel yeni bir ayrıntılı açıklama modellemek olabilir altı aşama sırası modu-dönüşümler gösterir. Erken evrelerde, hücre polarite önemli miktarda kazanmak ve etkili bir mikrokanal içinde kendilerini tutturmak için yapışkan çıkıntılar oluşturur. Mikrokanaldaki hücre doluluk kurulduktan sonra, bir seyir moduna dönüştürür ve bir mikrokanal yoluyla tüm yolculuk için bu modu korur. Bu aşamada, BTSC yüksek motilite ve tutarlı bir yönü korumak ancak enerji tasarrufu. Içindeterestingly, bu mikrokanal biri böyle, bir defada bir seyir hücre sınırlı olduğu göründüğünde bu aşamada tek bir hücrenin gelirleri, mikrokanal diğer hücreleri geri çekilme. Bu mekanizma olasılıkla yayılan tümör etkinliği sağlar ve mikrokanal besinlerin aşırı tüketim önler. Mikrokanal boyunca göç tamamladıktan sonra, bir hücre yönlü çıkıntılar ve işgali hedefler veya yeni göç yolları için daha ileri araştırmalar için onun eğilimi kavuşur. Bölümlere Mikroakışkan cihaz in vitro bir roman beyin parankiminde BTSC infiltrasyon çalışmak için bir mikro yaratma anlamına gelir sunuyor. Bu yöntem, kolaylıkla kanser kök hücre (CSC) ve diğer tümör tipleri türetilen göç hücre hatları çalışmaya adapte edilebilir. Mikroakışkan cihaz Kültürleme hücrelerin inkübatör ve doku kültürü uzmanlığı ile donatılmış herhangi bir modern biyoloji laboratuvarlarında yapılabilmektedir. Su-8 master, PDMS ile donatılmışdöküm ve cihaz montajı yumuşak litografi bazı temel eğitim ile mümkün bulunmaktadır. Buna ek olarak, bu platformu aynı zamanda, gradyan karıştırıcı, yüzey modelleme, sıvı kontrolü ve mikroelektrot gibi diğer işlevsel modül entegre ile diğer uygulamalar için uzatılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiye kartal ortamı (DMEM), yüksek glukoz </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Ham&#39;ın F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> B27 takviyesi eksi A vitamini </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), rekombinant insan </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF), rekombinant insan </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Domuz intestinal mukozadan Heparin sodyum tuzu, </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Laminin (doğal fare) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Hücre orta Kök </td><td></td><td></td><td><ul><li> % 30 Hams F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> % 1 antibiyotik antimikotik </li><li> A vitamini olmadan% 2 B27 </li><li> EGF (20 ng / ml) ve bFGF / heparin (20 ng/ Ml bFGF, 5 mg / ml heparin) Karışım maddeleri ve kullanımdan önce steril filtre </li></ul></td></tr><tr><td> Bazik Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) / Heparin </td><td></td><td></td><td><ul><li> Tablet konsantrasyon 20 ug / ml </li><li> 25 ug için: 25 ug bFGF ile 5mg/mL, heparinin 1.25 mL ekleyin. </li><li> 250 mikrogram için: 250 mcg bFGF ile 1 ml 5mg/mL Heparin ekleyin. Konik 15 mL aktarın ve konik 11.5 ml 5 mg / ml heparin ekleyin. </li><li> -80 50 ul veya 250 ul hacimde ° C olarak Mağazası </li></ul></td></tr><tr><td> Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Tablet konsantrasyon 20 ug / ml </li><li> 200 mikrogram için: 200 mikrogram EGF ile 1 ml steril DMEM (Gibco 11965-118) ekleyin. 15 ml konik aktarın ve 9 mL DMEM ekleyin. </li><li> 500 mikrogram için: 200 mikrogram EGF ile 1 ml steril DMEM (Gibco 11965-118) ekleyin. 50 ml konik aktarın ve 24 ml DMEM ekleyin. <li> 50 &amp; mu gibi saklayın; L veya -80 250 ul alikotları ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Heparin </td><td></td><td></td><td><ul><li> Tablet konsantrasyonu 5 mg / ml &#39; </li><li> 100 mg heparin tartılır. </li><li> 20 ml (% 70)-DMEM (% 30) F12 (% 1) PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 ul PSA) &#39;dan 100 mg heparin ekleme </li><li> Steril filtre </li><li> -80 ° C&#39;de 50 ul veya 250 ul alikotları olarak Mağazası </li></ul></td></tr><tr><td> su-8 fotorezist </td><td> MICROCHEM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Silikon sap gofret </td><td> WRS Malzemeleri </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> 50 mikrogram /nihai konsantrasyon için PBS tamponu içinde mL </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> Nikon aletleri </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bölümlere mikroakışkan cihazlar ve canlı hücre görüntüleme kullanma kanser kök hücre göç değerlendirilmesi

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Son 40 yıl içinde, ABD&#39;de ölüm oranı sadece% 5&#39;lik bir azalma ile sonuçlanan, kanser araştırmalarına 200 milyar doların üzerinde yatırım yaptı. Hasta sonuçlarını geliştirmek için önemli bir engel agresif kanser hücresi invazyonu, metastaz ve terapötik direnç 1 ile ilişkili hücresel göç yatan mekanizmaların yetersiz anlayışı. Glioblastoma multiforme (GBM), en sık görülen habis yetişkin beyin tümörü 2, bu zorluk örneğidir. Standart cerrahi, radyasyon ve kemoterapi rağmen, hastanın ortalama sağkalım komşu beyin ve hızlı kanseri nüks 2 içine agresif GBM infiltrasyonu nedeniyle sadece onbeş ay vardır. Anormal hücre göç mekanizmaları ve tümör mikroçevresinin etkileşimler 3 normal hücrelerden kanseri ayırt. Bu nedenle, GBM için terapötik yaklaşımlar iyileştirilmesi kanser hücre göçü mekanizmaların daha iyi anlaşılması gerekir. Son çalışmalar tha anlaşılacağıGBM&#39;da hücrelerin ta küçük subpopülasyonu, beyin tümörü kök hücre (BTSC), tedaviye dirençli ve nüks sorumlu olabilir. BTSC göç kapasitesinin altında yatan mekanizmaların yalnızca karakterize 1,4 olmaya başlıyor. Görsel denetim ve geometrik manipülasyon, genel migrasyon testleri 5 bir sınırlama nedeniyle genel hücre popülasyonlarının miktarının sınırlıdır. Buna karşılık, mikroakışkan cihazlar çünkü modern mikroskopi ve mikro-çevre 6-9 üzerinde kontrol ile uyumluluk tek hücre analizi izin. Biz bölümlere mikroakışkan cihazları kullanarak BTSC göç detaylı karakterizasyonu için bir yöntem mevcut. Bu PDMS yapımı aygıtları birbirine bağlı üç bölmeye doku kültürü ortamında cast:, kamara tohum haznesi alma ve mikrokanallar köprü. Biz her iki odacıkta da 4-5 için geçerli BTSC desteklemek için yeterli ortam tutun böyle cihaz tasarlandıOrtam değişimi olmadan ys. Ilk tohumlama odasına girmiş Highly mobil BTSCs paralel alıcı odasına mikrokanallardaki köprü olsa göç sonra izole edilmiştir. Bu göç beyin interstisyel boşluklar sayesinde kanserli hücre yayılmasını taklit eder. Göç sırasında hücre morfolojisi faz canlı görüntüleri birkaç gün boyunca kaydedilir. Göç eden BTSC bu nedenle, recultured izole edilmiş olabilir, ve daha fazla analiz edebilir. Bölümlere mikroakışkanları BTSCs ve diğer kanser kök hücrelerinin göç davranışlarını incelemek için çok yönlü bir platform olabilir. Gradyan jeneratörler, sıvı taşıma, mikro-elektrotlar ve diğer mikroakış modüller bir araya getirerek, bu cihazlar ayrıca, ilaç tarama ve hastalık teşhis 6 için de kullanılabilir. Göç hücreleri saldırgan bir subpopülasyonu izolasyonu moleküler mekanizmalar çalışmaları sağlayacaktır.

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Son 40 yılda Amerika Birleşik Devletleri, kanser araştırmalarına 200 milyar doların üzerinde yatırım yapmış, ancak bu durum ölüm oranlarında yalnızca %5'lik bir azalma ile sonuçlanmıştır. Önemli bir...

Bu prosedürün genel amacı, bölmelere ayrılmış bir mikroakışkan cihaz aracılığıyla kanser hücresi göçünü görsel olarak incelemek ve karakterize etmektir. Bu, öncelikle serumsuz ortamda büyütülen beyin tümörü kök hücrelerinden oluşan mevcut nörosferlerin ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, çift katmanlı bir SU eight master üretmek ve yumuşak litografi yöntemiyle bölmeli bir tasarıma sahip PDMS kalıplar oluşturmaktır.Ardından, mikroakışkan cihazı birleştirin ve beyin tümörü kök hücreleri ile yükleyin. Son olarak, tümleşik bir mikroskobik sistem kullanılarak beyin tümörü kök hücresi migrasyonunun uzun süreli zaman serili görüntülemesi gerçekleştirilir. Nihayetinde sonuçlar, beyin tümörü kök hücrelerinin ultra kısıtlanmış bir alanda migrasyonları sırasında döngüsel bir morfolojik aşamalar dizisi sergilediğini göstermektedir.Bu tekniğin Transwell Boyden Kamerası gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikro cihazların migrasyon sürecinin görsel olarak incelenmesine, hücrelerin kontrollü yerleşimine ve faktörlerin hassas bir şekilde iletilmesine olanak sağlamasıdır. Bu nedenle, mikro akışkan teknolojisi; güvenilir, verimli ve maliyet etkin tek hücre seçimi ve yönlendirme özelliklerine sahiptir. Yüksek migrasyon kapasitesine sahip hücrelerin tek hücre analizi, gelecekteki potansiyel kemoterapötik hedeflerin belirlenmesini sağlayabileceği için bu tekniğin etkileri kanser metastazı ve nüksetme tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem kanser sisteminin migrasyon davranışı hakkında içgörü sağlayabilse de, embriyonik gelişim, bağışıklık yanıtları, yara iyileşmesi ve organ rejenerasyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. BTSC kaynaklı nörosferlerin hücre süspansiyonu ile başlayın. Hücreleri 15 mililitrelik konik tüpe toplayın ve beş dakika boyunca 900 RPM'de santrifüjleyin, ancak daha yüksek hıza çıkmayın.Süpernatantı aspire edin. Ardından, nörosferlerin gevşemesi için onları 37 °C'de beş ila 10 dakika boyunca 0,5 ml ön ısıtılmış Accutane içinde inkübe edin. İnkübasyon sonrası, hücreleri bir P 100 pipeti ile 10 ila 20 kez nazikçe pipetleyerek mekanik olarak parçalayın.Ardından, Accutane santrifüjünü nötralize etmek için 1,5 mililitre kök hücre besiyeri ekleyin, hücre süspansiyonunu 1300 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücreleri bir mililitre kök hücre besiyerinde yeniden süspande edin. Hücre yoğunluğunu bir hemositometre ile kontrol edin ve yoğunluğu mikrolitre başına 20.000 hücreye ayarlayın. SU eight master üretimine başlamak için, Adobe Illustrator ve Image Setter entegreli lazer yazıcı şeffaf film kullanarak iki fotomaske hazırlayın.Birinci katman fotomaskesi, iki fidüsyel işaretçi ve bir mikro kanal dizisinden oluşurken, ikinci katman fotomaskesi yerleştirme ve alma odacıklarını içerir. Her iki maske katmanını da izopropanol ile temizleyin ve havada kurumaya bırakın. Şimdi, bir taşıyıcı gofret üzerine üç mikron kalınlığında SU eight fotoresist kaplayın ve ardından yumuşak pişirme (soft baking) işlemini gerçekleştirin.Ardından, birinci katman fotomaskesi ile yakın temaslı UV ışınlaması yaparak fotorezisti pozlayın ve kürlenmeye bırakın. Daha sonra, kürlenmiş wafer'ı post-bake işlemine tabi tutun ve geliştirin. Taşıyıcı wafer'ın fiducial marker alanlarını scotch bant ile kapatın.Ardından, gofere 250 micron kalınlığında fotoresist kaplayın. Sonrasında, hizalama amacıyla işaretleyicileri ortaya çıkarmak için bandı soyun. İkinci fotoresist katmanını yerleştirin ve referans işaretçilerini hizalayın.Ardından, ikinci katman fotomaskesini UV ışığına maruz bırakarak kürleyin, sonrasında ön pişirme ve geliştirme işlemlerini gerçekleştirin. Yüzey yapışkanlığını azaltmak için SU-8 master'ı buhar biriktirme yöntemiyle stabilize edin. Waferları, vakum altında birkaç damla trikloroklorbenzen çözeltisi içeren bir desikatöre en az bir saat boyunca yerleştirin.Kalıp, PDMS ile kalıplama yapmak için hazır hale gelecektir. İşleme, prepolimer bazını kürleyici ile 10'a 1 oranında iyice karıştırarak başlayın. Ardından, hava kabarcığı kalmayana kadar vakumla gaz giderme işlemi için karışımı bir desikatöre yerleştirin.Karışımı maskenin üzerine dökün ve tekrar gazını alın. Eğer yeni hava kabarcıkları oluşursa, kalıbı düz bir ısıtıcı plaka üzerinde 90 °C'de iki saat boyunca kürleyin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, PDMS damgayı nazikçe ayırın.Böylece kültür kanalları PDMS üzerine kazınmış olur ve mikroakışkan cihazın montajı için hazır hale gelir. Master kalıp, çatlayana veya aşınana kadar kalıplama için yeniden kullanılabilir. Master kalıp yapışkan hale geldiğinde, yapışma önleyici kaplama yeniden uygulanabilir.PDMS kalıp üzerinden mikroakışkan cihazda giriş ve çıkışların oluşturulmasıyla başlayın. Biyopsi delme aleti kullanarak, PDMS kalıbı 30 dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek temizleyin ve ardından 10 dakika boyunca deiyonize su ile durulayın. PDMS kalıbı otoklavlayarak sterilize edin ve çapraz bağlanma reaksiyonlarını tamamlayın.Şimdi PDMS damgayı, poli L-lizin ile kaplanmış bir cam lam üzerine yerleştirin. Ardından, hazne girişlerinden laminat çözeltisi doldürülerek cihaz laminat ile kaplanır ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, cihazdaki laminatı aspire edin.Ardından cihazı, iki kez kök hücre besiyeri ile doldurup boşaltarak yıkayın. Şimdi, bir ekim rezervuarına 11 µL disosiye edilmiş hücre yükleyin. Gerekirse, hücreleri hazneye itmek için vakum aspirasyonu kullanın. Daha sonra, yanındaki ekim rezervuarına yedi µL daha hücre yükleyin.Beş dakika sonra, yerleştirme ve karşılama rezervuarları besiyeri ile dolacaktır. Şimdi, cihazın üzerine 0,5 ila bir milimetre kalınlığında steril bir PDMS tabakası yerleştirin. PDMS'in kendi yüzeyine doğal yapışma özelliği cihazı mühürleyecektir; mühürleme işlemi tamamlandığında cihaz taşıma, inkübasyon ve mikroskobik görüntüleme için hazır hale gelir.Biot IM cihazını 45 dakika boyunca çalıştırarak ön dengelemeye tabi tutun. Sıcaklığını, nemini ve hava beslemesini stabilize etmek için, uygun nem düzeyini sağlamak amacıyla örnek haznesine birkaç kap su ekleyin. Hazırlanan cihazı mikroskobun örnek haznesine yerleştirin.Cihazı mikro cımbız kullanarak merkezleyin. Şimdi Biot yazılımını kullanarak odak pozisyon noktalarını ve zaman noktalarını ayarlayın ve gerekirse zaman atlamalı kayıtları başlatın. Kültürde beş gün geçtikten sonra, kültür medyasını değiştirin.Cihaza ekilen BTC'ler, faz görüntüsüyle sürekli olarak kaydedildi. Oturma odasında beş gün boyunca, iğ şeklinde hücreler migrasyon öncesi aşamada kaldı. Mikrokanal girişine yaklaştıklarında, birkaç hücre genişledi ve yapışkan çıkıntılar oluşturdu.Sadece tek bir hücre girişi işgal edebilmiş ve göç yönünü keşfedebilmiştir. Hücre göç yönünü belirledikten sonra, tüm mikrokanalda sabit yüksek hızda ilerlemiştir. Mikrokanalın sonunda hücre, alıcı bölmeye nihai olarak girmeden önce bölmenin açık alanını keşfetmiştir.İki saniyelik iki görüntüleme aralığıyla hücrelerin gözlemlenmesi sonucunda, göç hareketinin çoğunlukla OID hücrelerininkine benzer bir "blabbing" aktivitesi tarafından üretildiği görülmüştür. Prosedür uygulanırken, cihaz tasarımının oldukça esnek olduğu ve istenen hücre göçü derecesine ulaşmak için mikrokanal boyutlarının manipüle edilebileceği unutulmamalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz hücreleri kültüre etmek için uygun, özgün bir bölmelendirme mikroakışkan cihazının nasıl oluşturulacağını ve ardından bu prosedürü takip ederek hücrelerin göç karakteristiklerini kalitatif ve kantitatif olarak tanımlamak için uzun süreli zaman aşımı görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.Yüksek göç kapasiteli kanser hücrelerinin genetik olarak ne kadar farklı olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için yeni nesil dizileme veya DNA mikroarray gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

evaluation-cancer-stem-cell-migration-using-compartmentalizing

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz yeni bir agaroz jel tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak nöral kök hücreler (NSC'lerde) motilite epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade artırdığını göstermektedir. Bu teknoloji, insan sinir kök hücreleri gibi hücre kaynakları kıt olan diğer memeli hücre sistemleri, kolayca adapte olabilir ve zaman etrafında dönüş kritik öneme sahiptir.

Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Bu videoda, ilgilenilen ilacın kemotaksis migrasyon plakası kullanarak canlı beyin tümörü kök hücrelerinin migrasyonu üzerindeki etkisini analiz etmek için beyin tümörü kök hücre migrasyon testi yapıyoruz. Canlı hücre görüntüleme, tahlil sırasında hücre göçünün görselleştirilmesini ve ölçülmesini kolaylaştırır.

İlaç Tedavisi Çalışmaları için Beyin Tümörü Kök Hücre (BTSC) Migrasyon Testi: İlaç Tedavisinin BTSC'lerin Migrasyonu Üzerindeki Etkisini Analiz Etmek İçin İn Vitro Canlı Hücre Görüntüleme Tekniği

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Burada, kantitatif geçiş ve zamanla ve birden fazla tedavi koşullar altında işgal glioblastoma Beyin tümör kök hücrelerin ölçmek için canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklar.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

HMCA tabanlı görüntüleme plaka işgali tahlil performans için sunulmaktadır. Bu plaka üç boyutlu (3D) tümör pulcuklarının oluşumu ve hücre dışı matriks (ECM) içine kanser hücre işgalinin ölçüm kolaylaştırır. İstila tahlil miktar yarı otomatik analizi ile elde edilir.

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Burada, bir kan beyin bariyeri metastatik tümör mikro-ortamının hazırlanması ve kültürlenmesi ve konfokal görüntüleme ve yapay zeka (makine öğrenimi) kullanılarak durumunun ölçülmesi için bir protokol saklıyız.

Organ-On-A Chip 3D Modeli, Makine Öğrenimi ve Konfokal Tomografi Kullanarak Beyin Metastatik Tümör Mikro-Ortamının Ölçülmesi

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Öğrenin mikroakışkan cihazlar ve canlı hücre görüntüleme kullanarak kanser kök hücre göçünü değerlendirmeyi. Bu yöntem beyin tümörü kök hücrelerinin metastaz mekanizmalarını anlamak için güvenilir bir araç sunar.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet