Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Bu deneyin genel amacı, hücre istilası ve göçünü incelemek için kullanılan iki testi, Boyden odası testini ve optimize edilmiş bir in vitro video mikroskobu tabanlı çizik yarası testini raporlamak ve karşılaştırmaktır. Bu deneyler, en uygun yöntemin seçimi gibi istila ve göç çalışma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu optimize edilmiş in vitro video mikroskopi tabanlı çizik yara testinin ana avantajı, tedavi koşulları arasında tekrarlanabilir ve kesin bir karşılaştırma sağlamasıdır.

Bu yöntem hücre göçünü ve istilasını değerlendirebilse de, iyileşme veya doku yenilenmesi gibi diğer çalışma alanlarına da uygulanabilir. Testin birinci gününden 72 saat önce, 175 santimetre karelik bir şişede 25 mililitre kültür ortamında 1/6 hücreye 10 kez tohumlayarak SQ20B hücrelerini hazırlayın. Hücrelerin 37 santigrat derecede% 80 hücre birleşmesine kadar büyümesine izin verin.

Tripsinizasyon ve hücre sayımından sonraki birinci gün, hücreleri 25 santimetre karelik bir şişede, değerlendirilecek her koşul için üç mililitre kültür ortamında altı kez 10 ila 1/5 hücre hücre yoğunluğunda tohumlayın. Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, her şişedeki ortamı üç mililitre düşük fetal sığır serum ortamı ile değiştirerek hücreleri aç bırakın.

Hücreleri 37 santigrat derece inkübatörde 24 saat aç bırakın. İstila tahlili için, hücre açlığının başlamasından 12 saat sonra kaplanmış Boyden odalarını hazırlayın. Her Boyden odasını eşlik eden plakaya yerleştirin.

Her kaplanmış odaya 500 mikrolitre açlık hücresi ortamı ekleyin. Ertesi gün, üçüncü gün, kemoatraktanı hazırlamak için eşlik eden plakayı kullanın. 24 oyuklu eşlik eden plakanın her bir kuyusunu% 10 FBS, hidrokortizon, penisilin ve streptomisin içeren 750 mikrolitre tam ortamla doldurun.

Kabarcıkları önlemek için üst hazneyi önceden doldurulmuş yardımcı plakaya aktarın. İstila tahlili için, her bir Boyden odasından 450 mikrolitre kültür ortamını dikkatlice çıkarın. Aç bırakılmış SQ20B hücrelerinin triplizasyonu ve sayımından sonra, 500 mikrolitre% 0.1 BSA ortamında 10 ila 1/4 hücreye üç kez 10 tohum atmak, mililitre başına 1/4 hücreye altı kez 10'luk bir son seyreltme sağlar.

Boyden odasını 24 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Dördüncü günde, her bir parçayı eşlik eden plakadan çıkarın ve bir pamuklu çubuk kullanarak hücreleri üst bölmeden dikkatlice çıkarın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre bir boyama kiti kullanarak May-Grunwald Giemsa renklendirmesi elde etmek için her bir parçayı ayrı ayrı sabitleyin ve boyayın.

Beşinci günde mikroskobik analiz yapın. Eşlik eden plakayı, eklerle birlikte 20X faz kontrast mikroskobuna yerleştirin ve zarın alt kısmındaki her göç eden hücreyi sayın. Tahlil tohumunun birinci gününden 72 saat önce, 175 santimetre karelik bir şişede 25 mililitre kültür ortamında 10 ila 1/6 SQ20B hücresi ve hücrelerin% 80 hücre birleşmesine kadar büyümesine izin verin.

Birinci gün, tripsinizasyon ve hücre sayımından sonraki gün, mililitre başına 1/5 hücre üzerinde dört çarpı 10 ila 1/5 yoğunlukta SQ20B hücrelerinin önceden seyreltilmiş bir örneğini oluşturun. Her bir oyukta 100 mikrolitre başına 1/4 hücre başına dört kez 10 ila 100 hücre arasında bir nihai yoğunluk vermek için 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre çözeltisi dağıtın. Plakayı 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 12 ila 16 saat boyunca plakaya yapışmasına izin verin.

Ertesi gün, ticari bir yaralama cihazı kullanarak yaralamak için plakayı davlumbaza götürün. Yara yapıcının üst kısmını çıkarın ve yıkama teknesi solüsyonuna koyun. Plakayı taban plakası tutucusuna yerleştirin ve plaka kapağını çıkarın.

Pim bloğunun arka dübellerini taban plakasının arka deliklerine yönlendirerek pim bloğunu değiştirin. Siyah kolu itip basılı tutun ve siyah kolu aşağıda tutmaya devam ederken pim bloğunu kaldırın. Uyarlanmış konik uçlu bir pipet kullanarak, yaraya dokunmamaya dikkat ederek ortamı hemen her kuyucuktan çıkarın.

Her bir oyuğa 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış 100 mikrolitre hücre ortamı ekleyerek hücreleri yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücre ortamını aspire etmek için uyarlanmış konik uçlu bir pipet kullanın. Daha sonra, kuyucuklarda herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek her bir kuyucuğa her tedavi koşuluna özgü 100 mikrolitre ortam ekleyin.

96 oyuklu plakayı video mikroskobunun uyarlanmış rafına yerleştirin. Video mikroskobu yazılım programını kullanarak, kuyucuk başına bir görüntüde tarama programı. Göç istilası denemesi için en fazla iki saatlik bir aralık gereklidir.

Deneyin amacı bir video üretmekse, en fazla 30 dakikalık bir aralık tercih edilir. Hücre göçünü analiz etmek için her hücre tipine uyarlanmış uygun bir hücre maskesi kullanarak hücre göçünü en az 24 saat ve beş güne kadar izleyin ve kontrol edin. Her hücre hattı için uyarlanmış bir hücre maskesi elde etmek için, belirli bir hücre görüntüsü koleksiyonu kullanarak yazılımdan bir hücre işleme tanımı oluşturun.

Eğrileri izleyin ve verileri, sonuçları analiz etmek ve karşılaştırmak için kullanılabilecek bir elektronik tabloya aktarın. Hücre istilası tahliline hazırlanmak için, SQ20B hücrelerini hücre göçü tahlili için gösterildiği gibi tohumlayın ve 96 oyuklu plakayı inkübatörde inkübe edin. Testin ikinci gününde hücre dışı matrisi hazırlayın.

Kullanmadan önce matrisi en az 12 saat boyunca dört santigrat derecede çözün ve hiçbir agreganın görünmediğinden emin olun. Mikrosantrifüj tüplerini beş dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Matrisi, mililitre başına 300 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş hücre ortamı ile önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerinde dört santigrat dereceye kadar konik uçlarla seyreltin.

Önceden seyreltilmiş matrisli mikrosantrifüj tüplerini buzdolabında dört santigrat derecede tutun. 96 oyuklu plakayı inkübatörden alın. Kaputun altında, daha önce gösterildiği gibi, üreticinin protokolüne göre ticari yaralama cihazını kullanarak yarayı yapın.

Ortamı her bir kuyucuktan hemen çıkarmak için uyarlanmış konik uçlu bir pipet kullanın ve yaraya dokunmamaya dikkat edin. 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış 100 mikrolitre hücre ortamı kullanarak hücreleri iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, sıcaklığını dengelemek için plakayı beş dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Soğuk ortamı her kuyudan çıkarın, kenardan dikkatlice pipetlemeye ve yaraya dokunmaktan kaçınmaya dikkat edin. Dört santigrat derecede önceden soğutulmuş konik uçları kullanarak, her bir oyuğa 50 mikrolitre önceden seyreltilmiş matris ekleyin. Plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

30 dakika sonra, her bir tedavi koşulu için belirtildiği gibi, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre uyarlanmış hücre ortamı ekleyin. Plakayı video mikroskobunda uyarlanan rafa yerleştirin. Daha sonra taramaları programlayın ve hücre göçü tahlili için gösterildiği gibi video mikroskobu analizi yapın.

Hücre fiksasyonundan sonra bir Boyden zarının temsili sonuçları gösterilmiştir. Optimal olmayan zar, zarın üst tarafında hücre kümelerine ve yorumlanamayan sonuçlara sahiptir. Buna karşılık, optimal zar, zarın alt kısmında mavi renkte boyanmış sayılabilir hücrelere sahiptir.

Çizik yara testinin optimal bir sonucu, sıfır saat, 15 saat ve 30 saatte yara iyileşmesinin bu görüntüleri ile gösterilmektedir. Kaliteli bir deney için kriterler, doğrusal bir yara, yarada gözlenen hücre parçası olmaması ve optimal hücre birleşimidir. %90 birleşme, panel A'da gösterildiği gibi yara iyileşme testi için en uygun hücre yoğunluğudur.Panel C, düşük hücre yoğunluğunun bir örneğini gösterir ve panel B, hücre peletinin yetersiz yıkanmasından kaynaklanan hücre kümelerini gösterir.

Video mikroskop yazılımı kullanılarak elde edilen yara iyileşmesinin bu grafiksel temsili, dört tedavi koşulu için zamana göre yara hücresi birleşme parametrelerinin nicelleştirilmesini gösterir. Kombinasyon tedavisinin hücre göçünü önemli ölçüde azalttığı gözlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra hücre göçü ve istila sürecini nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.