Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca ^{2 +} Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, presinaptik bipolar hücre sinir terminallerinde bulunan mikro devrelerin incelenmesi için agar gömülü retina dilimleri hazırlamaktır. Bu, önce karanlığa adapte olmuş bir Japon balığı gözünden retina elde etmek ve bu retinanın küçük bir dikdörtgen parçasını kesmekle gerçekleştirilir. Retina parçası daha sonra şeffaf ve düşük erime noktalı bir agar çözeltisine daldırılır ve daha sonra güzel bir soğuk dilim çözeltisi içinde katılaştırılır.

Bir sonraki adım, dikdörtgen retina parçasını içeren katı agar bloğunu bir vibratör kullanarak dilimlemektir. Son adım, görselleştirmek, tanımlamak ve yama yapmaktır. Bir bipolar hücre sinir terminalini kelepçeleyin.

Sonuç olarak, sonuçlar, atomize ve sağlam bipolar hücre terminallerinden membran kapasitansı ölçümleri ile pre-sinaptik kalsiyum akımını ve sinaptik fiziksel ekzositozu göstermektedir. Merhaba, benim adım Han Kim. Burham Enstitüsü'nde PCO'da doktora sonrası araştırmacıyım.

Bugün, soğuk yüz retinasının AGA gömülü dilim hazırlığını tanıtacağım ve tek boru hattında yama kelepçesi kapasitans ölçümünü göstereceğim. Bu işleme başlamak için, bir çift yaylı makasla gözün ön tarafını eşit şekilde keserek bir akvaryum balığının her bir gözünü yarın. Daha sonra göz kaplarını kalsiyum içermeyen soğutulmuş dilim solüsyonuna koyun.

Gerekirse, lensi cımbızla çıkarın. Daha sonra, bir çift 45 derece açılı uçlu ince forseps ile retinayı göz kabından soyarak retinaya bağlı pigment epitelini çıkarın. Bundan sonra, optik siniri bir çift ince forseps veya yaylı makasla kesin.

Ardından, modifiye edilmiş bir makarna pipeti veya büyük bir uç transfer pipeti ile emme uygulayın. Retinayı çıkarmak için, retinaya bağlı pigment epitelinin geri kalanını nazikçe çıkarın. Temizlenmiş ve sağlıklı retinanın yüzeyi pürüzsüz görünmelidir.

Daha sonra izole retinayı oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika boyunca yaklaşık% 0.03 daha yüksek IDE ile tedavi edin. Vitreus mizahını çıkarmak için, prosedürün düşük ışıkta yapılması gerektiğini unutmayın. Bir sonraki adımda, kavisli kenarları bir jiletle çıkararak retinanın tam kalınlığını içeren yaklaşık iki x iki milimetrelik dikdörtgen bir retina parçası kesin.

Daha sonra retina parçasını agar solüsyonu ile doldurulmuş küçük bir kaba aktarın ve sıvı agarın içine yerleştirilirken retina etrafındaki solüsyon miktarını en aza indirmeye çalışın. Daha sonra, agarı katılaştırmak için retinayı agar ile doğrudan buz gibi soğuk dilim çözeltisine batırın. Daha sonra, dikdörtgen retina parçasını içeren katı agar bloğunu birer birer santimetre küp halinde kesin.

Bloğu, preco dilim haznesindeki dilimleme plakasının yüzeyine yapıştırın. Daha sonra bloğu buz gibi soğuk dilim solüsyonunda 200 ila 250 mikron kalınlığında dilimler halinde dilimleyin. Bir vibrato kullanılarak, yaklaşık beş ila altı saat boyunca geçerli olan toplam beş ila 10 dilim elde edilebilir.

Bundan sonra, dilimlerden birini kayıt odasına aktarın. Dilimin üzerine naylon ipliklerden oluşan bir ızgara ile U şeklinde bir platin çerçeve yerleştirin. Dilimi sürekli olarak dakikada bir ila iki mililitre hızında, karbojen ile köpürtülmüş kayıt solüsyonu ile perfüze edin.

Bu adımda, cam yama pipetini pipetin arkasından bir ila iki santimetre uzakta bir seviyeye kadar dahili solüsyonla doldurmak için 0,2 mikron filtre ucuna sahip bir şırınga kullanın. Daha sonra uçtaki hava kabarcıklarını çıkarın. Pipeti tutucuya sabitleyin.

Pipete pozitif basınç uygulayın ve ucu dilim boyunca aşağı doğru hareket ettirirken bir mikro manipülatör kullanarak hedeflenen terminale doğru hareket ettirin. Dilimin uçla birlikte çekilmediğinden emin olmak için pipeti yanal süpürme yönünde hareket ettirin. Ardından, membran yüzeyini temizlemek için pipet ucunu terminalin etrafında hareket ettirin.

Bir çukur oluşturmak ve pozitif basıncı serbest bırakmak için ucu terminalin kenarına doğru aşağı doğru itin. Bir giga ohm conta oluşmazsa, hemen pipete hafif bir negatif basınç uygulayın. Bir giga ohm conta oluşturulduktan sonra, E PC dokuz yama kelepçesi amplifikatörünü satış kayıt moduna getirin ve tutma potansiyelini eksi 60 veya eksi 70 milivolt olarak değiştirin.

Hızlı kapasitans düzeltmesini uygulayın ve contanın beş ila 10 giga ohm arasında stabilize olmasını bekleyin. Ardından zarı keskin, yumuşak bir emme ile yırtın. Tüm hücre kayıt konfigürasyonunu oluşturmak için.

Şırınga yerine ağızdan emme de kullanabilirsiniz. Tüm hücre konfigürasyonu atomize bir MB terminaline kurulduktan sonra, eksi 70'ten sıfır milivolta kadar 200 milisaniyelik bir adım depolarizasyonu uygulayın. Bu depolarizasyondan önce ve sonra bir voltaj kelepçesi modunda iki kilohertz'lik bir sinüs dalgasının uygulandığını unutmayın Membran kapasitansını ölçmek için depolarizasyon, sezyum bazlı bir iç çözelti ile voltaj kapılı L tipi kalsiyum kanallarının açılmasıyla aktive olan içe doğru kalsiyum akımlarının doğrudan ölçülmesine izin verir.

Paralel olarak, sinaptik veziküllerin kalsiyuma bağlı ekzositozunun neden olduğu kapasitans sıçramasını izleyebilir ve bu da zar yüzey alanını arttırır. Sağlam bir MB bipolar hücre, sinaptik terminal üzerindeki pipet ile yamalanırsa, MB bipolar hücrelerin do haklarındaki boşluk bağlantı kuplajı nedeniyle büyük sızıntı akımları nedeniyle fark edilebilir bir kalsiyum akımı gözlenmeyecektir. Gözlemlenen şey, akım gibi dışa doğru büyük bir sızıntıdır.

Bununla birlikte, gösterilen depolarize edici adımdan önce ve sonra aktive edilen yüksek frekanslı bir sinüzoidal uyaran ile kapasitans sıçraması hala izlenebilmektedir. İşte I-R-D-I-C örnekleri, M bipolar hücre terminallerinin görüntüleri. Sağlam terminallerin A ve B'de gösterildiği gibi eliptik görünme olasılığı daha yüksektir, C ise yuvarlak ve dairesel görünen birleştirilmiş terminali gösterir.

Boya doldurma yöntemi, hücre terminallerini sınıflandırmak için de kullanılabilir. İşte D'de sağlam bir akson, e'de kısmen kesilmiş bir akson ve F'de tamamen çıkarılmış bir akson ile MBI bipolar hücre terminallerinin floresan görüntülerinin örnekleri. Burada kalsiyum görüntüleme sinyalleri, ekzositoz ve inhibitör geri bildirimin doğrudan ölçümleri gösterilmektedir.

Bir MB bipolar hücre terminalinde, bir MB terminalinin telriasında geçici bir yükselen kalsiyum konsantrasyonu, bir voltaj kıskaç aşaması depolarizasyonu ile aktive edildi, MB teleriyanın karşılık gelen floresan görüntüsü B'de görülebilir. Kit agar'a yerleştirilirken retina etrafındaki çözelti miktarını en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu, agar bloğundan Latinleştirilmiş'in bağlanmasını geliştirecektir.