Name: Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Öğrenin, Held kaliksinden presinaptik patch clamp kayıt tekniklerini fare beyin dokusu kullanarak. Bu yöntem sinaptik iletim ve nörotransmitter salınım mekanizmalarını incelemek için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Patch Kelepçe Kurulum: Optik: iyi bir hücre bulmak için, ve bu pozisyonunu kurmak için optik çok önemlidir. Keskin kenarları, yumuşak görünümlü cep: hücrelerinin net bir görüntü elde etmeye çalışın. Ekli kaliks iyi MNTB ana hücreleri aramak için tüm alan tarayın. Çanağı, farklı açılardan kalikslere bakmak için. İlk başta, bu balon şeklindeki terminal üzerinde uygulama OK. Dilim yüzeyinde hücre seçin, ya da 2. hücre katmanı . Pipet yardımıyla hücre ilk 1 / 3 üncü hedefleyin Calyxes Tanımlama: bir çift membran (bkz. Şekil 1) arayın ve bir kaliks olduğunu doğrulamaya yardımcı olmak için farklı açılardan görmek için dilim çanağı . <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="Şekil 1" width="298" height="159" /> Şekil 1 Kaliks Derinliği: Kaliks yüzey ya da mümkün olduğunca yüzeye yakın. Belirlemek için kullanılabilir yama Yüzey: mikroskopta Kullanım ince odak topuzu ne kadar &quot;derin / geniş&quot; kaliks . Örneğin, ince odak tam bir dönüş yaklaşık% 10 üzerine yama için yeterli yüzey alanı daha fazla verecektir. Presinaptik hücre üzerine Sızdırmazlık: ekli hücre elde etmek için, pipet (~ 0.15psi) pos basınç nedeniyle hücre yüzeyinde bir &quot;küçük&quot; bir deformasyon, aşağı ve karşısında, pipet çalıştırmak için manipülatör kullanmak ve hatta içine presyn terminal yüzey iyi bir deformasyon elde etmek için, gerekirse ve sonra, basınç tahliye ve emme geçerli. PULSE, veri toplama programı: İlk kullanımdan önce tampon boyutunu artırmak ve zaman örnekleme kapasitesi ile gerekli ihtiyacınız var. Değiştirilmiş makrolar her zaman yüklemeniz gerekir. Potansiyel Sıvı Junction: Presyn Kayıt Çözümü (negatif 11mV)-11mV. Presyn: Cslow = ~ 15 pF Presyn Rs comp: 10 μsec,% 65 (daha fazla tazminat muhtemel w / çıkış salınımlar) Kayıt kapasitans önce: Test rahatlama (10 mV, 10 msn atlama) rahatlama monoexponential olup olmadığını görmek için, yani presyn terim, tek bir bölme ile modellenen olabilir mi. Filtreler: rahatlama ölçüm sırasında hızlı bir bileşeni kaçırmış değil emin olmak için 30 kHz ve 10 kHz (Bessel filtre sırasıyla 1 ve 2) ayarlayın. Mini kayıtları sırasında, Xinsheng 10 kHz ve 5 kHz kullanılır. LGW mini yükselme zamanı ölçebilir, emin olmak için 30 kHz sadece filtre 1 set kullanmak için bana sordu. Files adlandırma: 7 basamak mm ay 000mmxx (veya ay ve yıl) ve xx hücre sayısı. Çözüm Hatları Temizleme: 20 ml 0.1 M HCl ile deney sonunda temizlenir Hatları 200 ml ddH2O izledi. Harici Çözümler geri dönüşümlü, pompa hızı 20-30 dak. (Banyo odasına dönen çözüm dereceli silindirin içine geri akar). Yeterli emiş sağlamak amacıyla 3 giden hatları ayarlayın. Pipet Presinaptik Kayıt Çözüm: ~ 310 mili osmolar Presyn Çözüm ~ 310 mOsm deney sırasında R erişim artmasını önlemek gerekir. Presyn pipet çözüm postsyn pipet solüsyonu (Presyn ATP ve GTP ex vardır.) Farklı. TTX-ÇAY Çözüm (Ca akımlar izole etmek için): <ul><li> Çözüm blokları K kanalları TİM olarak, hücre üzerine, sonra sızdırmazlık, ya da bile yama uygulamak için çalışın ve hücre depolarizes. Bu hücre için iyi değildir. Aynı nedenden dolayı, dilim TTX uygulandıktan sonra yeniden mümkün olmayabilir. </li><li> Hücre, ya da dilim uzamış depolarizasyon herhangi bir etkisi kontrol etmek için ilk ve son yanıt karşılaştırın. </li><li> TTX etkisi hızlıdır 0.5 mcM 1 mcM yerine kullanılır. Çözüm değiştirdikten sonra daha az süre beklemek gerekiyor. </li></ul> Kesme Dilimleri Vibratome ayarları: <ul><li> 70Hz yanal TİTREŞİMLER </li><li> Genlik: 1.0 mm </li><li> İleri, kaliks ile dilimleri kesme 0.1 aksi kalınlığı 0,01-0,02 mm / sn hız: 180 mikron (~ 150yaşlı hayvanlarda mikron) </li></ul> Dilimler, 1 saat (kesme zamanı içerir), yani, 15-20 dakika sonra kesme banyo terk 37 º C&#39;de inkübe edin. Pipetler: Presyn: ilk başta M 3,5-4,5 3.0-3.5 M daha güvende hissediyorum Çektirmenin manuel ayarlarını ayarlamak için kullanın. Cam kalın olması nedeniyle gecikme özelliğini kullanın (200 veya 1 çalışma gecikmeler) Cam tipi: Borosilikat, standart duvar, hiçbir filament Dış Çap: 2.0 mm İç Çapı 1.16 mm Uzunluk: 7,5 cm

kaliks patch kelepçe kapasitans kayıtlar yöntemleri

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Biz Held, memeli bir merkezi sinir sistemi sinir terminaline kaliks presinaptik yama kelepçe kayıt için temel teknikler göstermektedir. Presinaptik terminal Elektrik kayıtları aksiyon potansiyelleri, kalsiyum kanal akımları, vezikül füzyon (ekzositoz) ve daha sonraki membran alımı (endositoz) ölçümüne izin verir. Nörotransmitter içeren veziküller füzyon kaliks hücre zarının eklenecek vezikül membran neden olur. Bu artış miktarı hücre zarının kapasitans bir artış olarak ölçülür. Kapasitans sonraki azalma endositoz, zar alımı veya kaliks zarı çıkarıldıktan süreci gösterir. Endositoz, kaliks yapısını korumak için gerekli olan ve aynı zamanda gelecekteki ekzositoz olayları için nörotransmitter ile dolu olacak veziküller oluşturmak için gereklidir. Tutulan kaliks Kapasitans kayıtları mümkün veziküler serbest bırakılması ve bir memeli santral sinir sistemi sinir terminal sonraki endositoz doğrudan ve hızlı bir şekilde ölçmek için yaptık. Buna ek olarak, ilgili postsinaptik aktivite eşleştirilmiş kayıtları kullanılarak aynı anda ölçülebilir. Bu nedenle bir merkezi sinir sistemi sinaps presinaptik ve postsinaptik elektriksel aktivitenin tam bir resim bu preparat kullanılarak başarılabilir. Burada, dilim hazırlanması, tanımlanması için düzenlenen temel yama sıkma teknikleri kalikslere morfolojik özellikleri ve kapasitans kayıtları ve endositoz ekzositoz ölçmek için örnekler için yöntemler sunulmaktadır.

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

Memeli merkezi sinir sistemi sinir terminali olan calyx of Held'de presinaptik patch clamp kayıtları için temel teknikleri gösteriyoruz. ...

Merhaba, benim adım Ken Paradiso. NIH'in Bethesda kampüsünde yer alan Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü İntramural programında Ling Gang Wu ile çalışıyorum. Size kaliks tipi presinaptik kayıt yama kenetleme (patch clamping) tekniklerini göstereceğim.Beyin dokusunu hazırlamak için, beyni sıçan üzerinden çıkarıyoruz. Beyni, buz gibi soğuk, düşük kalsiyum içeren bu çözeltinin içine yerleştiriyoruz; beyne her an oksijen sağlanması için çözelti karbogen ile kabarcıklandırılmaktadır. Ayrıca, hasar miktarını en aza indirmek için çözeltinin buz gibi soğuk olması gerekmektedir.Bu durumda beyin şu an bu çözeltinin içinde olacaktır. Beyni dışarı çıkarıp bloğa yerleştirilebilecek şekilde uygunca keseceğiz ve Sano correlate veya hızlı yapıştırıcı ile bloğa monte edeceğiz; ardından hazneyi buz gibi, düşük kalsiyumlu çözelti ile doldurup havalandıracağız, vibratöre yerleştireceğiz ve ardından 70 hertz bıçak frekansında ve 0,01 ila 0,02 mm/s ileri ilerleme hızında, 180 ila 190 mikron kalınlığında dilimler keseceğiz. Bu da saniyede 10 ila 20 mikron olacaktır.Her bir dilim hazırlandıktan sonra, dilimleri buz gibi soğuk salinden, normal kalsiyum solüsyonu içeren bu hazneye aktarıyoruz. B

methods-for-patch-clamp-capacitance-recordings-from-the-calyx

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Biz, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum tam hücreli yama kelepçe kayıt (Kerek) periferik kan mononükleer hücre-kökenli insan T lenfositleri akımları için bir adım-adım protokolü sağlar.

İnsan T lenfositleri, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum Tüm Hücre Kayıt (Kerek) Akımlar

Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ekzositozdan sonra, kaynaşmış plazma zarı endositoz olarak bilinen bir işlemle elde edilir. Bu mekanizma, bir sonraki serbest bırakma turu için yeni sinaptik vezikülleri yeniden düzenler. Bireysel endositik olaylar, fare adrenal kromaffin hücrelerinde hücreye bağlı kapasitans kayıtlarının kullanılması yoluyla yakalanır ve analiz edilir.

Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Bu protokol, tüm hücre yama kelepçesi tekniğini kullanarak H9c2 kardiyomiyositlerinde voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımlarının gerçek zamanlı ve dinamik olarak elde edilmesi için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı

Bu cam mikropipetler şeklini değiştirerek bir kılavuzdur. Özellikle, ısı ve hava basıncı ile konik pipet direnci azaltmak için, ucu açıklığı artırmadan genişletilinceye. Bu küçük hücrelerin düşük gürültü kayıtları elde etmek için kritik öneme sahiptir, ancak birçok uygulamada yararlıdır.

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Öğrenin, Held kaliksinden presinaptik patch clamp kayıt tekniklerini fare beyin dokusu kullanarak. Bu yöntem sinaptik iletim ve nörotransmitter salınım mekanizmalarını incelemek için temel oluşturur.

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

Daha fazla video keşfet