Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

Merhaba, benim adım Ken Paradiso. Bethesda kampüsündeki NIH'de bulunan Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme İntramural programında Ling Gang Wu için çalışıyorum. Size presinaptik kayıt Yama klempleme için yapılmış caly tekniklerini göstereceğim.

Bu yüzden Beyin dokusunu hazırlamak için beyni fareden alıyoruz. Beyni bu solüsyonun içine koyduk, buz gibi soğuk, düşük kalsiyumlu bir solüsyon olacak ve her zaman beyne oksijen kaynağı olduğundan emin olmak için karbojenle köpürecekti. Ayrıca hasar miktarını en aza indirmek için DA'yı en aza indirmek için buz gibi soğuk olması gerekir.

Yani beyin şimdi bu çözümün içinde olacaktı. Onu çıkarırdık, bloğun üzerine konabilmesi için uygun şekilde keserdik, Sano korelasyonu veya çılgın yapıştırıcı ile bloğa monte edilirdik, ancak hazneyi daha sonra buz gibi, düşük kalsiyum çözeltisiyle doldurur, köpürtür, vibratöre yerleştirir ve ardından 70 hertz frekans bıçak frekansında ve 0,01 ila 0,02 milimetre ileri hızda 180 ila 190 mikron kalınlığında dilimler keserdik saniye. Yani bu saniyede 10 ila 20 mikron olacaktır.

Her dilim yapıldıktan sonra, dilimleri buz gibi tuzlu sudan normal kalsiyum çözeltisi içeren bu odaya aktarıyoruz. Bu, kaydettiğimiz çözümün aynısı ve 37 derece fizyolojik sıcaklıkta. Daha sonra dilimleri geri kazanmak için buraya koyuyoruz.

Fizyoloji deneyleri yapılmadan önce yarım saat ila bir saat arasında burada kalır. İşte burada beynim var ve onu çözümden çıkaracağım. Yani bu, gösteri amaçlı daha büyük bir beyin.

Bu bir P 20 sıçanından. Onu tersine çevireceğiz. İlgilendiğimiz şey beyin sapı.

İşte bu aşağıdaki alan ve kaliksin tuttuğu alan, tam da oradaki o bölgede. Yapacağımız şey beynin geri kalanını kesmek, beyin sapını izole etmek ve sonra beyin sapını dilimleme odası için hazırlamak. Tamam, bu yüzden beynin geri kalanını kesip sadece beyin sapını izole edeceğiz.

Nerede olduğumuzu göstermek için onu ters çevireceğim. Normalde bunu bu şekilde yapmazdık ve yine, o kısmın tamamından kurtulabiliriz. Ters çevirdiğimizde, beyin sapını izole ettik ve tam orada başka bir kesim yapıyoruz.

Tamam, bu kadar. Bu beyin sapı. Tutulan Kaliks tam orada ve orada.

Bu beyin sapı. Yine, biraz geriye iteceğiz. Beyinciğin bir tarafını keseceğiz ve bu da beyin sapının bu şekilde yana doğru oturmasına izin verecek.

Biraz Sano akrilik yapıştırıcı koyduk ve hızlı bir şekilde yana yatırarak soğuk buz, soğuk düşük kalsiyum çözeltisi ile doldurduk. Oksijen hattını mümkün olan en kısa sürede oraya alın. Şimdi onu alıyoruz ve vibratoya getiriyoruz.

Beynin başına ulaşmak için onu hızlı bir şekilde getiriyoruz ve sonra beynin başına geldiğimizde, hızı saniyede 0.01 milimetreye düşürüyoruz. Yani saniyede 10 mikro. Yani inanılmaz derecede yavaş bir hızda hareket ediyor.

Beynin ilk kısmı, yamuk cisminin medial Niles'i olan mtb'ye sahip olan kısımdır. Ve bu, tamam, bu yüzden onu transfer pipetine koyduğumda, pipetin ucuna mümkün olduğunca yaklaştırmaya çalışıyorum. Ve beynin bir dilimi var ve ben onu oldukça hızlı bir şekilde bu odaya aktarıyorum, bu odacıkta normal kalsiyum seviyeleri ve aynı zamanda daha yüksek bir sıcaklık olan standart bir kayıt solüsyonu var.

Ve bu, dilimlerin fizyoloji deneylerinden hazır oldukları dilimleme prosedürlerinden sonra toparlanmasını sağlayacaktır. Tamam, bundan sonra, tekrar tekrar aynı şey olacak. Aşağıdaki ekipman, yama sıkıştırmayı yapmak için kullanacağım şeydir.

Sabit kademeli dik bir mikroskobumuz var. Dediğim gibi, sahne sabittir, bu yüzden mikroskop bir manipülatörden onun altına doğru hareket eder. Amplifikatörün baş aşaması olan sahneyi tutmak için bir peruk ve Newman mikro manipülatör kullanıyoruz, heca'dan bir EPC 10 yama kelepçesi amplifikatörü kullanıyoruz.

Ve ayrıca bahsetmem gereken şey, DIC'yi kızılötesi ışıkla kullandığımızdır. Yani burada bir IR kameramız var ve bu yüzden CAE'leri ararken gördüğümüz her şey ekranda görülecek. Yama kelepçesi amplifikatörü, aynı zamanda Heca'dan olan Pulse adı verilen bu yazılım tarafından kontrol edilir ve amplifikatörü ve tüm fizyoloji deneyini kontrol eder.

Sonuçlar bu ekranda çıkacaktır. Tutulan caly büyük bir presinaptik terminaldir ve büyük olduğu için terminale fiziksel olarak yama yapmamıza izin verir. Yani presinaptik kayıtlar alabiliyoruz ve bu benzersiz bir şey, özellikle CNS'de.

Bu, presinaptik olarak aktive edilen kalsiyum kanallarını ölçmemizi sağlar. Ayrıca, kalikse giden siniri uyarmak istiyorsak, aksiyon potansiyeli aktivitesini de ölçebiliriz. Bu laboratuvarda yaptığımız şey, nörotransmitter içeren veziküllerin zarla kaynaşması olan ekzositoz adı verilen bir süreci ölçmek.

Şimdi bu veziküller, ekzositoz adı verilen süreçte zarla birleşir, sinaptik terminale zar eklerler ve bunu kapasitanstaki bir değişiklik olarak ölçebiliriz. Terminale membran eklendiğinde kapasitansta bir artış elde edeceğiz, bu yüzden bugün göstereceğim deneyler kapasitans ölçümleri, membran çıkarıldığında tahmin edilerek. Yani sadece membran eklemeye devam edemezsiniz, elbette bazılarını çıkarmanız gerekir.

Bu işleme endositoz veya zar alımı denir. Bunu da ölçebiliriz ve bu, kapasitans seviyesinde bir azalma olarak ölçülecek ve bunun örneklerini daha sonra göstereceğiz. Şimdi bunun yapmamıza izin verdiği şey, kalsiyum kanal aktivitesini izlemek ve ayrıca ekzositoz ve endositozda yer alan bazı proteinleri izlemek ve bunları incelemektir.

Ekzo veya endositozda yer alan proteinleri bloke etmek için peptitler gibi şeyler koyabiliriz. Aynı şeyi yapan toksinleri de kullanabiliriz. Terminale gelen kalsiyum miktarlarını da ayarlayabiliriz, böylece ekzositoz sürecini, nörotransmiterin salınımını ve bu olayı takip eden zarın alımını gerçekten inceleyebiliriz.

Bu, hücre içi kayıt solüsyonumuzu içeren tüptür. Önceden hazırlıyoruz ve sonra donduruyoruz ve yeni bir çözelti yapmak zorunda kalmadan önce genellikle birkaç hafta ila bir ay arasında kullanabiliriz. Yine, kayıtlarımızı yapmadan hemen önce düşündük ve her zaman tüpünüze girecek belirli miktarda toz parçacıkları veya başka tür kalıntılar alacaksınız.

İki şeyden birini yapabilirsiniz. Çözeltiyi çıkarıp filtreleyebilir ya da bir veya iki dakika döndürebilir ve ardından çözeltiyi çekerek içinde kalıntı ve diğer malzemeleri olacak bir alt kısım bırakabilirsiniz. Bu yüzden onu döndürmeyi tercih ediyorum ve bunu hemen şimdi yapacağım.

İşte bu bizim hücre içi solüsyonumuzu içeren tüp. Çözüldü. Küçük bir santrifüjde yaklaşık iki ila üç dakika döndüreceğiz ve bu, çözeltiden herhangi bir büyük toz parçacığını çıkarmak için yeterli olmalı.

Şimdi sadece üst kısmını, az önce döndürdüğümüz solüsyonu, çalkalamamaya dikkat ederek, temiz bir tüpe aktararak çekiyorum ve yaklaşık %90'ını çekiyorum. Bir daha yapmamaya çalışıyorum, o son parçayı alıyorum. Bu yüzden tam orada duracağım.

Bunu deney sırasında güzel ve soğuk kalması için hemen buza koydum. Bu çok önemli. Bu, bu bizim pipetlerimizden biri.

Bunu hücre içi kayıtlar için kullanıyoruz. Kalın duvarlı delikli silika cam, iki milimetre dış çap, 1.16 milimetre iç çap. İlk olarak, yaptığımız şey pipeti geri doldurmak.

Bu yüzden emme uyguluyoruz, pipeti kayıt solüsyonuna koyuyoruz ve pipetin çok, çok ucunu doldurmaya çalışmak için emme uyguluyoruz, aksi takdirde başka bir şekilde doldurmayacak. Bunu yaptıktan sonra, bir kılcal boru alıyoruz ve elektrotun geri kalanını sadece pipetinizin arkasını alarak dolduruyoruz. Bu standart bir fizyoloji tekniğidir ve kelimenin tam anlamıyla onu sallar.

Pipetin ucunu kırma tehlikesiyle karşı karşıya kalırsınız, ancak bunu yapmazsanız, genellikle hava kabarcıkları olur. Tamam, şimdi onu yama tesisi amplifikatörünün baş aşamasına bağlı olan pipet tutucumuza takıyoruz. Orada gümüş bir klorür teli var.

Gümüş klorür teli, hücre içi çözelti ile temas eder ve bu, presinaptik terminaldeki elektriksel Aktiviteyi ölçmemizi sağlar. Yaptığımız şey, içinde çok fazla CAE bulunan dilimi bulmak. Yüksek yoğunluklu CAE istiyoruz.

İşte bu, yamuk cisminin medial çekirdeğini arıyoruz, bu MNTB, ve işte burada, kaly'yi oluşturan terminal, ya da kaliks uygulaması olan, nasıl bulunur. Ve böylece dilimi taramaya başlıyoruz. Örneğin, yüzeyden biraz daha derin bir kaliks var ve üzerine yama yapacak pek bir şey yok, bu yüzden üzerimizde taramaya devam ediyoruz.

İşte bu bizim için aradığımız bir kaliks. Yaptığım şey, pipetin gideceği yer olan ekranda iki işaret. Ve gördüğünüz gibi, pipet iss'in peşinden gideceğim kaliks parçası aşağı inecek.

Kalikse karşı itmesi için pozitif basınç uygulayacağım ve sonra pozitif basıncı azaltacağım. Kaliks daha sonra pipete doğru itecek ve bu noktada çok nazik bir emme uyguluyorum ve zarı emmeye ve itmeye veya zarın pipet ucuna yapışmasını sağlamaya çalışıyorum. Tamam, pozitif baskıyı hafifletti.

Ve şimdi emme uygulayacağım. İşte burada profesyoneliz, beş milivoltluk bir darbe uyguluyoruz, ya da aslında dört milivoltluk bir darbe. Tamam, bu kadar. Tamam.

Şimdi membran potansiyelini eksi 80'e düşürüyoruz, hızlı geçici patlamayı iptal ediyoruz. Şimdi tüm hücreye gideceğiz. Nazik emiş uygulayacağım ve toptan gitmeye çalışacağım.

Bu şarj geçişleri, onun, pipetin ve hücrenin artık sürekli olduğunu, toptan bir kayda sahip olduğunu gösterir. Bu da başka bir güzel çekim. Yani oradaki daha açık kırmızı, kapasitans iziydi ve gördüğünüz gibi ani bir sıçrama oldu Ve sonra azaldı.

Tamam, size kaliks destekli presinaptik terminalden kayıt almak için temel teknikleri gösterdim. Yamuk cisminin medial çekirdeğini içeren dilimlerin nasıl üretileceğini size gösterdim. Kalikslerin tutulduğu yer

Ve size dilimlere bakma tekniklerini gösterdim. Dilimlerin her birini gözden geçireceksiniz, yüzeyde en fazla sayıda kaly bulunan dilimi arayacaksınız. Daha sonra bulabileceğiniz en büyük kaly zarını arayacak ve üzerine kelepçe kaydı yapıştıracaksınız.

Ayrıca size yama kelepçesi kayıt tekniklerini de gösterdim ve bunlar standart yama kelepçesi kayıt teknikleridir.