Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

Bu prosedürde, dalak boyunca parazit geçişinin dinamiklerini değerlendirmek için Kantitatif intravital mikroskopi yaklaşımı gösteriyoruz. Bir kemirgen sıtma modelinde, GFP transgenik parazitleri ile enfekte olmuş fareler, dalak ven kanülasyonunun intravital mikroskopisi için hazırlanır, intravital boyaların enjeksiyonuna izin verir. Deney sırasında, floresan hücreler dalağın farklı bölgelerinde hareket eden görüntülerdir.

Kırmızı pulpanın üç boyutlu yavaş bölmesindeki parazit hareketliliğini tanımlamak ve damar kan akışını hesaplamak için mitolojiyi sunuyoruz. Bu parametreler iki PULE suşunun dalak dinamiklerini karşılaştırmak için kullanıldı. Herkese merhaba.

Benim adım Nando El Portillo ve laboratuvarımdaki ana araştırma sorularından biri, dalağın sıtmadaki rolünü anlamaya çalışmak. S splenomegali bu hastalığın dönüm noktalarından biridir, ancak teknik ve etik sorunlar nedeniyle bu organın çalışmalarını ele almaya çalışmak çok zordur. Bunu yapmak için, bu parazitin dinamik geçişini görmemize ve bu fenomeni ölçmemize izin veren teknolojileri etkinleştirdik.

Lorena ve MI'nın bu protokollerde açıklayacağı şey budur. Bu araştırma kısmen Almanya'daki Hamburg Üniversitesi'nden Dr.Ler ve burada hastane kliniğinde Dr.Maria Kbo gruplarıyla işbirliği içinde yürütülmektedir ve bulunan fion Cellex ve bakanlık CIA'nın genel finansmanını almıştır. Espanol'de enfeksiyon, %10 parazit oranında ölümcül veya ölümcül olmayan GFP parazitleri ile enfekte olmuş Donor M'den başlatılır. Paraziti kontrol etmek için, fare kuyruğu damarından küçük bir damla kan alın ve mikroskopta uzatın.

GIM'lerle bir chole metrik boyamayı kaydırın. Bir çözelti, kuruduktan sonra enfekte olmuş kırmızı kan hücrelerinin görselleştirilmesine izin verecek, kan yaymasını Metanol ile iki dakika sabitleyecek, GIM'lere bir çözelti uygulayacak ve 20 dakika inkübe edecektir. Slaytı mevcut musluk suyuyla yıkayın ve yüz x yağ içeren bir ışık mikroskobu kullanarak toplam RBC'ler üzerindeki pbc'lerin yüzdesini kuru bir şekilde numaralandırın. Nesnel.

PBS'de seyreltilmiş donör farelerin kuyruk kanından elde edilen öldürücü veya öldürücü olmayan parazitlerle fareleri enfekte edin. Enfeksiyondan sonraki üçüncü günde% 1'lik bir periferik parazite ulaşmak için fare başına yarım milyon parazit enjekte etmek için dozu ayarlayın ve İntraperitoneal enjekte edin. Alternatif olarak, FITC etiketli RBC'ler kontrolde kullanılabilir.

Hayvanlar bir fareden bir mililitre arteriyel kan toplar ve peleti FITC çözeltisinde EDTA re span içeren PBS'de santrifüjleme ile yıkar ve hafif çalkalama ile karanlıkta iki saat inkübe eder. Bu süreden sonra, süpernatanı santrifüjleme ile çıkarın ve iyice yıkayın. Periferik dolaşımda ortalama% 1 olacak şekilde bir kontrol faresine enjekte edin ve in vivo deneylere devam edin.

Merhaba, ben mija. Dalağı in vivo olarak görüntülemek için, dalağı açıkça bu teknikte ortaya çıkarmak için hayvanın küçük bir sinerjisini gerçekleştirmemiz gerekiyor. Bunu, teşekkür etmek istediğim işçi Heisler'in laboratuvarında Stephanie GR'den öğrendim ve şimdi size nasıl ilerleyeceğinizi göstereceğim.

Enfekte miyozun görüntülenmesi: Enfeksiyon sonrası üçüncü günde, parat her iki suşta% 1 olduğunda gerçekleştirilir. İşlem boyunca fareyi uyuşturulmuş ve düzenlenmiş sıcaklıkta tutun. Gözleri hidrasyondan koruyun ve maddelerin intravenöz uygulamasını kolaylaştırmak için devam etmeden önce ayak pedine ping atarak farenin tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın.

Deney sırasında, kanülü oluşturmak için fare kuyruğu damarını kanüle edin. Tüpün bir ucuna küçük bir iğne ve diğer ucuna aplikatörünü yerleştirin. Kanülü fizyolojik tuzlu su çıkarıcı kabarcıklarla doldurun ve çözeltinin kanülden doğru şekilde akıp akmadığını kontrol edin.

Kuyruğun yan damarı temiz kanüle edilecektir. Kuyruğun tabanında yumuşak bir daralma yaparak görünürlüğünü artırın. Kanülün ucunu damarın içine sokun.

Kanın görünümü, iğnenin iyi konumlandırıldığını gösterecektir. Değilse, kanülasyonu damarın yukarısına doğru tekrarlayın, ardından kanülü yapıştırıcı ve bant kullanarak kuyruğa sabitleyin. Dalağın alt kısmını, hayvanın sol sırt tarafındaki deri ve kas sisteminde küçük bir kesi ile ortaya çıkarın.

Daha az nefes hareketinin gözlendiği bir dalak yerleştirin ve fare tüylerinden temiz ve nemli tutmak için açıkta kalan yüzeye PBS uygulayın. Görselleştirmeye izin vermek için dalağı bir kapak uykusu ile kapatın. Merhaba, benim adım Lorena.

Gösterilen protokol, PULI parazitlerinin dalak boyunca hareketini görselleştirmemize izin verecektir. Bu, GFP transgenik parazitler sayesinde mümkün olmuştur. Lütfen Drexel Üniversitesi'nden James Burnes tarafından bağış yapın.

Floresan parazitlerin görüntüleme hareketi, ölümcül ve ölümcül olmayan suşlar arasındaki davranışta fark olup olmadığını bilmemizi sağlayacaktır. Vidal mikroskobu deneyleri Sıcaklık kontrollü bir inkübasyon sistemi ve 63 x gliserol objektifi ile donatılmış bir Leica multifoton mikroskobunda gerçekleştirildi. Hayvanı, objektife bakacak şekilde bir örtü uyku dalağı ile mikroskobun sahnesine yerleştirin. Başlangıçta.

Dalağın daha düşük büyütmelerde görselleştirilmesi, organın mikro dolaşım yapısının genel bir görünümünü sağlayacaktır. Otofloresan doku kullanarak dalağı odaklayın, dalağın farklı bölgelerinden geçen GFP parazitleri gözlenir. Merhaba, benim adım Barselona Üniversitesi Bilimsel ve Teknolojik Merkezlerden Maria Albo ve dalağın intravital görüntülemesini yapacağız.

Enfekte kırmızı kan hücrelerinin kan akışını ve hareketliliğini incelemek için, organın hareketini önlemek için çok yararlı olan yüksek hızlı görüntülemeye izin veren rezonans taraması ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanacağız. Bu, görüş aralığını seçmeye izin veren spektral bir mikroskoptur. Çok hızlı görüntü elde etmek için, iki floresein, etiketleme ve yansımanın aynı anda alınmasını sağlayacağız.

Dalak mikrovaskülatürünü kanıtlamak için RBC, yansıma, kontrast ve Vidal boyalarının yardımıyla görüntülenecek farklı bölgeleri seçin. Şimdi, kırmızı hamurun üç Boyutlu ağ örgüsündeki parazit hareketini takip etmek için Vidal mikroskobu ve görüntü J yazılımını kullanarak damar kan akışındaki parazit hareketliliğinin nasıl ölçüleceğini açıklayacağız. Yüksek hızlı tarama modunu kullanarak beş Z derinliğinde görüntüler elde edin.

Tek bir floresan hücrenin izlenmesini kolaylaştırmak için görüntü yığınlarını Z kodlu renkli filmlere dönüştürün. Ayrıntılı bilgi metinde sağlanır, X, Y, Z ve T koordinatlarını kullanarak her videoda Derinlik'te zaman içinde farklı parçacıkları izleyin, yönlülük, ortalama hız ve kalma süresi gibi hareketlilik parametreleri hesaplanabilir ve Gerinim popülasyonları arasında karşılaştırmalı analiz sağlamak için dağılım haritaları olarak temsil edilebilir. Dalaktaki vasküler akış, dekstrin gibi destekleyici tabloda tarif edilen birkaç floresan molekülünün sistemik enjeksiyonu ile görüntülenebilir.

Ve endojen eritrosit yansıma kontrastını kullanarak, damarları lazer tarama yönünde yatay olarak ayarlayarak ve gelişmiş Çizgi ortalamasını kullanarak merkez hattı kan akışını tarayın. Bu görüntülerde, hareketli hücrelerden kaynaklanan çizgiler, kan akışını hesaplamak, farklı çaplardaki damarların görüntülerini almak ve dalgalanmaları telafi etmek için kalp döngüsü boyunca kullanılacaktır. Dalak, sıtma araştırmalarında uzun zamandır bir kara kutu olarak kabul ediliyor ve burada, bu organdaki parazit enfeksiyonu ve kan akışının dinamikleri hakkında fikir edinmek için kantitatif bir intravital mikroskopi yaklaşımı geliştirdik ve enfekte kırmızı kan hücrelerinin dalağa in vivo yapışması gibi önemli biyolojik soruları ele almamızı sağladık.

Teşekkür ederim ve.