Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, laboratuvar hayvanlarında adventif enfeksiyöz ajanlara karşı antikorları tespit etmektir. Bu, test serumunun antijen kaplı mikroküreler ile inkübe edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, serum, herhangi bir antijen antikor bağışıklık kompleksini tespit eden biyotinile etiketli türe özgü bir anti immünoglobulin ile inkübe edilir.

Daha sonra, multipleks floresan, immünoassay net skoru, floresan numune değerlerine dayalı olarak laboratuvar kemirgenlerinde yaygın ajanlar için pozitif veya negatif antikor durumunu gösteren herhangi bir biyotinile immünoglobulin sonucunu tespit etmek için FICO eryn Fluor force solüsyonu eklenmiş bir streptavidin eklenir. Bu tekniği kullanmanın Eliza gibi mevcut yönteme göre en büyük avantajı, MFIA'nın bir multipleks testi olmasıdır. Bu, bir araştırmacının tek bir testte yüze kadar farklı testi taramasını sağlar.

Bu teknik, tek bir testten üretilen bilgi miktarını artırırken, mevcut yöntemlerde kullanılan serum bölgelerinin ve tek kullanımlık malzemelerin miktarını azaltır. Bu yöntemi kullanma fikri ilk olarak, birden fazla ajan için çok sayıda Sera örneğini test ederken ve test süresinin yanı sıra iş gücünü de azaltmak istediğimizde aklımıza geldi. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan kıdemli bir teknoloji uzmanı olan Donna Cohen olacak Başlamak için, multipleks, floresan, immünoassay veya MFIA prosedürü için gerekli iki tamponu hazır bulundurun.

Birincisi, Charles River'dan temin edilebilen ve tahlil yıkama tamponu için spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak için tescilli bloke edici maddeler içeren birincil bir seyrelticidir. Partikülleri gidermek için %1 BSA pH 7.4 içeren bir PBS çözeltisi hazırlayın. Tamponu 0,2 mikronluk bir şişe üst ünitesinden süzün, tahlil yıkama tamponu kullanarak steril etiketli kaplara yerleştirin.

Aşağıdaki malzemelerin ve tek kullanımlık malzemelerin örneklerini hazırlamak için test serumu inkübasyon aşaması sırasında oluşan antijen antikor komplekslerini etiketlemek için kullanılacak olan iki x konsantrasyonda biyotinile antis türü, IGG veya BAG ve strep AVID ve FICO erything veya SPE hazırlayın ve protein seyreltmesi için 96 iyi düşük protein bağlayıcı mikrotitre plakası monte edildi. Kan örneklerini topladıktan ve serumu izole ettikten sonra, uygun ve homojen kuyu tahliyesi ön ıslatmasını sağlamak için numuneleri 96 oyuklu bir mikrotitre plakasında birincil seyrelticide seyreltmeden önce serumu kısa bir süre vorteksleyin. Tahlil yıkama tamponlu 96 kuyulu test plakasının her oyu, tahlil boyunca çözeltiyi yavaşça aspire eder.

Boncuk toplanmasını önlemek ve boncukların filtre membranına sıkıştırılmasını önlemek için aspirasyon beş ila 10 saniye sürmelidir, her ikisi de testin sonunda okuma sürelerini yavaşlatabilir. Test plakasının alt tarafını kağıt havluyla lekeleyerek sıvı tahliyesinin durduğunu doğrulayın. İnkübasyon sırasında kuyucukların dışarı atılmasını önlemek için her yıkama adımından sonra test plakasını lekelemek önemlidir.

Boncukları hazırlamak için, stok bağlantılı boncuk süspansiyonunu girdaplayarak başlayın. Sonra onları bir banyoda kısaca sonikleştirin. Daha uzun okuma sürelerine neden olabilecek toplu boncuk kümelerini önlemek için boncukları düzgün bir şekilde yeniden askıya almak çok önemlidir.

Ardından, 20 x stok süspansiyonunu birincil seyrelticide iki x çalışan boncuk çözeltisine dağıtın. Daha sonra, önceden ıslatılmış test plakasının her bir tahlil kuyucuğuna iki x boncuk süspansiyonunun 50 mikrolitresini dağıtın. Her iki x testinden 50 mikrolitre pipetleyin ve serumu önceden tanımlanmış bir plaka haritasına göre test plakasına kontrol edin.

Kapağı plakaya sabitleyin. Tahlilin başarısını önleyebilecek çözeltilerin buharlaşmasını önlemek için alüminyum folyo ile örtün ve test plakasını oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 60 dakika inkübe edin. Tüm inkübasyon adımları sırasında test plakasını plaka kapağıyla kapalı tutun.

Ek olarak, hız sarsıntısı 400'den büyük, ancak 700 RPM'den az olmalıdır, böylece boncuklar, serum antikorlarının birleştirilmiş antijenlerin tüm yüzeylerine erişmesine izin vermek için süspansiyonda kalır. Plakayı, boncukların BAG ve SPE ile sıralı inkübasyonlarında yıkadıktan sonra, numuneleri tekrar yıkayın. Daha sonra 125 mikrolitre tahlil ekleyerek boncukları yeniden süspanse edin, yıkayın, tamponlayın ve plakayı okumak için iki dakika çalkalayın.

Boncukları askıya aldıktan sonra 10 dakika içinde tahlil okuyucusuna yerleştirin, boncuklar birer birer iki lazere maruz kaldıkları bir dedektörden geçer. Bir lazer, boncuk renk setini tanımlayan iç boyaları uyarır, diğeri ise FICO erything reporter boyasını uyarır. Önceden belirlenmiş sayıda boncuk için FICO eritici floresan yoğunluğu, seçilen boncuk panelinin test kuyucuklarındaki boncuk profiliyle eşleştiğini doğrulamak için FM FI ilk kuyuyu okuduğunda rapor edilir.

Protokol ekranında belirlenen boncuk bölgesinin dışına çıkan boncuklar varsa, yanlış bir profil seçimi yapılmıştır. Düzgün bir şekilde yeniden askıya alınan boncuklar, tahlil okuyucu yazılımında belirtildiği gibi belirtilen bölgelerini dolduracaktır. Boncuklar toplanırsa, bölgelerini yavaş bir oranda doldururlar.

Test plakasını okuyucudan çıkarabilir ve boncukları ayırmak için kuyuları manuel olarak yeniden askıya alabilirsiniz. Test plakasını okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipetleyici kullanarak her bir kuyucuğu üç ila dört kez üçlü hıza getirin. Ardından test plakasını okuyucuya geri koyun ve sonuçları incelemeye devam edin.

Yetersiz boncuk sayıları veya düşen IgG anti IgG boncuk skorları gibi hataları rapor edin ve bu numuneler için testi tekrarlayın. Verileri Excel'e aktardıktan ve net MFI'yi hesapladıktan sonra, yüksek aralıklı bağışıklık serumu hariç test çalıştırma testi kontrollerinden herhangi birinin olup olmadığını belirleyin. Başarısız kontroller kabul edilemez ve tahlil tekrarlanmalıdır.

Bu tablo, tipik bir tahlil plakasından alınan test serumu ve tahlil kontrolleri için verileri temsil eder. Tüm IgG kontrolleri geçildi mi? Bu oyun için test sonuçları, turuncu kuyularda görüldüğü gibi çok sayıda doku reaktif ve IgG kontrol örneğinin başarısız olduğunu göstermektedir.

A1C bir ve F1, TC skorunun parantez içinde temsil edildiği bir TC doku reaktif başarısızlığını gösterir, Wells B bir ve E bir, iki tip IgG iç kontrol arızasını, yetersiz test antikoru veya test reaktiflerini, sırasıyla BAG veya SPE'yi gösterir. Test plakası sonuçları, yalnızca sistem uygunluk kontrolü ve serum kontrolü burada gösterilen kabul kriterlerini karşılıyorsa yorumlanır. Türe özgü anti test serumu immünoglobulin ile kaplanmış mikroküreler, yetersiz numunenin çok yüksek eklenmesi, numune seyreltmesi, yanlış tür veya immün yetmezliği olan bir konakçıdan serum testi nedeniyle başarısız skorlar gösterebilir.

Test oyun tahlil kontrol sonuçları tatmin ediciyse, bireysel tahlil puanları aşağıdakilere göre sınıflandırılır. Bu prosedürü takiben, ilk beklenmedik veya pozitif bulguları doğrulamak için Eliza, IFA ve/veya Western blot gibi ek yöntemler kullanmalıyız. Herhangi bir hayvan yönetimi kararı vermeden önce bu sonuçları doğrulamak çok önemlidir.

Bu, aynı numune üzerinde farklı metodolojiler veya aynı koloniden ek numuneler kullanılarak yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, multipleks floro, metrik immünoassay işlemini nasıl yapacağınızı ve tesisinizde elde edilen sonuçları nasıl yorumlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu, her bir test örneğinden daha fazla bilgi toplarken işçiliği azaltmanıza olanak tanır.