Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, laboratuvar hayvanlarındaki dış kaynaklı enfeksiyöz ajanlara karşı gelişen antikorları tespit etmektir. Bu işlem, test serumunun antijen kaplı mikrokürelerle inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından serum, herhangi bir antijen-antikor immün kompleksini tespit eden, biyotinlenmiş etiketli türe özgü bir anti-immünoglobulin ile inkübe edilir.

Ardından, biyotinlenmiş immünoglobulinleri saptamak amacıyla streptavidin işaretli FICO eryn Fluor force çözeltisi eklenir; böylece laboratuvar kemirgenlerindeki yaygın ajanlar için multiplex floresan, immünassay net skoru ve floresan örnek değerlerine dayalı olarak pozitif veya negatif antikor durumunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniği Eliza gibi mevcut yöntemlere tercih etmenin temel avantajı, MFIA'nın bir multiplex assay olmasıdır. Bu durum, araştırmacının tek bir testte yüze kadar farklı analizi tarayabilmesine olanak tanır.

Bu teknik, mevcut yöntemlerde kullanılan serum miktarlarını ve tek kullanımlık malzemeleri azaltırken, tek bir testten elde edilen bilgi miktarını artırmaktadır. Bu yöntemi kullanma fikri ilk olarak, çok sayıda serum örneğini birden fazla ajan için test ederken iş yükünü ve test süresini azaltmak istediğimizde ortaya çıktı. Prosedürü laboratuvarımızın kıdemli teknoloğu Donna Cohen uygulamalı olarak gösterecek. Başlamak için, multipleks floresan immünassay (MFIA) prosedürü için gerekli olan iki tampon çözeltiyi hazır bulundurun.

Birincisi, Charles River'dan temin edilebilen ve analiz yıkama tamponu için spesifik olmayan etkileşimleri azaltmaya yönelik tescilli bloklama ajanları içeren bir birincil dilüenttir. Partikülleri uzaklaştırmak için %1 BSA pH 7,4 içeren bir PBS çözeltisi hazırlayın. Tamponu, analiz yıkama tamponu kullanarak 0,2 mikronluk bir şişe üstü filtre ünitesi aracılığıyla steril etiketli kaplara süzün.

Test serum inkübasyon adımında oluşan antijen-antikor komplekslerini işaretlemek için kullanılacak olan biyotinize anti-tür IGG veya BAG ve strep AVID ve FICO erything veya SPE'den iki kat konsantrasyonlarda hazırlayın; bunun için aşağıdaki malzemeleri ve sarf malzemelerini hazırlayın: çok ve tek kanallı mikropipetler ve uçları ile protein dilüsyonu için 96 kuyucuklu düşük protein bağlayıcı mikrotitre plakaları. Kan örnekleri toplandıktan ve serum izole edildikten sonra, kuyucukların düzgün ve homojen bir şekilde doldurulmasını sağlamak için, örnekleri 96 kuyucuklu mikrotitre plakasındaki birincil dilüent içinde dilüye etmeden önce serumu kısa süre vorteksleyin. 96 kuyucuklu test plakasının her kuyucuğunu analiz yıkama tamponu ile önceden ıslatın ve analiz boyunca solüsyonu yavaşça aspire edin.

Boncukların topaklanmasını ve filtre membranına sıkışmasını önlemek için aspirasyon beş ila 10 saniye sürmelidir; bu durumların her ikisi de assay sonundaki okuma sürelerini yavaşlatabilir. Test plakasının alt kısmını kağıt havluyla kurulayarak sıvı drenajının durduğunu doğrulayın. İnkübasyon sırasında kuyucukların içindeki sıvının emilerek dışarı çıkmasını önlemek için her yıkama adımından sonra test plakasını kurulamak önemlidir.

Boncukları hazırlamak için öncelikle stok eşleşmiş boncuk süspansiyonunu vorteksleyerek başlayın. Ardından, boncukları kısa bir süre banyoda sonike edin. Okuma sürelerinin uzamasına neden olabilecek agregasyon oluşmuş boncuk kümelerini önlemek için boncukların uygun şekilde yeniden süspanse edilmesi kritik öneme sahiptir.

Ardından, 20x stok süspansiyonu primer dilüent içindeki 2x çalışma boncuk çözeltisine dağıtın. Sonra, 2x boncuk süspansiyonundan 50 µL'yi önceden ıslatılmış test plağının her bir analiz kuyucuğuna aktarın. Önceden belirlenmiş bir plak haritasına göre, her bir 2x test ve kontrol serumundan 50 µL'yi test plağına pipetleyin.

Kapağı plağa sabitleyin. Alüminyum folyo ile örtün ve çözeltilerin buharlaşarak deneyin başarısını engellemesini önlemek için test plağını oda sıcaklığında, orbital sarsıcılıda 60 dakika inkübe edin. Tüm inkübasyon adımları boyunca test plağını plak kapağı ile örtülü tutun.

Ek olarak, serum antikorlarının kenetli antijenlerin tüm yüzeylerine erişebilmesi için boncukların süspansiyon halinde kalmasını sağlamak amacıyla çalkalama hızı 400 RPM'den büyük, ancak 700 RPM'den küçük olmalıdır. Plaka, boncukların BAG ve SPE ile ardışık inkübasyonlarıyla yıkandıktan sonra örnekleri tekrar yıkayın. Ardından, plakayı okumak için 125 µL assay, yıkama tamponu ekleyerek boncukları yeniden süspanse edin ve iki dakika boyunca çalkalayın.

Boncuklar resüspanse edildikten sonraki 10 dakika içinde örneği analiz okuyucuya yerleştirin; boncuklar, iki lazere maruz kaldıkları bir dedektörden tek tek geçerler. Bir lazer, boncukların renk setini tanımlayan iç boyaları uyarırken, diğeri FICO erything raporlayıcı boyasını uyarır. Önceden belirlenmiş sayıda boncuk için FICO erything floresan yoğunluğu FM FI olarak raporlanır; seçilen boncuk panelinin test kuyucuklarındaki boncuk profiliyle eşleştiğini doğrulamak için ilk kuyucuğu okuyun.

Protokol ekranındaki belirlenmiş boncuk bölgesinin dışına düşen boncuklar varsa, yanlış profil seçimi yapılmış demektir. Doğru şekilde resüspande edilmiş boncuklar, analiz okuyucu yazılımında belirtildiği gibi belirlenen bölgelerini dolduracaktır. Boncuklar agregasyon göstermişse, bölgelerini yavaş bir hızda dolduracaklardır.

Test plakasını okuyucudan çıkarabilir ve boncukları ayırmak için kuyucukları manuel olarak yeniden süspanse edebilirsiniz. Test plakasını okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğu üç ila dört kez pipetleyin. Ardından test plakasını okuyucuya geri yerleştirin ve sonuçları incelemeye devam edin.

Yetersiz boncuk sayısı veya düşen IgG anti IgG boncuk skorları gibi hataları raporlayın ve bu örnekler için analizi tekrarlayın. Verileri Excel'e aktarıp net MFI değerlerini hesapladıktan sonra, yüksek aralıklı immün serum hariç, test paneli analiz kontrollerinden herhangi birinin başarısız olup olmadığını belirleyin. Başarısız olan tüm kontroller kabul edilemezdir ve analiz tekrarlanmalıdır.

Bu tablo, tipik bir analiz plağından alınan test serumu ve analiz kontrolü verilerini temsil etmektedir. Tüm IgG kontrolleri başarıyla geçmiştir. Bu plağa ait test sonuçları, turuncu kuyucuklarda görüldüğü üzere, çok sayıda doku reaktif ve IgG kontrol örneğinin başarısız olduğunu göstermektedir.

A1C 1 ve F1, TC skorunun parantez içinde gösterildiği bir TC doku reaktif hatasını belirtirken; Wells B 1 ve E 1, sırasıyla yetersiz test antikoru veya test reaktifleri, BAG veya SPE şeklindeki iki tip IgG internal kontrol hatasını örneklendirmektedir. Test plakası sonuçları, yalnızca sistem uygunluk kontrolü ve serum kontrolü burada gösterilen kabul kriterlerini karşıladığında yorumlanır. Tür spesifik anti test serum immünoglobulini ile kaplanmış mikroküreler; yetersiz örnek eklenmesi, çok yüksek örnek dilüsyonu, yanlış tür veya immünodefiyent bir konakçıdan alınan test serumu nedeniyle başarısız skorlar gösterebilir.

Test deneme analiz kontrol sonuçları tatmin ediciyse, bireysel analiz skorları aşağıdakilere göre sınıflandırılır. Bu prosedürün ardından, başlangıçtaki beklenmedik veya pozitif bulguları doğrulamak için ELISA, IFA ve/veya Western blot gibi ek yöntemler kullanmalıyız. Herhangi bir hayvan yönetimi kararı vermeden önce bu sonuçların doğrulanması kritik önem taşımaktadır.

Bu işlem, aynı örnek üzerinde farklı metodolojiler kullanarak veya aynı koloniden alınan ek örnekler ile gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, multipleks florometrik immünolojik testi nasıl uygulayacağınız ve kendi tesisinizde elde ettiğiniz sonuçları nasıl yorumlayacağınız konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu, her bir test örneği kuyucuğundan daha fazla bilgi toplarken iş gücünü azaltmanıza olanak sağlayacaktır.