Boya Etiketli Manyetik Mikroküreler Kullanılarak Çoklanmış Kantitatif Bakteri Tespiti

Dahili olarak spektral olarak farklı floroforlarla boyanmış manyetik polistiren mikrokürelerin bir karışımını içeren bir tahlil plakası alın.

Her mikroküre seti, farklı patojenik bakterilere özgü yakalama antikorlarına kovalent olarak bağlanır.

Isıyla öldürülmüş bir patojenik bakteri karışımı ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Yakalama antikorları, hedef bakteriyel antijenleri bağlayarak mikroküre-bakteri kompleksleri oluşturur.

Kompleksleri çökeltmek için manyetik bir ayırıcı kullanın. Bağlanmamış bakterileri atın ve tampon ile yıkayın.

Özellikle mikroküre bağlı bakterilere bağlanan tampon ve biyotinile tespit antikorları ekleyin.

Kompleksleri manyetik olarak ayırın ve tampon ile yıkayın.

Tampondaki kompleksleri yeniden askıya alın. Biyotinile edilmiş tespit antikorlarına bağlanan floroforla bağlanmış streptavidin içeren pipet raportör molekülleri.

Kompleksleri manyetik olarak ayırın ve yıkayın. Arabellekte yeniden askıya alın.

Akış tabanlı analiz sırasında, ilk lazer mikrokürenin iç floroforlarını uyarır, benzersiz spektral imzalar üretir ve benzersiz mikro küre kümelerini tanımlar.

İkinci lazer, mikroküreler üzerindeki bakterilere bağlı florofor raportörlerini uyarır, çeşitli mikroküre setlerindeki bakterileri ölçer ve çoğullanmış kantitatif bakteri tespitini sağlar.

Numune yakalama için, elli mikrolitre mikroküre veya antikorları yakalamak için konjuge boncuklar 96 oyuklu bir plakaya ekleyerek başlayın. Daha sonra, elli mikrolitre patojenik bakteri ve ardından elli mikrolitre PBS-TBN'yi arka plan kuyucuklarına ekleyin.

Plakayı bir folyo plaka contası ile örtün ve bir saat boyunca sekiz yüz rpm'de bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Daha sonra, boncukları ayırmak için plakayı 1 dakika boyunca manyetik ayırıcı üzerine yerleştirin. Plakayı manyetik plaka ayırıcı üzerinde tutarken kalan çözeltiyi boşaltın. Ardından, laboratuvar kağıt havluları üzerinde üç ila dört kez kuruması için hafifçe vurun. Kuyuları PBS-TBN ile iki kez iyice yıkayın.

Numune tespiti için, kuyucuklara elli mikrolitre tahlil tamponu ve ardından mililitre başına dört mikrogram konsantrasyonda elli mikrolitre biyotinile tespit antikoru ekleyin.

Bakteriler ve tespit antikorları arasında verimli bir etkileşim sağlamak için plakayı karanlıkta bir saat inkübe edin. Ardından, manyetik ayırıcıyı kullanarak boncukları ayırın ve daha önce gösterildiği gibi boncukları PBS-TBN ile yıkayın.

Boncukları elli mikrolitre tahlil tamponunda yeniden süspanse edin ve elli mikrolitre streptavidin-R-fikoeritrin veya bir floresan raportör molekülü olan SAPE ekleyin. Plakayı bir folyo plaka contası ile örtün ve plaka çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin.

Kuyucuklar yıkandıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre PBS-TBN'de yeniden süspanse edin ve plakayı akış tabanlı analizöre yükleyin.

Uygun yazılımı kullanarak okumaları kaydedin. Her organizma için net medyan floresan yoğunluğu değerleri, numunede bulunan bakteri yükünü belirlemek için standart bir eğri aracılığıyla değerlendirilebilir.