Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar
26 Temmuz 2019
Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.
Multipleks floresan immünohistokimya birden fazla hücre tipini ve konumlarını bozulmamış formalin-sabit parafin gömülü dokuda tanımlar, bu da sadece hücre tanımlaması için değil, hücreden hücremekansal analize de olanak sağlar. Bu manuel tekniğin en büyük avantajı çapraz reaktivite olmadan aynı türün birden fazla antikor kullanımıdır. Bu teknik tümör mikroortamında bağışıklık ve kanser hücrelerinin etkileşimleri içine derinlemesine bir görünüm sağlar.
Bu tekniği ilk kez denerken, yaklaşık 3-4 gün boyama ya da işlem sırasında her adımı tamamen takip edin. Boyama işlemi ve multipleks tasarımı nın daha zayıf bir yöntemi, yaygın ve beklenen tuzakları azaltmak için çok önemlidir. Slaytları ayırarak ve yeniden sudinerek başlayın.
Doku yan ile hibridizasyon fırında onları lay ve bir saat boyunca 60 derece santigrat onları pişirin. Slaytları fırından alın ve dikey bir kaydırakta 5 ila 10 dakika soğumasını bekleyin. Daha sonra slaytları üç kez ksilen ve bir kez %100 etanol, %95 etanol ve %70 etanol ile 10'şar dakika boyunca tedavi etmek için bir slayt boyama seti kullanın.
Slaytrafını deiyonize suyla yıkayın ve daha sonra 30 dakika boyunca nötr arabelleğe aldanarak slaytları düzeltin. İki dakika su ile slaytlar yıkayın ve antijen alma ile devam edin. Slayt rafını pH 6.0 veya pH 9.0 antijen alma tamponu yla dolu ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin.
Kutunun üzerini plastik ambalajla kapatın ve lastik bantla sabitleyin. Kutuyu dönen plakanın kenarına bir inverter donanımlı mikrodalgaya yerleştirin ve slaytları %100 güçte 45 saniye ısıtın ve ardından %20 güçte 15 dakika. Slaytlar microwaving sonra 15-20 dakika soğumasını bekleyin.
Bu arada, antikorlar ve floroforların çalışma çözümlerini hazırlayın. TBST veya 1X PBS 50 mililitre sığır serum albumen granül0 0,5 gram eriterek birincil antikor dilüent hazırlayın. Her birincil antikor çalışma çözeltisini önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltin.
Florofor seyreltici her florofor seyreltmek bir ila 100 konsantrasyonda. Boyama nın son gününde, bir mililitre TBST'ye üç damla DAPI ekleyerek DAPI çalışma çözümünü hazırlayın. Slaytlar soğuduktan sonra mikrodalgadan çıkarın ve plastik ambalajı çıkarın.
İki dakika deiyonize su ile yıkayın ve ardından TBST ile iki dakikalık bir yıkama. Yıkamadan sonra, hassas bir görev sil ve hidrofobik bariyer kalem ile doku dışında iz ile doku etrafında slayt kuru, doku dokunmamaya dikkat veya kurumasını bekleyin. Her slaytı nemlendirici haznesine yerleştirin ve dokuya yaklaşık dört damla bloklama çözeltisi ekleyin.
Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca slaytlar kuluçka ve birincil antikor uygulaması ile devam edin. Kağıt havlu yığınının üzerindeki slaydın yan tarafına dokunarak her slayttan engelleme çözümünün çıkarılmasını ve kalan çözümü kaldırmak için hassas bir görev silme kullanın. Kaydırağı nemlendirilmiş odaya geri yerleştirin, çalışan birincil antikor yaklaşık 200 mikrolitre ekleyin ve bir saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, slaytları tbst'ye iki dakika boyunca batırarak üç kez yıkayın. Her slayttan kalan TBST kapalı Dab ve ikincil antikor yaklaşık üç ila dört damla uygulayın. 10 dakika boyunca nemlendirilmiş odada slaytlar kuluçka.
Slaytları TBST ile tekrar yıkayın ve florofor çalışma çözeltisinin yaklaşık 100 mikrolitresini uygulayın. Slaytları nemli odaya geri verin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. TBST yıkama tekrarlayın ve daha sonra antikorları kaldırmak için el yazması yönergelerine göre slaytlar mikrodalga.
Bu çok günlük boyama işlemi sırasında hatırlanması gereken önemli bir şey microwaving adım sonra durdurma ve antijen alma tampon gecede slaytlar bırakarak, doku ve leke bütünlüğünü sağlamak. Antijen alma solüsyonu ile son antikor uygulamasını çıkarın ve kayma başına iki dakika boyunca TBST ardından deiyonize su ile slaytları yıkayın. Antikor flurophore çiftleri geri kalanı için boyama adımları tekrarlayın ve sonra DAPI uygulaması ile devam edin.
Her slayta yaklaşık 150 mikrolitre çalışan DAPI çözeltisi uygulayın ve nemli haznede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, slaytları TBST ile yaklaşık 30 saniye yıkayın ve kapak fişlerini monte edin. Montaj ortamı kuruduktan sonra, emniyete almak için kapağın dört köşesine açık tırnak cilası uygulayın.
Monopleksi analiz etmek için, mikroskoptaki slaytları, odaklanmak için DAPI kullanarak 250 milisaniyelik pozlama ile görüntüleyin. Lekeli işaretleyicinin floresan yoğunluğuna bakarak her monopleks slaytı değerlendirin ve bu yoğunluğu arka planla karşılaştırın. Lekeli işaretçi yoğunluğu arka plandan en az beş kat daha yüksekse son multipleksteki slayt konumunu kullanın.
Multipleks boyama, her antikor için uygun sırayı seçin ve bir antikor için her florofor atayın. Daha önce açıklandığı gibi multipleks boyama ile devam edin ve primer antikor, florofor veya DAPI yerine antikor dilüent, florofor dilüent ve TBST alır boş bir slayt hazırlamak. Mikroskopüzerindeki çoklayıcıyı görüntülenmeye hazır olduğunuzda, pozlamayı tüm kanallar için 250 milisaniyeye ayarlayın ve odaklanmak için DAPI kullanarak her görüntüyü yakalayın.
Daha sonra her çokluk floresan yanlış renk ve patoloji görünümü ile her belirteç özgüllüğünü teyit edecek değerlendirmek için analiz yazılımı kullanın. Multipleks testin inbaşarısını sağlamak için, her antikor un sırasını belirlemek için monopleks bir test yapılmalıdır. Örneğin, Foxp3 dizinin üçüncü konumundayken, CD3 ile spesifik ve sağlam boyama ve kolokalizasyon gösterilmiştir.
Buna karşılık, Foxp3 ilk konumda olduğunda, Foxp3 nonspesifik boyama oluşur. Kaydırakların çoğunda kırmızının grenli ve verimli alanları bulunur ve bu alanların floresan yoğunluğu düşüktür. Bu tahlilde bir diğer önemli adım hücre tanımlama ve daha fazla analiz için temel olan DEPI karşı boyama vardır.
Çalışma ve çalışmayan DAPI ile görüntüler arasında net bir kontrast görülebilir. Multipleks tarar için, güzel kompozit görüntüler her zaman doğru bir leke yansıtmaz. CD3 görselleştirilmiş ve spesifik boyama gösterirken, CD163'ün patoloji parlak alan görünümü antikorun spesifik olmadığını kanıtlamaktadır.
Optimal multipleks görüntü kompozit görüntüde belirli boyama gösterir ve CD3 ve CD163 özgüllüğü patoloji brightfield görünümü ile doğrulanır. Bu yordamı takiben hücre ile hücre etkileşimlerini daha fazla analiz etmek için kendi kendini fenotipleme ve mekansal analiz hesaplamaları yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların hücrelerin ve bozulmamış dokunun mekansal desenlerini keşfetmelerinin önünü açarak tümör immün mikroçevresini daha iyi anlamamızı sağladı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Multipleks floresan immünohistokimya, formalin sabitlenmiş, parafin gömülü dokularda birden fazla hücre tipinizi görselleştirmenize olanak tanıyan bir tekniktir. Bu yöntem, özellikle tümör mikroçevresinde hücre tanımlamasını ve hücre etkileşimlerinin mekansal analizini kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- İmmünohistokimya
Arka Plan
- Multipleks floresan immünohistokimya, aynı türden birden fazla antikorun kullanılmasını sağlar.
- Bu teknik, antikorlar arasındaki çapraz reaktiviteyi en aza indirir.
- Bağışıklık ve kanser hücre etkileşimlerine ilişkin bilgiler sağlar.
- Boyama sırasında yaygın tuzaklardan kaçınmak için uygun teknik kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Başarılı 7-renk multiplex immünohistokimya için kılavuzlar sunmak.
- Gelişmiş sonuçlar için antikorları ve reaktifleri optimize etmek.
- Dilimlerin hazırlanması ve sorun giderme için ipuçları sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Dokunun dilimlerinin deparafinlendirilmesi ve yeniden hidrasyonu.
- Boyama için birden fazla antikorun uygulanması.
- Boyama işlemi sırasında her adımın sistematik takibi.
- Hataları azaltmak için boyama yöntemlerinin optimizasyonu.
Ana Sonuçlar
- Dokuda birden fazla hücre tipinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Hücreler arasındaki mekansal ilişkilerin daha iyi anlaşılması.
- Bu tekniğin kanser araştırmalarında etkinliğinin gösterilmesi.
- Bu yöntemi kullanan gelecekteki çalışmalar için bir çerçeve sağlanması.
Sonuçlar
- Multipleks floresan immünohistokimya, karmaşık doku etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Kurulmuş kılavuzları takip etmek, sonuçların güvenilirliğini artırabilir.
- Bu teknik, kanser ve immünoloji araştırmalarında yeni yollar açar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multiplex fluorescent immunohistochemistry (mfIHC) enables high-plex spatial phenotyping in FFPE tissue, addressing a critical gap in tumor microenvironment analysis for oncology drug development. By preserving tissue architecture while detecting multiple epitopes, it supports mechanistic de-risking of immuno-oncology targets and informs predictive biomarker strategies. This capability enhances target validation confidence and reduces late-stage attrition due to misunderstood spatial biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping immune and cancer cell co-localization in intact tissue.
- Operational Value: Provides reproducible spatial readouts that clarify pathway engagement and target specificity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with favorable microenvironmental modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, multiplex-ready FFPE sections for downstream antibody and fluorophore optimization.
- Operational Value: Establishes standardized slide preparation and antigen retrieval protocols to ensure staining consistency.
- Assay Readiness: Enables reliable compound evaluation through spatially resolved, quantitative multiplex imaging.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery phenotyping with preclinical validation by preserving spatial context across workflows.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of candidate biomarkers through co-expression and spatial relationship analysis.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by revealing on-target versus off-target staining patterns in complex tissues.
Pipeline & Workflow Integration
mfIHC fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization to preclinical efficacy studies, particularly for immuno-oncology programs requiring spatial validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling multiplex immune phenotyping in disease-relevant FFPE models.
- Screening: Delivers assay-ready tissue sections with quantitative fluorescence readouts for antibody screening and optimization.
- Analytics: Provides spatial co-localization and intensity measurements that enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through preserved tissue architecture and cellular spatial relationships.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FFPE multiplex platform applicable across oncology and immunology discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in cellular interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized blocking, antibody titration, and microwave-based antigen retrieval.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by revealing specific versus nonspecific staining in pathology brightfield views.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on spatially resolved target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry optimization, antibody validation, and fluorescent microscopy.
- Depends on hybridization ovens, microwave antigen retrieval systems, humidified chambers, and fluorescence microscopes with spectral unmixing.
- Necessitates cross-team standardization of slide handling, antibody dilution, and staining sequence documentation.
- Involves adaptation considerations for antibody order, fluorophore selection, and DAPI counterstaining across tissue types.
- Includes practical limitations such as extended staining duration (3–4 days), need for monoplex optimization, and risk of signal loss during antibody stripping steps.
