Name: Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Öğrenin, çoklu floresan immünohistokimya ile formalin sabitlenmiş parafin gömülü dokularda hücre türlerini ve uzamsal ilişkileri görüntüleyin. Bu yöntem, tümör mikroçevresindeki bağışıklık ve kanser hücre etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Perkin Elmer daha önce Ed Stack teşekkür etmek istiyorum, kurulum ve orijinal Multiplex boyama optimizasyonu ile onun yardımı için. Yazarlar da analiz yazılımı kullanarak ipuçları için Akoya Biosciences gelen Kristen Schmidt teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Kanser Sağlık Enstitüleri tarafından ödül numarası P30CA046592, K08CA201581 (TLF), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC) altında desteklenmektedir. CA170568 (HC). İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Ek destek Jeffery A. Colby Colon Cancer ve Tom Liu Memorial araştırma fonları tarafından sağlandı.

Tüm çalışmalar Michigan Üniversitesi 'nin iç İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. birincil antikorlar ve slayt hazırlama optimizasyonu
<ol><li>Konvansiyonel ıHC kullanarak Multiplex için antikor ideal konsantrasyonu belirleyin.<ol>
<li>Multiplex için antikorları manuel konvansiyonel immünhistokimya (ıHC)13ile test edin.</li>
<li>Her antikor için bol hücre tipine sahip belirli dokulara, CD3 antikor testi için Bademcik dokusu kullanma gibi test edilir.</li>
<li>Şirket tarafından önerilen ıHC için referans konsantrasyonu kullanın ve daha sonra önerilen konsantrasyonlarda antikor konsantrasyonları yanı sıra yukarıda ve önerilen konsantrasyon altında konsantrasyonları ile ıHC tamamlayın.</li>
</ol>
</li>
<li>Formalin sabit parafin gömülü dokusu slaytlar üzerine hazırlayın.<ol>
<li>Microtome kullanarak, 4 ve 6 μm arasında bir kalınlıkta FFPE dokusu blokları kesilmiş ve şarj slaytlar için geçerlidir. Not: distile su kullanımı, Multiplex boyunca uygun doku montajı ve uyumu sağlar.</li>
<li>Slaytlar düz, doku tarafı yukarı yerleştirin ve 37 °C gece kuru izin.</li>
<li>Slaytları, Multiplex tamamlamak için hazır olana kadar aşırı sıcaklıktan uzak bir slayt kutusunda saklayın.</li>
</ol>
</li>
</ol>2. genel boyama yöntemi
<ol><li>Yıkama ve antijen alma çözümlerinin hazırlanması<ol>
<li>0,1% tbst yıkama çözeltisi 9 l deiyonize su, 1 l Tris tamponlu tuz (TBS) ve 10 ml polisorbat 20 ' ye karışarak hazırlayın.</li>
<li>Hem antijen alma çözümlerini hazırlayın (pH 6 ve pH 9; Malzeme tablosu) deiyonize su ile 1x sulandrarak tarafından.</li>
</ol></li>
<li>Deparafizasyon ve rehidrasyon<ol>
<li>Bake slaytlar, düz yalan, doku tarafı kadar 60 ° c için 1 h bir hibridizasyon fırın1. Fırından slaytlar çıkarın ve en az 5 − 10 dakika soğumasını bekleyin, ardından dikey bir sürgülü rafa yerleştirin.</li>
<li>Aşağıdaki çözümlerde slaytları sırayla Treat: triplicate içinde ksilolü,% 100 etanol tek bir tedavi izledi,% 95 etanol, ve son olarak% 70 etanol 10 dakika her bir slayt boyama seti1kullanarak.</li>
<li>30 dakika13için nötr tamponlu formalin ile dolu bir plastik slayt kutusunda daldırma ile sabitleme tarafından izlenen bir plastik slayt kutusunda dalaşma ile 2 dakika deiyonize su ile slaytlar raf yıkayın. 2 dakika boyunca deiyonize suda slaytlar yıkayın sonra antijen alımı devam.</li>
</ol></li>
<li>Antijen alımı<ol>
<li>Slayt rafı, pH 6 veya pH 9 antijen alma tamponu ile iç hattan (yaklaşık 300 mL) doldurulmuş ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin. Not: Antigen alma arabelleği pH 6 veya pH 9 epitope başına optimize edilmesi gerekebilir olabilir. Ancak, nükleer epiton ve pH 6 tüm diğer antikorlar için bağlamak antikorlar için pH 9 kullanarak başlayın.</li>
<li>Kapak plastik wrap ile kutuyu ve güvenli bir lastik bant kullanın. Kutuyu, dönen plakanın kenarındaki mikrodalga fırınına yerleştirin (mikrodalga ısıtma için evirici teknolojisiyle donatılmış olmalıdır). 45 s için slaytları% 100 güç ile% 20 güç13' te 15 dakika takip ederek ısıtın. Not: mikrodalga tedavi kullanılan mikrodalga bağlı optimizasyon gerekebilir.</li>
<li>Slaytlar yaklaşık 15 − 20 dakika boyunca soğumaya bırakın.</li>
</ol></li>
<li>Soğuk slaytlar iken antikorlar ve fluorophores çalışma çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>0,5 g Sığır serum albümin granüller 50 ml tbst içine çözünerek primer antikor seyreltici hazırlayın. Alternatif olarak, granüller çözülür 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 mL kullanın.</li>
<li>Her primer antikor çalışma çözümünü, birincil antikor seyreltildiği Bölüm 1 ' de belirlenen en iyileştirilmiş konsantrasyona yapın. Slayt başına yaklaşık 200 μL tahmin edin.</li>
<li>1:100 konsantrasyonunda fluorophore seyreltme her fluorophore seyreltilerek fluorophore çalışma çözümünü hazırlayın. Not: Bu antikor bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Slayt başına yaklaşık 100 μL tahmin edin.</li>
<li>Boyama son gününde, hazırlamak 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) TBST 1 mL içine DAPI 3 damla ekleyerek çalışma çözümü.</li>
</ol></li>
<li>Slayt boyama (yıkama ve engelleme)<ol>
<li>Soğutduktan sonra mikrodalga kutusunu çıkarın ve plastik wrap kapalı almak, 2 dakika boyunca deiyonize su ile slaytlar yıkayın bir plastik slayt kutusunda 2 dakika yıkama tarafından izlenen TBST13.</li>
<li>Hassas bir görev ile doku etrafında her slayt kurutduktan sonra doku kuru izin değil dikkatli silin, bir hidrofobik bariyer kalem kullanarak doku dışında etrafında iz. Hassas görev silme veya kalem ile dokuya dokunmayın.</li>
<li>Her slaytı nemlendirilmiş Odaya yerleştirin ve dokuya engelleme çözeltisi (yaklaşık 4 damla) ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inküye yapın.</li>
</ol></li>
<li>Slayt boyama (primer antikor uygulaması)<ol>
<li>Her slayt alın ve kağıt havlu yığını üzerinde slaytın tarafına dokunarak ve hassas bir görev doku etrafında aşırı engelleme aracı kaldırmak için silin kullanarak engelleme çözümü kaldırın.</li>
<li>Slaytı geri nemlendirilmiş Odaya yerleştirin ve çalışma primer antikor yaklaşık 200 μL ekleyin. RT 'de 1 saat boyunca nemlendirilmiş odada inküye yapın.</li>
<li>Triplicate13' te daldırma ile 2 dakika boyunca tbst ile yıkayın. Not: her yıkama adımında, TBST değiştirme daha temiz bir görüntü sağlamaya yardımcı olacaktır.</li>
</ol></li>
<li>Slayt boyama (ikincil antikor uygulaması)<ol>
<li>Her slayttan kalan TBST kapalı DAB ve ikincil antikor yaklaşık 3 ila 4 damla uygulamak (tavşan ve fare ikincil HRP konjuze antikorlar karışımı). RT13' te nemlendirilmiş odada 10 dakika boyunca inküye yapın. Not: fare veya tavşan dışında ikincil bir antikor gerektiren veya alternatif bir ikincil antikor kullanmayı tercih eden bir primer antikor kullanmayı planlıyorsanız, slaytlara ikincil konjuli uygun HRP 'yi uygulayın ve 45 dk için RT 'de inkük edin. optimizasyonu Alternatif ikincil14için inkübasyon süresi gerekebilir.</li>
<li>İnkübasyon sonrası, TBST ile 2 dakika boyunca triplicate13ile yıkayın.</li>
</ol></li>
<li>Slayt boyama (fluorophore uygulaması)<ol>
<li>Fluorophore çalışma çözeltisi yaklaşık 100 μL uygulayın ve 10 dk13için RT 'de nemlendirilmiş odada inküye yapın.</li>
<li>TBST ile 2 dakika boyunca triplicate13ile yıkayın.</li>
</ol></li>
<li>Antikorların kaldırılması<ol>
<li>Mikrodalga kaydırakları (45 s% 100 daha sonra 15 dk% 20) ısıya dayanıklı kutuda (bkz. Adım 2.3.2) antikorların kaldırılması için13,14. Not: Bu Multiplex bir turda tamamlar. Bu, protokol duraklatılabilen tek noktasıdır. Protokolü duraklatmak için, slaytları antijen alma arabelleğinde gece oda sıcaklığında bırakın.</li>
</ol></li>
<li>Boyama ek tur devam edin. , Antikor-fluorophore çiftleri geri kalanı için 2.5.1 − 2.9.1 adımlarını yineleyin. Tüm antikorlar ve fluorophores kullanıldığında, Bölüm 2,11 devam edin.</li>
<li>DAPı uygulaması ve montajı<ol>
<li>Multiplex son boyama yuvarlak sonra, antijen alma solüsyonu pH 613ile son antikor uygulama çıkarın. 2 dakika her13için tbst takip deiyonize su ile yıkayın.</li>
<li>Çalışma DAPı çözeltisi yaklaşık 150 μL 'yi slaytlara uygulayın ve RT1' de nemlendirilmiş odada 10 dakika boyunca inküye yapın.</li>
<li>Yaklaşık 30 s için TBST ile yıkayın ve bir antifade mountant ile montaj Cover,. Montaj medya lamel magazini güvenli (opsiyonel) kurutulur kez lamel magazini dört köşesinde açık tırnak cilası uygulayın.</li>
</ol></li>
</ol>3. Kütüphane, monoplexes ve Multiplex detayları
<ol><li>Fluorophore Kütüphanesi oluşturmak için slaytlar seçin.<ol>
<li>7 renkli Multiplex için Kütüphane için 7 bağışıklık hücresi zengin doku kaydırağı (örneğin, bademcik, dalak, vb.) toplayın. Not: Multiplex kullanılan her benzersiz fluorophore temsil eden her slayt ile bir fluorophore Kütüphanesi için kullanılacak kontrol slaytları seçin. Kontrol slaytlar seçim bol epitopu olmalıdır ve her fluorophore için doku aynı türde olabilir.</li>
</ol></li>
<li>Monoplexes ve multiplexes ile kullanım için leke ve görüntü kütüphanesi slaytlar.<ol>
<li>Kontrol slaytlarını kullanarak 2.1 − 2.9.1 adımları izleyin ve seçim doku slaytlar kontrol edin. 1:100 konsantrasyonunda her slayda farklı bir fluorophore yerleştirin; bir slayt yalnızca DAPı içermelidir.</li>
<li>DAPı boyama atlamak dışında Bölüm 2,11 devam edin ve bunun yerine TBST kullanın ve açıklandığı gibi bağlayın.</li>
<li>Tüm kanallar DAPı, CY3, CY5, CY7, Texas Red, Yarıiletken kuantum noktalar ve floresan ısothiocyanate (FITC) ile% 250 MS doygunluk koruma özelliği ayarı ile görüntü, bir gecede kuru slaytlar izin sonra1. Not: pozlama süreleri 50 − 250 MS13' de ayarlanabilir.</li>
<li>Kitaplık görüntülerini yazılım üzerine yükleyin ve monopleler ve Multiplex analizinde kullanın.</li>
</ol></li>
<li>Monoplexes için slaytlar seçin.<ol>
<li>Optimize antikorlar (Bölüm 1) dayalı seçim bol epitopu olan kontrol slaytlar seçin. Her yuvarlak boyama için Multiplex yapılacak, bu sayıda kontrol slaytları monoplexes oluşturmak için seçin. Not: monoplex amacı, Multiplex kullanılacak her antikor için en iyi pozisyon (sipariş) belirlemektir.</li>
</ol></li>
<li>Leke monopleler.<ol>
<li>Her slaytlar için farklı bir sırada (pozisyon) birincil antikor kullanarak 2.1 − 2.11 bölümlerini izleyin. Her slaytta, diğer slaytlardan farklı bir sırada (pozisyon) uygulanan yalnızca bir birincil antikor olmalıdır. Not: yuvarlak hiçbir birincil antikor veya fluorophore için çağıran her slayt Için, bunun yerine primer antikor seyreltilme ve fluorophore seyreltilme13kullanın.</li>
</ol></li>
<li>Görüntü slaytlar ve monoplex analiz.<ol>
<li>Mikroskop kullanarak ve tüm kanallar için 250 MS için pozlama süresini ayarlama odak DAPı kullanan her görüntü yakalamak. Not: pozlama süreleri 50 − 250 MS14olarak ayarlanabilir.</li>
<li>Analiz yazılımını kullanarak her bir monoplex slaytı lekelenmiş işaretçinin floresan yoğunluğuna bakarak değerlendirin.</li>
<li>Bu yoğunluğu arka planda karşılaştırın. Arka planda en az 5 − 10 kat daha yüksek ise, bu slaytın konumu son Multiplex 'de kullanmak için en uygun konumudur.</li>
</ol></li>
<li>Multiplex için slaytlar seçin.<ol>
<li>İlgi slaytlarını seçin ve boyama ve görüntülemeden sonra otofloresans çıkarma için boş bir slayt olarak kullanılmak üzere ekstra bir slayt ekleyin.</li>
</ol></li>
<li>Multiplex leke.<ol>
<li>Monoplex sonuçlara dayanarak, adım 3.5.3 dayalı her antikor için uygun sırayı (pozisyonlar) seçin. Her fluorophore bir antikor atayın. Not: Bu optimizasyon gerekebilir; Ancak, daha az bol işaretçileri için parlak antikorlar kullanmayı planlıyoruz1, Co-yerelleştirme antikorları birbirlerinden en spektrumları fluorophores ile eşleşmelidir13, ve spektrumlu fluorophores 540 ve 570 Co-lokalize nedeniyle olmamalıdır Spektral çakışma sorunları1.</li>
<li>2.1 − 2.11 bölümlerle devam edin, boş slaytın primer antikor, fluorophore veya DAPı almaması yerine, sırasıyla antikor seyreltici, fluorophore seyreltilmesi ve TBST kullanın.</li>
</ol></li>
<li>Görüntü Multiplex ve boyama bütünlüğü için analiz<ol>
<li>Mikroskop kullanarak ve tüm kanallar için 250 MS için pozlama süresini ayarlama, odaklanmak için DAPı kullanan her görüntüyü yakalamak.</li>
<li>Analiz yazılımını (malzeme tablosu) kullanarak, her bir Multiplex 'i floresan yanlış renkle değerlendirin. Not: net bir görüntü her Marker açıkça göstermelidir. Bir işaretçi differe ve grenli görünüyorsa veya varolmayan, işaretçinin işe yaramadı ve yeniden optimize edilmesi gerekir muhtemeldir.</li>
<li>Analiz yazılımını kullanarak her bir Multiplex 'i patoloji görünümüne göre değerlendir. Patoloji görünümü her işaretçinin özgüllüğünü teyit edecektir. Daha önce en iyi duruma getirilmiş ıHC karşılaştırın (Bölüm 1).</li>
</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+phenotypic+immune+profiling+of+metastatic+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer.</a> JCI Insight. 3 (22), (2018).</li>
<li>Barua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Spatial+Analysis+Platform+for+Discovery+of+Immunological+Interactions+Predictive+of+Low-Grade+to+High-Grade+Transition+of+Pancreatic+Intraductal+Papillary+Mucinous+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Informatics%22%5BJournal%5D)">A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms.</a> Cancer Informatics. 17, 1176935118782880(2018).</li>
<li>Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+reveals+hyper+active+TGF-beta+signaling+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer.</a> Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).</li>
<li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095(2017).</li>
<li>Steele, K. E., Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Immunohistochemistry+for+Image+Analysis+of+Tertiary+Lymphoid+Structures+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer.</a> Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-Color+Multiplex+Immunohistochemistry+for+Simultaneous+Detection+of+Multiple+Immune+Checkpoint+Molecules+within+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment.</a> The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li>
<li>Phenoptics Research Solutions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Perkin+Elmer+Manual%22">Perkin Elmer Manual</a>. , 32(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Opal+Multiplex+IHC+Assay+Development+Guide%22">Opal Multiplex IHC Assay Development Guide</a>. , Perkin Elmer Manual. (2014).</li>
<li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Katı tümör biyopsisi ve cerrahi rezeksiyondan gelen bozulmamış doku örnekleri, hasta prognoz yanı sıra hastalık analizi için önemli tanı ve öngörü araçları olarak kalır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), immünhistokimya (ıHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri avantajlarını birleştiren yeni bir tekniktir. Bir doku ortamında hücre-hücre düzenlemeleri değerlendirilmesi için izin var situ hücre prob önceki yöntemleri8, ancak, probed olabilir epitenler düşük sayıda karmaşık analiz sı...

Bozulmamış bir tümör mikroortamının (TME) görselleştirilmesi, sadece katı malignitelerde hücresel infiltrasyonu değil, hücrenin hücre etkileşimlerini de değerlendirmede esastır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) kanser ve ilişkili hastalıklar çalışmada hücrelerin Multi-antijen fenotiplemeyi için etkili bir araç olarak ortaya çıkmıştır1,2,3,4, 5,6,7. Bu, büyük veri setleri analiz etmek için tasarlanmış yeni yazılım ve programlar ile birlikte, hücreler1,2,4arasındaki karmaşık etkileşimlerin gözlem sağlar. Veri toplama faktörü sınırlama oranı genellikle analiz öncesinde lekeli doku kalitesidir.
TME 'deki fenotip hücrelerinde kullanılan önceki teknikler arasında immunohistokimya (IHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri bulunmaktadır ve bu da önemli sınırlamalar sunar. IHC, en sık bir antikor tarafından lekelenmeden önce deparafsonize edilmiş ve rehydrated olan formalin sabit parafin gömülü (FFPE) doku bölümlerini kullanır. Bir horserpu peroksidaz (HRP) bağlı ikincil antikor ve kimyasal reaksiyon kullanımı tek bir antijenik epitopu görselleştirme sağlar8. IHC güvenilir ve birlikte çalışması kolay FFPE doku üzerinde gerçekleştirilen, görünür ışık spektrumuna sınırlamalar sadece bir veya iki işaretçileri güvenilir seçkin ve antijenlerin kolokalizasyonu oldukça zor8anlamına gelir. Kullanılabilir işaretçileri genişletmek için bir yol ve bu nedenle tek bir bölümde probed edilebilir antijenler görsel spektrumunun daha geniş bir yelpazede kullanımı için izin floresans değiştirmek için. Eğer, dondurulmuş veya FFPE doku slaytlar üzerine transfer edilir ve çeşitli fluorophores konjuyum kullanılan antikorlar. Bu probed edilebilir antijenler sayısını artırır iken, birkaç önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, her antikor genellikle sadece bir fluorophore bağlı olduğundan, parlaklık genellikle doku autofluorescence aşmak için yeterince güçlü değildir. Bu nedenle, çoğu If saklamak için pahalı ve çalışmak zor dondurulmuş doku üzerinde gerçekleştirilir. Floresan etiketleri sınırlı sayıda spektral örtüşme ve çapraz türler reaktivite özellikle olmayan konjued antikorlar kullanıldığında nedeniyle kullanım için kullanılabilir. Tek hücreli süspansiyon içine taze doku işleme ve floresan antikorlar ile etiketleme oluşan akış sitometri, onlarca yıldır immünofenotipleme için altın standart olmuştur9,10. Akış cytometri bir yararı türleri çapraz reaktivite için endişe olmadan çoklu antikorlar etiket yeteneği en konjut olduğu gibi. Hücreler bir makine ve insan gözleri değil "görselleştirilen" Çünkü, çok daha fazla fluorophores mevcuttur ama bu bir maliyet ile birlikte gelir. Tazminat, yanlış pozitif ve negatif nüfus üreten sonuçları önemli ölçüde değiştirebilir el ile yapılmalıdır. Akış sitometri en önemli sınırlama, doku mimarisi ve daha sonra tüm uzamsal bilgiler tek hücreler süspansiyon gereksinimi ile kaybolur.
Yeni yazılım ile birlikte otomatik bir floresan mikroskop kullanan Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), ıFC, IF ve akış sitometri avantajlarını, sinyal amplifikasyonu ile çok antijen doku boyama ve tazminat gerek kalmadan uzamsal ilişkilerin saklanması. FFPE doku şarj slaytlar üzerine yerleştirilir, antijen alımı sonra, ıFC benzer bir HRP kimyasal etiketi ile ikincil bir antikor takip faiz hedef antijen birincil antikor uygulama bir yuvarlak geçmesi. İkincil antikor yerleştirdikten sonra, bir HRP spesifik reaksiyon bir fluorophore rastlamak ilgi epitopu için bağlayıcı bir sonuç11. Doku etiketlendikten sonra, slaytlar Isıtma başka bir turda sadece floresan etiketi doku epitopu bağlı bırakarak önceden uygulanan birincil ve ikincil antikor kompleksi kaldırma tamamlandı11. Bu, herhangi bir türün birden fazla antikorlarının Cross-reactivity11,12için endişe olmadan yeniden uygulanması için izin verir. Çoklu floresan boyalar manuel telafisi için herhangi bir ihtiyacı en aza indirmek için, bir nükleer sayaç leke dahil olmak üzere küçük spektral örtüşme ile fluorophores bir koleksiyon mfIHC tamamlamak için kullanılır. Ffpe doku ile karşılaşılan otofloresans dikkate almak için, yazılım, florophore aşağıdaki antijen spesifik floresans gücü nedeniyle mümkün olan boş bir slayttan bir görüntü kullanarak son görüntüden otofloresans çıkarır sinyal amplifikasyon. Büyük veri kümeleri için tasarlanmış yeni programları kullanarak, hücre konumları tespit ve uzamsal bağlam1,2,4için analiz edilebilir. Bu tekniğin en önemli sınırlaması optimizasyon zamanidir. Deneysel tasarım ve boyama ve görüntüleme stratejisi talimatlarını içeren ayrıntılı bir metodoloji burada bulunur. mfIHC Şu anda manuel tekniği kullanarak bozulmamış FFPE doku hücre-hücre etkileşimlerin uzamsal bağlamı daha iyi anlamak istiyorum optimize edilmiş otomatik boyama sistemi yok laboratuvarlar için yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>%100 etanol</td><td>Fisher</td><td>HC8001GAL</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>Fisher</td><td>HC10001GL</td><td></td></tr><tr><td>%95 etanol</td><td>Fisher</td><td>HC11001GL</td><td></td></tr><tr><td>Analiz yazılımı</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS135783</td><td>inForm sürüm 2.3.0</td></tr><tr><td>Antifade mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36961</td><td>ProLong</td></tr><tr><td>Elmas Engelleme çözümü</td><td>Vektör</td><td>SP-6000</td><td>Bloxall Sığır</td></tr><tr><td>Serumu Albümini (BSA)</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Fişleri</td><td>Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Hassas görev mendili</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Floresan seyreltici</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1A01EA</td><td>Opal TSA seyreltici</td></tr><tr><td>Florofor 520</td><td>Akoya Biyolojik Bilimler</td><td>FP1487001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Florofor 540</td><td>Akoya Biyolojik Bilimler</td><td>FP1494001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Florofor 570</td><td>Akoya Biyolojik Bilimler</td><td>FP1488001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Florofor 620</td><td>Akoya Biyolojik Bilimler</td><td>FP1495001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Florofor 650</td><td>Akoya Biyolojik Bilimler</td><td>FP1496001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Florofor 690</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1497001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Florofor DAPI</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1490</td><td>TBST veya PBS'de 3 damla</td></tr><tr><td>Isıya dayanıklı kutu</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-904</td><td>Plastik sürgülü kutu-yeşil</td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş Oda</td><td>Ibi Scientific</td><td>AT-12</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td>FisherBiotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik bariyer kalemi</td><td>Vektör</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge</td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS140089</td><td>Mantra kantitatif patoloji iş istasyonu</td></tr><tr><td>İnverter teknolojili</td><td>mikrodalga</td><td>Panasonic</td><td>NN-A661S</td></tr><tr><td>Nötr tamponlu formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>%10 nötr tamponlu formalin</td></tr><tr><td>pH 6 antijen alma tamponu</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR600</td><td>AR6</td></tr><tr><td>pH 9 antijen alma tamponu</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR900</td><td>AR9</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Plastik kayar kutu</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-906</td><td></td></tr><tr><td>Plastik sargı</td><td>Fisher</td><td>NC9070936</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-800</td><td>Tween 20</td></tr><tr><td>Birincil antikor CD163</td><td>Lecia</td><td>NCL-LCD163</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Birincil antikor CD3</td><td>Dako</td><td>A0452</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Birincil antikor CD8</td><td>Bahar Bio</td><td>M5390</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Birincil antikor FOXP3</td><td>Dako</td><td>M3515</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Birincil antikor pansitokeratin</td><td>Hücre Sinyali</td><td>12653</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Birincil antikor PD-L1</td><td>Hücresi Sinyalizasyon</td><td>13684</td><td>1:200</td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARH1001EA</td><td>Opal polimer</td></tr><tr><td>Slayt leke seti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>6254001</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponlu salin</td><td>Corning</td><td>46-012-CM</td><td>TBS</td></tr><tr><td>Dikey kayar raf</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>X3P1GAL</tr></tbody></table>

manuel multiplex floresan immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

Hücre infiltrasyonu ve mekansal organizasyon analizi için bozulmamış doku mikroçevre değerlendirilmesi hastalık süreçlerinin karmaşıklığını anlamakta esastır. Geçmişte kullanılan prensip teknikleri, 1 ile 4 işaretçileri arasında zaman içinde bir anlık görüntü olarak hücrelerin görselleştirilmesini sağlayan immünhistokimya (ıHC) ve immünofluoresesans (IF) içerir. Her iki teknik de kötü antijenik hedefler ve çapraz türler reaktivite ile ilgili sınırlamalar boyama zorluk dahil eksiklikleri var. IHC güvenilir ve reproducible, ancak kimyasal ve görünür ışık spektrumuna güven doğası sadece birkaç işaretçileri kullanılmak üzere sağlar ve Co-yerelleştirme zorlu yapar. If kullanımı potansiyel işaretçileri genişletir, ancak genellikle formalin fikreasyon aşağıdaki geniş doku otofloresans nedeniyle dondurulmuş doku dayanır. Akış cytometri, birden fazla epiton eşzamanlı etiketleme sağlayan bir teknik, IF ve IFC eksiklikleri birçok CPAP, ancak, tek bir hücre süspansiyon olarak hücreleri incelemek için ihtiyaç önemli biyolojik atarak hücrelerin uzamsal bağlamı kaybeder Ilişki. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) Bu teknolojiler, genel mikroçevre mimarisi ve mekansal koruyarak formalin sabit parafin gömülü (ffpe) doku Multi-epitope hücresel fenotiplemeyi için izin köprüler bozulmamış doku içinde hücrelerin ilişkisi. Yüksek floresan yoğunluğu fluorophores bu kovalently doku epitopu bağ türü belirli çapraz reaktivite ikincil antikorlar endişe etmeden primer antikorların birden fazla uygulama sağlar. Bu teknoloji hastalığın çalışması için güvenilir ve doğru görüntüler üretmek için kanıtlanmış olmasına rağmen, yararlı bir mfIHC boyama stratejisi oluşturma süreci zaman alıcı ve kapsamlı optimizasyon ve tasarım nedeniyle titiz olabilir. Doğru hücresel etkileşimleri temsil eden ve manuel analiz için optimizasyon süresini azaltmak için sağlam görüntüler yapmak amacıyla, burada sunulan slayt hazırlama, antikorlar, Multiplex tasarım yanı sıra hataları optimize etmek için Yöntemler genellikle boyama işlemi sırasında karşılaşılan.

7-renkli Multiplex assay alma genel süreci tekrarlayan bir desen izler. Şekil 1 , bir grafiksel formunda işlemi açıklar. Bir kez slaytlar kesilmiş ve kurutulur veya laboratuvardan alınır ve 1 h için 60 °c ' de bir hibridizasyon fırında pişmiş, daha sonra deparafinizasyonda ve rehidrasyon devam, yeniden antijen alma tarafından takip formalin slaytlar düzeltin. Her yuvarlak çoğullama antikor kaldırma (Şekil 1) üzerinde antijen alma ve bitirir başlar.
<p class=...

Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.

Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

Multipleks floresan immünohistokimya birden fazla hücre tipini ve konumlarını bozulmamış formalin-sabit parafin gömülü dokuda tanımlar, bu da sadece hücre tanımlaması için değil, hücreden hücremekansal analize de olanak sağlar. Bu manuel tekniğin en büyük avantajı çapraz reaktivite olmadan aynı türün birden fazla antikor kullanımıdır. Bu teknik tümör mikroortamında bağışıklık ve kanser hücrelerinin etkileşimleri içine derinlemesine bir görünüm sağlar.Bu tekniği ilk kez denerken, yaklaşık 3-4 gün boyama ya da işlem sırasında her adımı tamamen takip edin. Boyama işlemi ve multipleks tasarımı nın daha zayıf bir yöntemi, yaygın ve beklenen tuzakları azaltmak için çok önemlidir. Slaytları ayırarak ve yeniden sudinerek başlayın.Doku yan ile hibridizasyon fırında onları lay ve bir saat boyunca 60 derece santigrat onları pişirin. Slaytları fırından alın ve dikey bir kaydırakta 5 ila 10 dakika soğumasını bekleyin. Daha sonra slaytları üç kez ksilen ve bir kez %100 etanol, %95 etanol ve %70 etanol ile 10'şar dakika boyunca tedavi etmek için bir slayt boyama seti kullanın.Slaytrafını deiyonize suyla yıkayın ve daha sonra 30 dakika boyunca nötr arabelleğe aldanarak slaytları düzeltin. İki dakika su ile slaytlar yıkayın ve antijen alma ile devam edin. Slayt rafını pH 6.0 veya pH 9.0 antijen alma tamponu yla dolu ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin.Kutunun üzerini plastik ambalajla kapatın ve lastik bantla sabitleyin. Kutuyu dönen plakanın kenarına bir inverter donanımlı mikrodalgaya yerleştirin ve slaytları %100 güçte 45 saniye ısıtın ve ardından %20 güçte 15 dakika. Slaytlar microwaving sonra 15-20 dakika soğumasını bekleyin.Bu arada, antikorlar ve floroforların çalışma çözümlerini hazırlayın. TBST veya 1X PBS 50 mililitre sığır serum albumen granül0 0,5 gram eriterek birincil antikor dilüent hazırlayın. Her birincil antikor çalışma çözeltisini önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltin.Florofor seyreltici her florofor seyreltmek bir ila 100 konsantrasyonda. Boyama nın son gününde, bir mililitre TBST'ye üç damla DAPI ekleyerek DAPI çalışma çözümünü hazırlayın. Slaytlar soğuduktan sonra mikrodalgadan çıkarın ve plastik ambalajı çıkarın.İki dakika deiyonize su ile yıkayın ve ardından TBST ile iki dakikalık bir yıkama. Yıkamadan sonra, hassas bir görev sil ve hidrofobik bariyer kalem ile doku dışında iz ile doku etrafında slayt kuru, doku dokunmamaya dikkat veya kurumasını bekleyin. Her slaytı nemlendirici haznesine yerleştirin ve dokuya yaklaşık dört damla bloklama çözeltisi ekleyin.Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca slaytlar kuluçka ve birincil antikor uygulaması ile devam edin. Kağıt havlu yığınının üzerindeki slaydın yan tarafına dokunarak her slayttan engelleme çözümünün çıkarılmasını ve kalan çözümü kaldırmak için hassas bir görev silme kullanın. Kaydırağı nemlendirilmiş odaya geri yerleştirin, çalışan birincil antikor yaklaşık 200 mikrolitre ekleyin ve bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, slaytları tbst'ye iki dakika boyunca batırarak üç kez yıkayın. Her slayttan kalan TBST kapalı Dab ve ikincil antikor yaklaşık üç ila dört damla uygulayın. 10 dakika boyunca nemlendirilmiş odada slaytlar kuluçka.Slaytları TBST ile tekrar yıkayın ve florofor çalışma çözeltisinin yaklaşık 100 mikrolitresini uygulayın. Slaytları nemli odaya geri verin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. TBST yıkama tekrarlayın ve daha sonra antikorları kaldırmak için el yazması yönergelerine göre slaytlar mikrodalga.Bu çok günlük boyama işlemi sırasında hatırlanması gereken önemli bir şey microwaving adım sonra durdurma ve antijen alma tampon gecede slaytlar bırakarak, doku ve leke bütünlüğünü sağlamak. Antijen alma solüsyonu ile son antikor uygulamasını çıkarın ve kayma başına iki dakika boyunca TBST ardından deiyonize su ile slaytları yıkayın. Antikor flurophore çiftleri geri kalanı için boyama adımları tekrarlayın ve sonra DAPI uygulaması ile devam edin.Her slayta yaklaşık 150 mikrolitre çalışan DAPI çözeltisi uygulayın ve nemli haznede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, slaytları TBST ile yaklaşık 30 saniye yıkayın ve kapak fişlerini monte edin. Montaj ortamı kuruduktan sonra, emniyete almak için kapağın dört köşesine açık tırnak cilası uygulayın.Monopleksi analiz etmek için, mikroskoptaki slaytları, odaklanmak için DAPI kullanarak 250 milisaniyelik pozlama ile görüntüleyin. Lekeli işaretleyicinin floresan yoğunluğuna bakarak her monopleks slaytı değerlendirin ve bu yoğunluğu arka planla karşılaştırın. Lekeli işaretçi yoğunluğu arka plandan en az beş kat daha yüksekse son multipleksteki slayt konumunu kullanın.Multipleks boyama, her antikor için uygun sırayı seçin ve bir antikor için her florofor atayın. Daha önce açıklandığı gibi multipleks boyama ile devam edin ve primer antikor, florofor veya DAPI yerine antikor dilüent, florofor dilüent ve TBST alır boş bir slayt hazırlamak. Mikroskopüzerindeki çoklayıcıyı görüntülenmeye hazır olduğunuzda, pozlamayı tüm kanallar için 250 milisaniyeye ayarlayın ve odaklanmak için DAPI kullanarak her görüntüyü yakalayın.Daha sonra her çokluk floresan yanlış renk ve patoloji görünümü ile her belirteç özgüllüğünü teyit edecek değerlendirmek için analiz yazılımı kullanın. Multipleks testin inbaşarısını sağlamak için, her antikor un sırasını belirlemek için monopleks bir test yapılmalıdır. Örneğin, Foxp3 dizinin üçüncü konumundayken, CD3 ile spesifik ve sağlam boyama ve kolokalizasyon gösterilmiştir.Buna karşılık, Foxp3 ilk konumda olduğunda, Foxp3 nonspesifik boyama oluşur. Kaydırakların çoğunda kırmızının grenli ve verimli alanları bulunur ve bu alanların floresan yoğunluğu düşüktür. Bu tahlilde bir diğer önemli adım hücre tanımlama ve daha fazla analiz için temel olan DEPI karşı boyama vardır.Çalışma ve çalışmayan DAPI ile görüntüler arasında net bir kontrast görülebilir. Multipleks tarar için, güzel kompozit görüntüler her zaman doğru bir leke yansıtmaz. CD3 görselleştirilmiş ve spesifik boyama gösterirken, CD163'ün patoloji parlak alan görünümü antikorun spesifik olmadığını kanıtlamaktadır.Optimal multipleks görüntü kompozit görüntüde belirli boyama gösterir ve CD3 ve CD163 özgüllüğü patoloji brightfield görünümü ile doğrulanır. Bu yordamı takiben hücre ile hücre etkileşimlerini daha fazla analiz etmek için kendi kendini fenotipleme ve mekansal analiz hesaplamaları yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların hücrelerin ve bozulmamış dokunun mekansal desenlerini keşfetmelerinin önünü açarak tümör immün mikroçevresini daha iyi anlamamızı sağladı.

optimization-design-avoiding-pitfalls-manual-multiplex-fluorescent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Multipleks immünhistokimya ve multispektral görüntülemedeki gelişmelere rağmen, endometriyumda aynı anda majör immün hücrelerin yoğunluğunu ve kümelenişini karakterize etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu makalede, endometriyumdaki dört immün hücre tipinin eşzamanlı lokalizasyonu için ayrıntılı bir multipleks boyama protokolü ve görüntüleme açıklanmaktadır.

Tekrarlayan Düşükte Dört Endometriyal İmmün Hücre Tipinin Çok Yönlü Floresan İmmünohistokimyasal Boyanması

Bu makalede, manuel tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) multipleks immünofloresan (mIF) protokolü ile birlikte görüntü analizi ve uzamsal analiz anlatılmaktadır. Bu protokol, laboratuvarda bulunan slayt tarayıcısına bağlı olarak slayt başına iki ila altı antijenin boyanması için formalin sabit parafin gömülü (FFPE) bölümlerle birlikte kullanılabilir.

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Bu protokol, multipleks immünohistokimya kullanılarak tümör mikroçevresinin immün hücre karakterizasyonunun nasıl yapıldığını ayrıntılı olarak açıklar.

Tümör Mikroçevresinin Mekansal İmmün Hücre Manzarasının Multipleks İmmünohistokimyasal Analizi

Bu deneysel protokol, esas olarak tek kanallı antikor inkübasyon koşullarını optimize ederek ve klinik kökenli akciğer kanseri dokularında otofloresan ve kanal karışma problemlerini çözmek için antikorların ve kanalların ayarlarını ayarlayarak bir multipleks immünohistokimya (IHC) boyama yöntemini tanımlar ve optimize eder.

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Burada, ticari olarak temin edilebilen, otomatik doku boyalayıcıları ve tiramid sinyal amplifikasyonu bazlı reaktiflerin kullanımı için optimizasyon hususlarını kullanan Yinelemeli Ağartma Çokluğu Uzatır (IBEX) yönteminin uygulamasını açıklıyoruz.

Yinelemeli Ağartma, Çekirdek Tesisler için Boyama Otomasyonu Kullanımıyla Çeşitliliği Artırıyor

Çoklu immünoflüoresans, doku mimarisi ve hücre popülasyonlarının mekansal analizini desteklemek için tek bir doku bölümünde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak etiketlenmesini sağlar. Burada, yaşlanma ile ilişkili, yapısal ve bağışıklık belirteçlerinin çoklu algılanması için manuel ve otomatik slayt hazırlığı, yinelemeli görüntüleme ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak tek hücre analizi dahil olmak üzere bir iş akışı sunulmaktadır.

Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi

Öğrenin, çoklu floresan immünohistokimya ile formalin sabitlenmiş parafin gömülü dokularda hücre türlerini ve uzamsal ilişkileri görüntüleyin. Bu yöntem, tümör mikroçevresindeki bağışıklık ve kanser hücre etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.

Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar

Daha fazla video keşfet