Name: Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Keşfedin, yoğunluk gradient katmanlı polimerizasyonu (DGMP) yöntemiyle çok katmanlı hücre kültürü iskeleleri oluşturmayı. Bu teknik, C2C12 hücreleri üzerinde büyüme ve tutunmayı incelemek için uygun maliyetli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar NIH Müdür&#39;ün Yeni Yenilikçi Ödülleri (1DP2 OD006499-01 AA ve 1DP2 AJE için OD006460-01) destek ve Bilim ve Teknoloji (Nanotıp Mükemmellik UC San Diego Merkezi) King Abdulaziz City için minnettarız. Biz el yazması onu eleştirel yorumlar için Bayan Jessica Moore teşekkür etmek istiyorum.

1. Floresan etiketli akriloil-PEG-RGDS sentezi <ol><li> , Oda sıcaklığında, argon altında, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.2:1:2 molar oranda ve NN diizopropiletilamin (DIPEA): akriloil-PEG-karboksimetil süksinimidil ester (3400 g / mol aPEG-SCM, PEG MW) RGDS peptid React gecede. </li><li> Uçuş matriks destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zamanı (MALDI-TOF) kütle spektrometresi ile konjugasyon onaylayın. MALDI hedef ve kuru bir örnek nokta aPEG-Rgds Reaksiyon çözeltisi 1 ul ekleyin. Üniversal MALDI tetrahidrofuran Matris (THF) ve 1 dakika süreyle girdap doymuş bir çözeltisi hazırlayın. Aynı örnek nokta bu çözüm ~ 1 ul ekleyin. Karşılaştırma için aPEG-SCM için prosedürü tekrarlayın. Yük ve analiz. APEG-Rgds molekül ağırlığı aPEG-SCM (Şekil 2) fazla olmalıdır. </li><li> Florofor olarak konjuge edifmesi için, çözülmüş Alexa Fluor 350 karboksilik asit (succinimydyl ester) bir eşit mol miktarı eklemekDMSO en az bir hacim içinde, 1.1 &#39;dan aPEG-RGDS reaksiyon çözeltisi ile ve gece boyunca oda sıcaklığında, argon altında reaksiyona girerler. </li><li> Günde en az iki kez diyalizat değişimi, 1.000:1 hacimsel oranı az 48 saat süreyle 4 ° C&#39;de DI-H 2 O karşı (MW 3500 Da) diyaliz tarafından aPEG-Rgds-350 arındırın. </li><li> Saflaştırılmış bir Labconco Freezone Plus veya eşdeğer bir dondurma kuru sisteminde aPEG-Rgds-350 ve -20 ° C&#39;de mağaza kuru dondurun </li></ol> 2. Rgds-350 Katmanlar Alternatif bir 2D PEG Jel bir 2D Kalıp ve İmalat hazırlanması <ol><li> Hidrofobik cam slaytlar hazırlayın. Bir vakumlu fırın içinde bir cam tabak içine temiz cam slaytlar yerleştirin. Isı 80 ° C&#39;de 30 dakika süre ile tamamen yüzeyler kuru. Sıra bir davlumbaz slaytlar ile çanak ve hafifçe kat tüm yüzeyine 30 sn sallanan, her slayt için 250 ul Sigmacote ekleyin. İyice açılacak en az 5 dakika süreyle iki defa ıslatma, distile su ile yıkama, ardından% 100 metanol ile kaplanmış slaytlara durulamat 10 ml. </li><li> 10 mm biyopsi yumruklar ile silikon parçaları (0.8 mm kalınlığında) kesin. </li><li> Silikon spacers ve Sigmacote işlenmiş cam slaytlar otoklavlayınız. </li><li> Karıştırma PEG diakrilat (PEGda) tarafından ayrı mikrofüj tüpler içinde her bir katman için ilgili çözümler formüle öncü (son konsantrasyon% 15 w / v) ve değişen nihai konsantrasyonlarda (örneğin,% 40 verim ile iodixanol farklı miktarlarda (su içinde% 60 stok çözelti) ile % 30,% 20 ve% 10), fosfat ile takviye dereceli kalan hacim yoğunlukları çözeltileri elde etmek için (PBS) ile tamponlu salin. Benzer bir tarzda, alternatif tabakalar için, iodixanol ve PBS ile bir karışımı aPEG-RGDS-350 (nihai konsantrasyon 8 mM), çeşitli konsantrasyonlarda (örneğin,% 35,% 25 ve% 15) elde edildi. </li><li> Çeşitli tabakalar (her bir katman, bir ml solüsyon başına stok solüsyonu 10 ul) için her bir çözeltisi (2-Hidroksi-4&#39;-(2-hidroksietoksi)-2-methylpropiophenone, N-vinil pirolidon içinde stok 333mg/ml) foto başlatıcı ekleyin. Photoinitiator is ışığa karşı hassas olduğu için, kalıp jellerin katmanlama önce polimerizasyonu önlemek için son eklenen. </li><li> Bu protokolün sonraki adımları kısırlık sağlamak için bir biyogüvenlik kabini yapılacaktır. </li><li> Steril 1 ml şırınga ve 0.2 mikron filtre kullanarak her çözüm filtre sterilize. İki Sigmacore işlenmiş cam slaytlar ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi yerleştirerek kelepçeler ile güvenli arasındaki boşluk sandwiching tarafından kalıp kurulum birleştirin. </li><li> Daha az yoğun bir çözelti (% 35 iodixanol örn. aPEG-RGDS-350) ve ardından en yoğun çözelti (% 40 iodixanol örn. PEGda) ilk olarak, ekleme tarafından katmanlı jel döküm. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, istenen bileşim ve yoğunluklarda çeşitli katmanları elde etmek için alternatif katman tekrarlayın. </li><li> Bir taşınabilir UVR-9000, lamba kullanarak, 3 dakika için 365 nm ışık ile kalıp saçmak. Polimerize jeller 5 dakika dinlenmeye bırakılmalıdır. Kelepçeleri çıkarın, sonra yavaşça üst camı kaldırınslayt ve kalıp; tabakalı DGMP jeller slaytlar üzerinde kalacaktır. Steril bir spatula kullanarak, dikkatli steril PBS veya yıkama için kültür ortamı içeren 50 ml&#39;lik bir tüp jel yerleştirin. </li><li> Yoğunluk değiştirici, photoinitiator ve reaksiyona girmemiş polimerleri kaldırmak için günde en az iki kez tampon değişimi, 1.000:1 hacimsel oranında PBS içinde polimerize jeller yıkayın. Alternatif olarak, PBS hücre büyüme ortamı ile değiştirilebilir. PBS veya Adım 3 de ana hatları hücre kültürü deneyi için büyüme ortamında DGMP jeller saklayın. </li><li> Alternatif katmanları görselleştirmek için bir VersaDoc jel dokümantasyon birimi örnek tepsi üzerinde bir cetvel boyunca DGMP jel (bu jelleri hücre kültürü için kullanışlı olmayacaktır) ayarlayabilir. 350 nm de jeller Açığa, maruz kalma süresi fluorofor konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. DGMP hidrojel karanlık ve mavi şeritler farklı kimyasal bileşimi (Şekil 3) ayrık tabakalarının oluşumu göstermektedir. </li></ol><ol><li> RGDS peptid içeren jeller için, bu tür C2C12 iskelet hücreleri gibi bağımlı yapışma hücreleri kullanılır. </li><li> Yavaşça bir biyogüvenlik kabini içinde steril bir hücre kazıyıcı kullanarak 48-iyi hücre kültürü tabak kuyulara DGMP jeller (PBS içinde saklanan) takın. </li><li> Ön-ılık büyüme ortamı (Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle ortamı ya da DMEM,% 10 v / v cenin sığır serumu ve% 1 v / v 100x penisilin-streptomisin ile takviye çözelti) ve 37 olarak ayarlanmış bir su banyosu içinde PBS ° C. </li><li> PBS ile C2C12 hücreleri üç kez 60% konfluent plakası (10 mm) yıkayın. % 0.25 tripsin-EDTA, 1 ml ekleme ve 2 dk için 37 ° C &#39;de kuluçkaya alarak PBS ve hasat hücrelerini aspire. Büyüme ortamı ve hücre sayımı hücrelerin yeniden süspanse edin. Tohum DGMP jel içeren C2C12 miyoblastları (20,000 hücre / cm 2) ile iyi bir hücre kültürü. % 5 CO2 /% 95 bağıl nem altında 37 ° C &#39;de hücreler inkübe edin. Dikkatli 4 saat sonra yavaşça döviz orta, yeniden değilhafifçe yapıştırılmış hücreleri hareket. </li><li> 24 saat sonra, DGMP jel RGDS içeren katmanların C2C12 miyoblastları eki Epifloresans ile faz kontrast mikroskop (Zeiss Axiovert 200) ile teyit edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li>
<li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li>
<li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li>
<li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly%28ethylene+glycol%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li>
<li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li>
<li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft%2C+Bilayered+Drosophila+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)"> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek çakışan çıkarları var.

DGMP pahalı aletlerle dayanmaz katmanlı jeller hazırlamak için basit bir stratejidir. Bu protokol, kollajen ve hyaluronik asit gibi diğer biyolojik olarak uyumlu malzemeler kullanılarak, iskeleler oluşturmak için adapte edilebilir. Tabakalar arasındaki kuyruklarının karıştırma önlemek için Biyoaktif küçük moleküller, örneğin, hücre yapışma arttırıcı RGDS peptid, polimer matris için gergin edilebilir. Bunlar, matris ağ boyutuna bağlı olarak, hidrojeller ile 10 arasındaki yaymak için daha az eğilimli olduğunu Proteinler kimyasal konjugasyon için gerek kalmadan farklı katmanlar halinde yerleştirilebilir. Burada iodixanol (Nycoprep), önceden canlı hücre uygulamalar için tercih edilen bir atıl yoğunluk değiştirici kullanılmaktadır. Sukroz ve glukoz gibi diğer yoğunluk değiştiriciler de kullanılabilir. Yerleşme zamanı (t s) değiştirerek, bir ihtiyaç olarak iki katman arasındaki arabirimleri (uzun yerleşme zamanı yumuşak geçişler verir) yumuşak veya keskin geçişler üretmek için ince ayar yapabilirsiniz &lt;&gt; 10 sup. Örneğin, DGMP jel tabakalar arasında yumuşak geçiş örneğin kemotaksisi gibi hücre çalışma süreçleri için bir biyolojik işaret sürekli bir gradyan oluşturmak için kullanılabilir. Jel üzerinde yoğunluk sertlik değiştirici etkileri bir% 15 jel aPEGda için, Şekil 5&#39;te gösterilmiştir; PEGda ve iodixanol konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak sertlik ve gözeneklilik daha ayrıntılı bir tanımlama şu anda değerlendirilmektedir. Bu örnekte PEGda konsantrasyonu nispeten yüksek olsa da, bu olmadan jel ile karşılaştırıldığında% 30 iodixanol ile jeller içinde% 60 daha fazla elastik modül görülmektedir. Jel sertlik değişim modüle makromer konsantrasyon veya çapraz bağ yoğunluğu için ayarlanabilir. Biz de poliakrilamid ve PEG öncüleri 10 kullanarak 3D katmanlı jeller oluşturmak için DGMP tekniği uyguladık. Konsantrasyon veya prepolimerin çapraz bağlanma derecesi değişen sağlayan yapısal varyasyon3D polarize büyüme ve göç gibi hücre davranışlarını incelemek için kullanılabilir iskelelerinin. Özet olarak, DGMP biyomedikal ve temel araştırmalar, geniş bir uygulama yelpazesi için biyo-uyumlu malzemeler çeşitli 2D ile 3D iskelelerinin üretmek için uygulanabilir bir uyarlanabilir bir tekniktir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya Enstrüman </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Polietilen glikol succinimydyl karboksimetil (a-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene glikol diacrylate (PEGda) </td><td> Dajac Labs </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> Arginin-glisin-Aspartik asit-serin (RGDS) </td><td> Amerikan Peptid </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - Diisopropiletilamin (DIPEA) </td><td> Sigma </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimetilformamid (DMF) </td><td> Balıkçı </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofuran (THF) </td><td> Balıkçı </td><td> T397 </td></tr><tr><td> Diyaliz kaset (3500Da) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 karboksilik asit ester succinimydyl </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> Silikon tutucular </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> Biyopsi yumruklar </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 mm) P850 (8 mm) </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun fosfat (DPBS) tamponlu salin </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> Balıkçı </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2-Hidroksi-4&#39;-(2-hidroksietoksi)-2-methylpropiophenone </td><td> Sigma </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> C2C12 miyoblastları </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> Bio-Rad </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

yoğunluk gradient katmanlı polimerizasyonu (dgmp): multi-bölmesi oluşturma için a novel tekniği, doku mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Türleri ve biyolojik uyarıcı (örneğin büyüme faktörleri, inhibitörler, veya küçük molekül) veya matris yapısı konsantrasyonları (örneğin, matris bileşimi, konsantrasyonu ya da sertliği), uzay içinde değişebilir olan kompleks doku kültürü matrisler araştırmalar geniş bir yelpazede izin verecek Bu değişkenler hücre farklılaşmasını, göç ve diğer fenomenler nasıl etkilediğini ilgili. Katmanlı matrisler yaratmada önemli bir sorun her katman 1 tek tek bileşenlerin difüzyon olmadan katman arayüzleri yapısal bütünlüğünü muhafaza edilir. Bunu başarmak için, Mevcut metodolojiler photopatterning 2-3, litografi 4, sıralı functionalization5, 6 dondurularak kurutulur, ve arayüz 7, ya da hangi birçok gelişmiş enstrümantasyon ve teknik beceri gerektiren santrifüj 8, içerir. Diğer katmanlar 9 delaminasyon yol açabilir bireysel katmanların, sıralı eki güveniyor </&gt; sup. DGMP yoğunlukları 10 değişik katmanları oluşturmak için böyle iodixanol gibi inert bir yoğunluk değiştirici kullanarak bu sorunların üstesinden. Yoğunluk değiştirici herhangi prepolimer ya da biyolojik olarak aktif molekül ile karışabilir olduğundan, DGMP her bir iskele katman özel izin verir. Bunlar sulu kalırken Bunun için yoğunluk değiştiricisi yoğunluğunu çeşitlendirerek bitişik tabakaların karıştırma önler. Müteakip tek adım polimerizasyon her katmanı ayrı kimyasal ve mekanik özelliklere sahip olduğu yapısal olarak sürekli katmanlı iskele, yol açmaktadır. Yoğunluk değiştirici kolaylıkla tek tek katmanları ya da bunların bileşenleri karışıklık olmadan yeterli çalkalama ile temizlenebilir. Bu teknik, bu nedenle de çeşitli boyutlarda, şekiller ve malzemelerin hidrojeller oluşturmak için uygundur. Alternatif tabakalar RGDS-350 dahil edildiği bir 2D-polietilen glikol (PEG) jel, imalatı için bir protokol aşağıda verilmiştir. Biz PEG b kullanınbu biyouyumlu ve hareketsizdir ecause. Rgds, bir hücre adezyon peptid 11, biyolojik bir işaret mekansal kısıtlama göstermek için kullanılan ve bir fluorofor (Alexa Fluor 350) konjugasyon bize görsel çeşitli katmanlarını ayırt etmek mümkün kılınmaktadır. Bu işlem diğer malzemeler için adapte edilebilir (örneğin kollajen, hyaluronan, vb) ve 10 bazı değişiklikler ile 3D jeller imal uzatılabilir.

MALDI-TOF analiz akriloil-PEG RGDS peptid (Şekil 2) birleşme teyit etmektedir. Jel görüntüleme fotopolimerizasyon (Şekil 3A) sonra Rgds-350 (mavi) katmanlar ortaya koymaktadır. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, 2B DGMP jel boyut silikon kalıp (sol 10 mm, 8 mm, sağ) çapına göre değişebilir, ve bu nedenle birden fazla tahlillerde kullanım için kolayca özelleştirilebilir - bu durumda uygun bir 48. iyi hücre kültür plakasına (Şekil 3B). Epifloresans ve bir DGMP jel üzerinde kültive C2C12 miyoblastları faz kontrast mikroskop üzerinde seçici bağlanma gösteren RGDS-350-ihtiva eden hücre yapışması peptid (RGDS) arasında bölmelere gösteren PEG analiz edilmiştir (Şekil 4). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> Şekil 1. Moleküler weigMALDI-TOF RGDS peptid birleşme sonrası elde edilen aPEG-RGDS ile aPEG-SCM karşılaştırarak HT analizi. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> Şekil 2. DGMP jel üretim şematik gösterimi. Gradyanlar katmanlı sonra, fotopolimerizasyon ardından mezun arabirimleri oluşturmak için zaman dönemleri (t s) değişen yerleşmek için izin verilebilir. Tabakalı DGMP jeller kolayca daha fazla kullanım için kalıp elde edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Fotopolimerizasyon sonra elde A) 2D katmanlı jeller 350 nm ve Versa beyaz ışık kanalları kullanarak görüntülendiDoktor jel dokümantasyon birimi. Görüntü. B) DGMP jel yerleştirilmesi 48-iyi hücre kültür kaplarına beyaz Rgds içeren katmanlar alternatif ortaya tonlamalı. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Birleştirilmiş faz kontrast ve DGMP jeller (ölçek çubuğu 50 mikron) yetiştirilen C2C12 miyoblastları arasında Epifloresans görüntü. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5,. 2 nN kuvvet tetik 12 ile daha önce kurulan yöntemler kullanarak çapraz PEG substratların statik örneklerinin jel yüzey esnekliğinden iodixanol Etkisi. Atomik kuvvet mikroskobu ölçümleri. * P &lt;0.05 ve ** p &lt;0.01.

Burada doku mühendisliği için farklı katmanları arasında sürekli arabirimleri ile biyouyumlu, katmanlı matrisler oluşturmak için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Böyle bir iskele çeşitli biyolojik, kimyasal ya da mekanik yardımlar yaparak hücre davranışı modüle ideal özelleştirilebilir ortamı sağlayabilir

Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Bu prosedürün genel amacı, çok katmanlı bir hücre kültürü iskelesi oluşturmaktır. Bu video, yapışma peptidi RGDS'yi C iki C 12 hücresinin ayrı bölgelerine alternatif katmanlarda dahil eden bir 2D hücre kültürü matrisinin nasıl üretileceğini gösterecektir. Bu, ilk olarak RGDS peptidinin akro sadık bir makroya bağlanmasıyla gerçekleştirilir.Makro peptit kombinasyonu daha sonra çok katmanlı jellerin katmanlarını içeren peptitin görselleştirilmesine izin vermek için LOR boyası ile etiketlenir. İkinci adım, kalıpları bir silikon levhadan keserek ve premden sonraki iki cam slayt arasına sıkıştırarak, her katmanın ayrı bileşenlerini karıştırarak oluşturmaktır. PEG RGDS Alexa three 50 ile peg di acrl ve peg di acrl çözeltileri alternatif olarak kalıpların içine katmanlanır.Jeller UV ışınlaması ile polimerize edilir. Son adım, matris bileşiminin hücrelerin büyümesini ve bağlanmasını nasıl etkilediğini incelemek için C iki C 12 hücresini 2D çok katmanlı jeller üzerine tohumlamaktır. Sonuç olarak, iskeleler üzerindeki C iki C 12 hücresinin seçici büyümesini görselleştirmek için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çok katmanlı 2B ve 3B hücre kültürü matrisleri oluşturmak için basit ve uygun maliyetli bir yöntem olmasıdır. Pahalı enstrümantasyon ihtiyacına dayanmaz. Katmanlar arasındaki arayüzler bitişik ve yapısal olarak ayrılmaz iken.Tek tek katmanların bileşenleri arasında karışım yoktur. Bu yöntem, hücrelerin desenli biyolojik, kimyasal ve mekanik ipuçlarına yanıt olarak nasıl göç ettiği ve polarize olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, hücre göçü ve farklılaşması hakkında nazik bir içgörü sağlayabilir ve nöronal kök hücrelerin yeni doğru büyümesi ve sinaptogenezinin yönlendirilmesi gibi diğer sistemlere uygulanabilir.Bu prosedüre başlamak için, RGDS peptidini ve akro yağı peg süksinil karbo metil esteri Argonne altında kuru DMSO'da bir ila iki ila bir molar oranda birleştirin. Daha sonra, reaksiyonu kolaylaştırmaya yardımcı olmak için aquilo PEG SCM'ye göre iki ila bir molar oranda NN diop, propil metilamin veya D-I-P-E-A ekleyin, küflü TOF kütle spektrometresi kullanarak aquilo PEG RGDS molekülünün konjugasyonunu onaylayın. Bunun için ayrı ayrı, küflü hedef üzerindeki farklı noktalara bir mikrolitre AQUILO PEG RGDS reaksiyon çözeltisi ve bir mikrolitre reaktif olmayan aquilo PEG SCM ekleyin.İkisinin de kurumasını bekleyin. Daha sonra THF girdabında bir dakika boyunca doymuş bir evrensel küflü matris çözeltisi hazırlayın ve aynı iki noktaya bir mikrolitre ekleyin. İkisinin de kurumasını bekleyin.Ardından, örnekleri yükleyin. SAVIS gole yumuşatma, silindir şapka, taban çizgisi çıkarma ve OID tepe algılama algoritmalarını kullanarak yaklaşık %19 güçte 60 hertz lazerle küflü zorlu analizler gerçekleştirin. Akro PEG RGDS'nin moleküler ağırlığı, kovalent olarak bağlı peptitten kaynaklanan kütle değişikliğine karşılık gelecek şekilde sağa kaydırılmalıdır.Bir sonraki adım, eşmolar miktarda LOR üç 50 karboksilik asit ekleyerek, minimum hacimde DMSO'da çözünen aquilo PEG SCM'ye göre bir midal ester içinde emilen Fluor'u konjuge etmektir, aquilo PEG RGDS reaksiyon çözeltisine argon altında, gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, 3.500 DAU moleküler ağırlıklı kesme diyaliz kaseti kullanarak dört santigrat derecede boya suyuna karşı diyalize girerek acro yağ peg RGD S3 50'yi saflaştırın. 1001 hacimsel oran kullanarak 48 saat diyalize devam edin, günde en az iki kez soğuk diyalizat değiştirin.Ürün, 0.22 mikron şırınga filtresi ile filtre sterilizasyonu ile daha da saflaştırılır. Son olarak, steril bir ortamda, steril saflaştırılmış akro yağ mandalı RGD S3 50'yi steril önceden ağırlıklı mikro santrifüj tüplerine alın. Açık mikro santrifüj tüplerini steril havalandırma tüpü içinde kapatın.Numuneleri dondurarak kurutun ve her biri eksi 20 santigrat derecede parafin film ile kapatılmış olarak saklayın. Ön yıkama slaytları %100 metanolde doldurun ve sıvı buharlaşana kadar 80 santigrat derece fırında kurutun. Daha sonra cam slaytları içeren bir tabağı çeker ocak içine yerleştirin ve her slayta 250 mikrolitre sigma coat ekleyin.Tüm yüzeyi kaplamak için slaytları 30 saniye boyunca hafifçe sallayın. Daha sonra, kaplanmış slaytları %100 metanol ile iyice durulayın, ardından yıkama ve damıtılmış su ile en az 10 mililitre suya iki kez beş dakika batırın. Durulandıktan sonra slaytların kurumasını bekleyin.Bir silikon tabakasını cam slaytlarla aynı boyutlarda keserek 0,8 milimetre kalınlığında silikon boşluklar hazırlayın. Daha sonra biyopsi zımbaları kullanarak, bir tıraş bıçağı kullanarak iskeleleri tutmak için silikonda 10 milimetre veya sekiz milimetre delikler açın. İskele malzemesinin eklenmesine izin vermek için kalıbın üst kısmında yaklaşık iki milimetre kanal açın.Daha sonra silikon boşlukları ve sigma kaplama ile işlenmiş cam slaytları sterilize etmek için otoklavlayın. Ayrıca, einor tüpleri ve forseps gibi jelleri dökmek için ek malzemeleri sterilize edin. Bir doku kültürü davlumbaz filtresinde, steril bir mililitrelik şırınga ve 0.2 mikron filtre kullanarak bir stok Peg di aquil solüsyonunu sterilize edin.%50 PEG D acr'ı farklı miktarlarda steril %60 IO DAL stok çözeltisi PBS ve foto başlatıcı ile birleştirerek ayrı kehribar mikro atık tüplerinde her bir ilgili katman için ağırlık/hacim oranında %15 ağırlık/hacim oranında PEG pre polimer çözeltilerini formüle ederek başlayın, %10 %20%30 ve %40 I'lik değişen nihai konsantrasyonları elde etmek için solüsyonları iyice karıştırın Floresan etiketli %15 PEG pre polimer çözeltisini hazırlamak için çözeltileri iyice karıştırın, % 15,% 25 ve% 35 IO IAL konsantrasyonları elde etmek için% 50 PEG di aquil ve aquilo PEG RGD S3 50'yi sekiz milimolar nihai konsantrasyonda IO Dal stok çözeltisi PBS ve kehribar Microview tüplerinde foto başlatıcı ile birleştirin ve çözeltileri iyice karıştırın. Ardından, iki sigma co ile işlenmiş cam kızak arasına önceden kesilmiş bir ara parça yerleştirerek kalıp kurulumunu birleştirin ve kelepçelerle sabitleyin. Kalıp monte edildikten sonra, önce 10 mikrolitre %40'lık çözelti ve ardından floresan etiketli %35'lik çözeltiden 10 mikrolitre ekleyerek katmanlı bir jel dökün.Birkaç katman elde etmek için alternatif katmanlamayı tekrarlayın. Ardından, kalıbı üç dakika boyunca 365 nanometre ışıkla ışınlayın. Taşınabilir bir UVR 9.000 lamba kullanarak, polimerize hidrojellerin beş dakika boyunca kürlenmesine izin verin.Ardından kelepçeleri çıkarın ve üst cam sürgüyü ve kalıbı yavaşça kaldırın. Tabakalı yoğunluk gradyanı. Çok serilmiş polimerizasyon veya DG MP jeller slaytlar üzerinde kalacaktır.Steril bir spatula kullanarak, jelleri kalıptan dikkatlice çıkarın ve steril DMEM içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Polimerize jelleri, günde iki tampon değişimi ile 48 saat boyunca 1000 ila bir hacimsel DMEM oranı kullanarak yıkayın. Bu, herhangi bir yoğunluğu, değiştiriciyi, foto başlatıcıyı ve reaksiyon pre polimerini kaldıracaktır.Daha sonra DGMP jellerini% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de saklayın. Alternatif katmanları görselleştirmek için, DGMP jeli bir jel dokümantasyon ünitesinin numune tepsisindeki bir cetvel boyunca yerleştirin. Ardından, DGMP hidrojelde Alexa üç 50 alternatif koyu ve mavi bant kullanarak jelleri açığa çıkarın ve görüntüleyin, farklı kimyasal bileşime sahip gizli katmanların oluşumunu gösterir.DGMP jellerini hücre kültürü için hazırlamak için, bunları yavaşça 48 oyuklu bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarına yerleştirin. Steril bir hücre kazıyıcı kullanarak ve hücre kültürü ortamında üç kez durulayın. Daha sonra, 100 milimetrelik bir hücre kültürü plakasından C iki C 12 miyoblastını% 60 birleştiğinde hasat edin.Bunu yapmak için, plakayı ön ısıtma PBS ile üç kez durulayın. Daha sonra EDTA'ya bir mililitre% 0.25 ekleyin ve plakayı iki dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, bir mililitre ön ısıtma kültür ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Hücreler peletlendikten sonra Reeses, onları büyüme ortamında kaleme alın ve triam mavisi ekleyerek ve bir TC 10 hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. Daha sonra DG MP iskelesini C iki C 12 miyoblast ile tohumlayın ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Epi floresan ve faz kontrast mikroskobu kullanarak DGMP jel katmanları içeren RGDS üzerine C iki C 12 miyoblastının bağlandığını onaylayın.DGMP jellerinin alternatif katmanları, hücresel bağlanmayı ve büyümeyi destekleyen sağda gösterilen RGDS gibi çeşitli peptitler içerebilir. Bununla birlikte, soldaki tabaka herhangi bir hücresel bağlanma peptidi içermiyordu ve hücreler o bölgede hayatta kalamadı. IO diol jel sertliğini etkileyebilir.Burada, elastik modül atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak ölçüldü. Bu jel formülasyonunda %30 IAL kullanıldığında sertlikte %60'lık bir artış görülmüştür, IAL'nin jel sertliği üzerindeki etkisi kullanılan malzemelere bağlı olarak değişebilir Bu prosedürü denerken, katmanların sırasını hatırlamak önemlidir. En yüksek miktarda IEX null içeren katman en altta, en az miktarda IEX null içeren katman ise en üstte olacaktır.Ortam ışığından polimerizasyonu önlemek için her zaman fotoğraf başlatıcıyı sonuna eklemeyi unutmayın. İşbirlikçilerimizle birlikte, nörit büyümesini 3D olarak organize etmek için bu tekniği uyarlıyoruz. Bu, sağlıklı bireylerden türetilen nöro progenitör hücrelerin ve nörogelişimsel bozukluğu olan hastalardan elde edilen hücrelerin karşılaştırılmasına izin verecektir.Ultraviyole ışıkla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Çapraz bağlama adımını gerçekleştirirken UV koruyucu gözlük takın.

density-gradient-multilayered-polymerization-dgmp-novel-technique-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Elektrospinning iskelelerinin doku mühendisliği uygulamaları için post prodüksiyon işlenebilir. Burada kısırlık (aseptik üretim veya sterilizasyon post prodüksiyon) ulaşmak için ve uygun biyomekanik özellikleri elde etmek için, daha kalın iskeleleri (çoklu katman ısı kullanarak veya buhar tavlama ile) yapmak için, karmaşık iskeleleri (ardışık eğirme) eğirme yöntemleri açıklanmaktadır.

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Poli (gliserol-dodekanoat) adında yeni bir biyolojik polimerden bir yeni tasarlanmış toplayıcı aracılığıyla daha geniş bir alanı kapsayan mevduat electrospun uzun liflerin (PGD) Sentezi ve fabrikasyon bildirildi. Lifler fare pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücrelerin büyümesini desteklemek mümkün.

Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

Doku mühendisliği için iskeleler, hücresel nişin karmaşık biyokimyasal ve biyofiziksel mikro çevresini özetlemelidir. Burada, sürekli biyokimyasal salınımlı kompozit, çok bileşenli polimerik iskeleler oluşturmak için bir platform olarak arayüzey polielektrolit kompleksleştirme liflerinin kullanımını gösteriyoruz.

Biyomoleküllerin Geçici olarak Kontrollü Release için Yüzey Polielektrolit Elyaf Kompozit Yapı iskeleleri

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Bu çalışmada, eriyik karıştırma ve seçici liç kombinasyonu kullanılarak poli(laktik asit)/polietilen glikol (PLA/PEG) iskeleleri hazırlanmıştır. Burada tartışılan yöntem, hem gözenekliliği hem de gözenek boyutunu yüksek oranda kontrol ederek üç katmanlı iskelelerin geliştirilmesine izin verdi. Mekanik özellikler ayrıca fizyolojik bir ortamda da değerlendirildi.

Bir Facile ve çevre dostu Rota Kademeli Gözenek Boyutu Poli (Laktik Asit) iskeleleri imal etmek için

Bu rapor, biyolojik araştırmalar için mikroakışkan kanalları hücreler ve substratlarla doldurmak için düşük basınçlı vakum kullanan basit, uygulaması kolay bir tekniği açıklamaktadır.

Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Geçerli bilayer kültür modelleri içinde vivo microenvironments taklit fonksiyonel vitro çalışmalar için izin vermez. Polietilen glikol ve çinko oksit şablon oluşturma yöntemi kullanarak, bu iletişim kuralını geliştirme, bir ultrathin biomimetic membran tunable sertlik, porozite ve yakından vivo içinde taklit eden biyokimyasal kompozisyonu ile açıklanır hücre dışı matrisler.

Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre

Tamamlayıcı reaktif gruplara sahip mikrojel çubuklar, sulu çözeltide birbirine bağlanma kabiliyetine sahip mikroakışkanlar yoluyla üretilir. Anizometrik mikrojeller, küresel tabanlı sistemlere kıyasla daha büyük gözeneklere sahip kararlı yapılara sıkışır ve birbirine bağlanır. GRGDS-PC ile modifiye edilmiş mikrojeller, hücre kültürü için kullanılabilecek makrogözenekli 3D yapılar oluşturur.

Mikrojel Çubuklardan Birbirine Bağlı Makrogözenekli 3D İskeleler

Plaka üzerinde damar (VOP) olarak adlandırılan 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak standart altı oyuklu bir plaka üzerinde esnek boyutlara ve istenen desenlere sahip vasküler kanalların yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz. Bu platform, riskli endotel ile ilişkili bozukluklar için terapötiklerin geliştirilmesini ilerletme potansiyeline sahiptir.

Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

Keşfedin, yoğunluk gradient katmanlı polimerizasyonu (DGMP) yöntemiyle çok katmanlı hücre kültürü iskeleleri oluşturmayı. Bu teknik, C2C12 hücreleri üzerinde büyüme ve tutunmayı incelemek için uygun maliyetli bir yaklaşım sunar.

Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi (Video) | JoVE Journal

Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Daha fazla video keşfet