Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Bu prosedürün genel amacı, çok katmanlı bir hücre kültürü iskelesi oluşturmaktır. Bu video, yapışma peptidi RGDS'yi C iki C 12 hücresinin ayrı bölgelerine alternatif katmanlarda dahil eden bir 2D hücre kültürü matrisinin nasıl üretileceğini gösterecektir. Bu, ilk olarak RGDS peptidinin akro sadık bir makroya bağlanmasıyla gerçekleştirilir.

Makro peptit kombinasyonu daha sonra çok katmanlı jellerin katmanlarını içeren peptitin görselleştirilmesine izin vermek için LOR boyası ile etiketlenir. İkinci adım, kalıpları bir silikon levhadan keserek ve premden sonraki iki cam slayt arasına sıkıştırarak, her katmanın ayrı bileşenlerini karıştırarak oluşturmaktır. PEG RGDS Alexa three 50 ile peg di acrl ve peg di acrl çözeltileri alternatif olarak kalıpların içine katmanlanır.

Jeller UV ışınlaması ile polimerize edilir. Son adım, matris bileşiminin hücrelerin büyümesini ve bağlanmasını nasıl etkilediğini incelemek için C iki C 12 hücresini 2D çok katmanlı jeller üzerine tohumlamaktır. Sonuç olarak, iskeleler üzerindeki C iki C 12 hücresinin seçici büyümesini görselleştirmek için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çok katmanlı 2B ve 3B hücre kültürü matrisleri oluşturmak için basit ve uygun maliyetli bir yöntem olmasıdır. Pahalı enstrümantasyon ihtiyacına dayanmaz. Katmanlar arasındaki arayüzler bitişik ve yapısal olarak ayrılmaz iken.

Tek tek katmanların bileşenleri arasında karışım yoktur. Bu yöntem, hücrelerin desenli biyolojik, kimyasal ve mekanik ipuçlarına yanıt olarak nasıl göç ettiği ve polarize olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, hücre göçü ve farklılaşması hakkında nazik bir içgörü sağlayabilir ve nöronal kök hücrelerin yeni doğru büyümesi ve sinaptogenezinin yönlendirilmesi gibi diğer sistemlere uygulanabilir.

Bu prosedüre başlamak için, RGDS peptidini ve akro yağı peg süksinil karbo metil esteri Argonne altında kuru DMSO'da bir ila iki ila bir molar oranda birleştirin. Daha sonra, reaksiyonu kolaylaştırmaya yardımcı olmak için aquilo PEG SCM'ye göre iki ila bir molar oranda NN diop, propil metilamin veya D-I-P-E-A ekleyin, küflü TOF kütle spektrometresi kullanarak aquilo PEG RGDS molekülünün konjugasyonunu onaylayın. Bunun için ayrı ayrı, küflü hedef üzerindeki farklı noktalara bir mikrolitre AQUILO PEG RGDS reaksiyon çözeltisi ve bir mikrolitre reaktif olmayan aquilo PEG SCM ekleyin.

İkisinin de kurumasını bekleyin. Daha sonra THF girdabında bir dakika boyunca doymuş bir evrensel küflü matris çözeltisi hazırlayın ve aynı iki noktaya bir mikrolitre ekleyin. İkisinin de kurumasını bekleyin.

Ardından, örnekleri yükleyin. SAVIS gole yumuşatma, silindir şapka, taban çizgisi çıkarma ve OID tepe algılama algoritmalarını kullanarak yaklaşık %19 güçte 60 hertz lazerle küflü zorlu analizler gerçekleştirin. Akro PEG RGDS'nin moleküler ağırlığı, kovalent olarak bağlı peptitten kaynaklanan kütle değişikliğine karşılık gelecek şekilde sağa kaydırılmalıdır.

Bir sonraki adım, eşmolar miktarda LOR üç 50 karboksilik asit ekleyerek, minimum hacimde DMSO'da çözünen aquilo PEG SCM'ye göre bir midal ester içinde emilen Fluor'u konjuge etmektir, aquilo PEG RGDS reaksiyon çözeltisine argon altında, gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, 3.500 DAU moleküler ağırlıklı kesme diyaliz kaseti kullanarak dört santigrat derecede boya suyuna karşı diyalize girerek acro yağ peg RGD S3 50'yi saflaştırın. 1001 hacimsel oran kullanarak 48 saat diyalize devam edin, günde en az iki kez soğuk diyalizat değiştirin.

Ürün, 0.22 mikron şırınga filtresi ile filtre sterilizasyonu ile daha da saflaştırılır. Son olarak, steril bir ortamda, steril saflaştırılmış akro yağ mandalı RGD S3 50'yi steril önceden ağırlıklı mikro santrifüj tüplerine alın. Açık mikro santrifüj tüplerini steril havalandırma tüpü içinde kapatın.

Numuneleri dondurarak kurutun ve her biri eksi 20 santigrat derecede parafin film ile kapatılmış olarak saklayın. Ön yıkama slaytları %100 metanolde doldurun ve sıvı buharlaşana kadar 80 santigrat derece fırında kurutun. Daha sonra cam slaytları içeren bir tabağı çeker ocak içine yerleştirin ve her slayta 250 mikrolitre sigma coat ekleyin.

Tüm yüzeyi kaplamak için slaytları 30 saniye boyunca hafifçe sallayın. Daha sonra, kaplanmış slaytları %100 metanol ile iyice durulayın, ardından yıkama ve damıtılmış su ile en az 10 mililitre suya iki kez beş dakika batırın. Durulandıktan sonra slaytların kurumasını bekleyin.

Bir silikon tabakasını cam slaytlarla aynı boyutlarda keserek 0,8 milimetre kalınlığında silikon boşluklar hazırlayın. Daha sonra biyopsi zımbaları kullanarak, bir tıraş bıçağı kullanarak iskeleleri tutmak için silikonda 10 milimetre veya sekiz milimetre delikler açın. İskele malzemesinin eklenmesine izin vermek için kalıbın üst kısmında yaklaşık iki milimetre kanal açın.

Daha sonra silikon boşlukları ve sigma kaplama ile işlenmiş cam slaytları sterilize etmek için otoklavlayın. Ayrıca, einor tüpleri ve forseps gibi jelleri dökmek için ek malzemeleri sterilize edin. Bir doku kültürü davlumbaz filtresinde, steril bir mililitrelik şırınga ve 0.2 mikron filtre kullanarak bir stok Peg di aquil solüsyonunu sterilize edin.

%50 PEG D acr'ı farklı miktarlarda steril %60 IO DAL stok çözeltisi PBS ve foto başlatıcı ile birleştirerek ayrı kehribar mikro atık tüplerinde her bir ilgili katman için ağırlık/hacim oranında %15 ağırlık/hacim oranında PEG pre polimer çözeltilerini formüle ederek başlayın, %10 %20%30 ve %40 I'lik değişen nihai konsantrasyonları elde etmek için solüsyonları iyice karıştırın Floresan etiketli %15 PEG pre polimer çözeltisini hazırlamak için çözeltileri iyice karıştırın, % 15,% 25 ve% 35 IO IAL konsantrasyonları elde etmek için% 50 PEG di aquil ve aquilo PEG RGD S3 50'yi sekiz milimolar nihai konsantrasyonda IO Dal stok çözeltisi PBS ve kehribar Microview tüplerinde foto başlatıcı ile birleştirin ve çözeltileri iyice karıştırın. Ardından, iki sigma co ile işlenmiş cam kızak arasına önceden kesilmiş bir ara parça yerleştirerek kalıp kurulumunu birleştirin ve kelepçelerle sabitleyin. Kalıp monte edildikten sonra, önce 10 mikrolitre %40'lık çözelti ve ardından floresan etiketli %35'lik çözeltiden 10 mikrolitre ekleyerek katmanlı bir jel dökün.

Birkaç katman elde etmek için alternatif katmanlamayı tekrarlayın. Ardından, kalıbı üç dakika boyunca 365 nanometre ışıkla ışınlayın. Taşınabilir bir UVR 9.000 lamba kullanarak, polimerize hidrojellerin beş dakika boyunca kürlenmesine izin verin.

Ardından kelepçeleri çıkarın ve üst cam sürgüyü ve kalıbı yavaşça kaldırın. Tabakalı yoğunluk gradyanı. Çok serilmiş polimerizasyon veya DG MP jeller slaytlar üzerinde kalacaktır.

Steril bir spatula kullanarak, jelleri kalıptan dikkatlice çıkarın ve steril DMEM içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Polimerize jelleri, günde iki tampon değişimi ile 48 saat boyunca 1000 ila bir hacimsel DMEM oranı kullanarak yıkayın. Bu, herhangi bir yoğunluğu, değiştiriciyi, foto başlatıcıyı ve reaksiyon pre polimerini kaldıracaktır.

Daha sonra DGMP jellerini% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de saklayın. Alternatif katmanları görselleştirmek için, DGMP jeli bir jel dokümantasyon ünitesinin numune tepsisindeki bir cetvel boyunca yerleştirin. Ardından, DGMP hidrojelde Alexa üç 50 alternatif koyu ve mavi bant kullanarak jelleri açığa çıkarın ve görüntüleyin, farklı kimyasal bileşime sahip gizli katmanların oluşumunu gösterir.

DGMP jellerini hücre kültürü için hazırlamak için, bunları yavaşça 48 oyuklu bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarına yerleştirin. Steril bir hücre kazıyıcı kullanarak ve hücre kültürü ortamında üç kez durulayın. Daha sonra, 100 milimetrelik bir hücre kültürü plakasından C iki C 12 miyoblastını% 60 birleştiğinde hasat edin.

Bunu yapmak için, plakayı ön ısıtma PBS ile üç kez durulayın. Daha sonra EDTA'ya bir mililitre% 0.25 ekleyin ve plakayı iki dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, bir mililitre ön ısıtma kültür ortamı ekleyin ve hücreleri santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Hücreler peletlendikten sonra Reeses, onları büyüme ortamında kaleme alın ve triam mavisi ekleyerek ve bir TC 10 hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. Daha sonra DG MP iskelesini C iki C 12 miyoblast ile tohumlayın ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Epi floresan ve faz kontrast mikroskobu kullanarak DGMP jel katmanları içeren RGDS üzerine C iki C 12 miyoblastının bağlandığını onaylayın.

DGMP jellerinin alternatif katmanları, hücresel bağlanmayı ve büyümeyi destekleyen sağda gösterilen RGDS gibi çeşitli peptitler içerebilir. Bununla birlikte, soldaki tabaka herhangi bir hücresel bağlanma peptidi içermiyordu ve hücreler o bölgede hayatta kalamadı. IO diol jel sertliğini etkileyebilir.

Burada, elastik modül atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak ölçüldü. Bu jel formülasyonunda %30 IAL kullanıldığında sertlikte %60'lık bir artış görülmüştür, IAL'nin jel sertliği üzerindeki etkisi kullanılan malzemelere bağlı olarak değişebilir Bu prosedürü denerken, katmanların sırasını hatırlamak önemlidir. En yüksek miktarda IEX null içeren katman en altta, en az miktarda IEX null içeren katman ise en üstte olacaktır.

Ortam ışığından polimerizasyonu önlemek için her zaman fotoğraf başlatıcıyı sonuna eklemeyi unutmayın. İşbirlikçilerimizle birlikte, nörit büyümesini 3D olarak organize etmek için bu tekniği uyarlıyoruz. Bu, sağlıklı bireylerden türetilen nöro progenitör hücrelerin ve nörogelişimsel bozukluğu olan hastalardan elde edilen hücrelerin karşılaştırılmasına izin verecektir.

Ultraviyole ışıkla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Çapraz bağlama adımını gerçekleştirirken UV koruyucu gözlük takın.