Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Bu video makalesinde, oligosakkaritlerin otomatik çözelti faz sentezi ve poli anhy nanopartiküllerin işlevselleştirilmesi için yeni bir hidro put protokolünü açıklıyoruz. Bu karbonhidrat bazlı hedefleme ajanları ile ilk olarak karbonhidrat molekülleri, katı faz sentezleyiciler yerine çözelti fazı sentezini kullanan otomatik bir sistem kullanılarak sentezlenir. Daha sonra, oligosakkarit ara ürünleri çiçekçi, katı faz ekstraksiyonu veya FSPE ile saflaştırılır.

Üretilen karbonhidrat molekülleri NMR ile karakterize edilir ve daha sonra karbo IDE konjugasyonu ile poli anhidrit nanopartiküllerine bağlanır. Son olarak, karbonhidratla işlevselleştirilmiş nanopartiküller, x-ışını foto elektron spektroskopisi ve bir hidro putt fenil sülfürik asit tahlili ile karakterize edilir. Sonuç olarak, burada açıklanan hidro put metodolojisi kullanılarak, partikül yüzeyindeki nanopartikül morfolojisini ve karbonhidrat yoğunluğunu optimize etmek için reaksiyon koşulları elde edilmiştir.

Bu yöntemin katı yüz oligosakkarit sentezi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yöntemde önemli ölçüde daha az miktarda yapı taşı kullanmamızdır. Bu yöntemde, tipik olarak 10 ila 20 eşdeğer yerine iki ila üç eşdeğer kullanırız. Bu yöntem için ilk olarak, yüzey etkilerinin etkinliğini, poli hidro nanopartiküllerin işlevselleştirilmesini, anti denting hücreler üzerindeki ceep reseptörlerini hedeflemek için karbonhidratları kullandığımızı gösterdiğimizde sahip oluruz. Daha sonra, bu yeni taşıyıcıların imalatı ve uygulamasında yer alan çoklu parametreleri taramamızı sağlayacak yüksek verimli bir sistem tasarlamak istedik.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü oligosakkaritlerin yüksek verimli sentezi ve bunların polimer parçacıklarına bağlanması için otomatik platformların geliştirilmesi, diano asidin otomatik sentezinden önce çok fazla belge bulunmayan yeni bir araştırma alanıdır. Uygun şekilde korunan bir şeker donörü, tipik olarak Alcon'da bir alıcı olan trikloro asetamid olan floröz alkol tezgah üzerinde sentezlenir ve kloro metan içinde hazırlanır, ayrıca kloro metan içinde trimetil silo, trifloro metan sülfonat, %80 metanol ve %100 metanol hazırlanır. Otomasyon odasında odadaki bağıl nemin %30 veya daha düşük olduğundan emin olun.

Yüksek nem, glikozilasyon reaksiyonları için zararlıdır. Aşağıdaki adımlar bir otomasyon platformu kullanılarak yapılır. İlk glikozilasyon, donör ve çiçekçi alkolü ile gerçekleştirilir.

Yapıldıktan sonra, elde edilen çiçekçi etiketi şeker molekülü FSPE ile saflaştırılır. Geçici koruma grubu daha sonra sodyum, metamfetamin oksit ve metanol ile uzaklaştırılır ve ürün bir kez daha FSPE ile saflaştırılır. Bundan sonra, çiçekçi etiket şekeri bir alıcı olarak kullanılır ve disakkariti elde etmek için aynı donöre bağlanır, disakkarit, başlamak için FSPE tarafından saflaştırılır.

Donör alıcı promotörü, %80 metanol suyu, %100 metanol, sodyum meth oksit dahil olmak üzere reaktifleri robotik platforma yerleştirin ve programı başlatın. Robotik kol, donörü ve ardından alıcıyı şişelerden çekecek ve bunları bir reaksiyon şişesine aktaracaktır. Daha sonra verici ve alıcı karışımı 30 dakika karıştırılır.

30 dakika geçtikten sonra. Robotik kol, katalitik trimetil silo, tri floro, metan sülfonatı karışıma aktarır. Çözelti daha sonra 30 dakika daha karıştırılır Karıştırma tamamlandıktan sonra program duraklar.

İnce tabaka kromatografisi ile reaksiyonun tamamlanıp tamamlanmadığını kontrol etmek için 10 mikrolitrelik bir alikotu çıkarın. Reaksiyon tamamlanırsa, alıcı molekül görülmeyecektir. Reaksiyon tamamlanmadıysa, TLC üzerindeki alıcı hala görülebilir.

Bu durumda, programı durdurun, glikozilasyon zamanlamasını yaklaşık 30 dakika sıfırlayın ve fazla miktarda promotör trimetil silo, tri floro, metan sülfonat ekleyin. Reaksiyon tamamlandığında bir sonraki adıma geçin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra robot, reaksiyon karışımını saflaştırma için C dokuz F 17 modifiye silika jel içeren FSPE kartuşlarına aktarır.

Daha sonra, kartuşlar sekiz mililitre% 80 metanol ile yıkanır, ardından sekiz mililitre% 100 metanol ile yıkanır. Floris olmayan fraksiyonu ortadan kaldırmak için, istenen çiçekçi etiketli ürünü elde etmek için akış bir şişede toplanır. Ek saflaştırma gerekiyorsa, robotu duraklatın ve uygun reaksiyon ürünlerini çıkarın.

Yapıya bağlı olarak, donörler son derece reaktif olmayabilir ve yeterli promotör eklendikten sonra bile bazı çiçekçi kabul edici moleküller kalacaktır. Bu durumda, FSPE saflaştırma için yeterince verimli olmayacaktır ve silika jel kolon kromatografisi yoluyla ek saflaştırma gerçekleştirilebilir, saflaştırmadan sonra robotik kol sodyum meth oksidi reaksiyon şişesine dağıtır. Reaksiyon daha sonra robotik platformda iki saat boyunca karıştırılır, eğer TLC tarafından belirlendiği gibi tamamlanmazsa, inkübasyon süresini yaklaşık bir saat uzatın.

Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, ürün daha önce olduğu gibi FSPE ile saflaştırılır. Daha sonra, reaksiyon ürününü robottan ve susuz toluen içinde çözünmeye tabi tutulan tezgah üzerinde çıkarın, ardından kalan suyu çıkarmak için buharlaştırın. Bir numune kuruduktan sonra, FSPE ile glikozilasyon saflaştırması da dahil olmak üzere aynı döngüde robota geri yerleştirin.

Otomasyondan elde edilen korunan ürünün de korunması için hedef molekül için istenen zincir uzunluğu elde edilene kadar geçici koruma grubunun derin koruması ve ardından glikozilasyon tekrarlanır, şişeyi robottan çıkarın. Prosedürün son adımlarında patlayıcı hidrojen gazı kullanılır ve otomasyon platformunun dışında gerçekleştirilmelidir. Tezgah üstü oz'da, çiçekçi etiketindeki çift bağın parçalanması meydana gelir ve bunu üretilen aldehitin karboksilik aside oksidasyonu izler.

Elde edilen ürünü, di kloro metan içinde %30 metanol karışımı kullanarak bir tezgah üstünde silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın. Son olarak, benzo eter gruplarını paladyum katalizli hidrojenasyon ile korumak için, saf nihai ürün elde etmek için paladyumdan kurtulmak için ürünü bir uydu pedinden geçirin. Nükleer manyetik rezonans veya NMR spektroskopisi kullanarak ürünü tam olarak karakterize edin.

Yüksek atımlı polimer sentezi ve nanopartikül üretimi, Peterson ve arkadaşları tarafından açıklanan protokole göre gerçekleştirilir. Ekteki belgede atıfta bulunulduğu gibi, parçacık işlevselleştirmesi için kullanılan otomatik biriktirme aparatı, biri X yönünde hareket ve diğeri Y yönünde hareket için olmak üzere iki aktüatör tarafından entegre edilmiş bir robotik aşama olan üç ne 1000 pompadan ve üç aktüatörden oluşan iki bitişik rafa sahip ikinci bir robotik aşamadan oluşur, Her yön için bir tane olmak üzere pompalar ve toplam beş aktüatör bağlanır. Seri olarak, aktüatörler ve pompalar, laboratuvar görünümü yazılımı kullanılarak bir bilgisayar tarafından çalıştırılır.

Parçacık üretimi için kullanılan kopolimer sistemleri, SEBA asit veya SA ve bir altı bis, paraik karboksi, oxil heane veya CPH ve bir sekiz BIS para karboksi fenoksi üç altı dioksan veya CP Teeg'e dayanmaktadır. Nanopartikül üretim yerini takiben, karbonhidratların poli anhy partiküllerinin yüzeyine bağlanması için lineer aktüatör aşamasına bir nanopartikül kütüphanesine sahip 1.7 mililitrelik santrifüj tüplerini içeren bir raf ve ilk reaksiyon için iki ardışık reaksiyondan oluşan bir ortalama karboksilik asit birleştirme reaksiyonu gerçekleştirilir. Programlanabilir bir şırınga pompasındaki bir şırıngayı, sırasıyla miligram nanopartikül başına iki miligram ve miligram nanopartikül başına 0.6 miligram konsantrasyonda sulu bir EDC ve etilen diamin çözeltisi ile doldurun.

Programlanabilir bir şırınga pompasında ikinci bir şırıngayı, nanopartikül numunesi başına toplam 12 eşdeğer olan NHSA partiküllerinin miligramı başına 2.5 miligram, sulu bir çözelti ile doldurun. Ardından, laboratuvar görüntüleme programını kullanarak, robota reaktif süspansiyonlarını nanopartikül kütüphanesine bırakması talimatını verin. Robot aktüatörler daha sonra çözeltilerin, EDC ve NHS'nin dağıtımı için tüp tutucuyu platformda doğru konuma hareket ettirecektir.

Poli anhidrit nanopartiküllerin yüzeyindeki karboksilik asit gruplarını aktive edin ve ortalama bir eşleşmeye izin verin. Daha sonra, her tüpe bir sonikasyon probu daldırın ve her numuneyi 40 hertz'de 30 saniye boyunca sonikleştirin. Bir sonraki numuneye geçmeden önce probu asetonla temizleyin.

Tüm numuneler doyduktan sonra, tüp tutucu robotik platformdan ayrılır. Nanopartikül süspansiyonlarını dört santigrat derecede sabit rotasyonla dokuz saat boyunca inkübe edin. Birinci ve ikinci reaksiyonlar için reaksiyon süreleri, nihai sakkarit konsantrasyonunu ayarlamak için değiştirilebilir.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, tüpleri beş dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Soğuk bir ortamda robotik istasyona geri dönün. Tüp tutucuyu robotik kola yeniden takın ve ikinci şırıngayı robotik platforma doldurun.

Soğuk su ile ilk şırınga boş kalmalıdır. Robotu başlatın. Her tüpteki süpernatant boş şırıngaya çekilir ve ikinci pompa tüplere soğuk su bırakır.

Bu adım, nanopartikül süspansiyonlarından reaktif olmayan reaktifleri çıkarmak için gerçekleştirilir. Daha sonra, nanopartikül süspansiyonunu daha önce gösterildiği gibi sonikasyon ile homojenize edin. Daha sonra tüpleri beş dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin.

İkinci reaksiyon yükü için robotik aparatı kullanarak soğuk suyla ikinci bir yıkama gerçekleştirin: EDC'nin nanopartikül numunesi başına 12 eşdeğeri birinci pompaya ve NHS'nin nanopartikül numunesi başına 12 eşdeğeri ikinci pompaya. Nanopartikül içeren tüplere yeterli hacimleri dağıtmak için robotik platformu başlatın. EDC ve NHS'nin varlığı, nanopartikül yüzeyine halihazırda bağlanmış olan etilen dite'den amin grupları ile derin korunan şekerin karboksilik asit grubu arasında bir amid bağı oluşumuna izin verecektir.

Biriktirme tamamlandıktan sonra, belirli bir sakkaritin 10 eşdeğerini yükleyin. Bu durumda, laktoz kullanıldı ve mevcut iki pompada glikolik asit kontrolü yapıldı. Her bir sakkarit, daha önce laboratuvar görünüm programında programlanmış, kullanılan spesifik reaksiyon için aktüatörleri ve pompa fonksiyonlarını çalıştırmak için kullanılan, her bir tüpte elde etmek istenen işlevselleştirmeye bağlı olarak test tüplerine bırakılır Bu çalışmada, karbonhidratların bağlanması için, glikolik asit bir bağlayıcı kontrol olarak kullanılır, çünkü derin korumalı sakkaritler bu molekülü zaten kovalent olarak bağlamıştır, Bu, nanopartikül yüzeyine daha fazla bağlanmaya izin verir.

Nanopartikül süspansiyonları, daha önce olduğu gibi sonikasyon ile homojenize edilir ve daha sonra dört santigrat derecede sabit rotasyon ile dokuz saat boyunca inkübe edilir. İnkübe ettikten sonra, nanopartikül süspansiyonlarını santrifüjleyerek yıkayın, süpernatanı çıkarın, ardından Resus peleti soğuk suda askıya alın ve şimdi işlevselleştirilmiş nanopartikül kütüphanesini içeren tüpleri en az iki saat kuruması için bir vakum odasına yerleştirin. İşlevselleştirilmiş nanopartiküller, dinamik ışık saçılımı ve yüzey bileşimini, konsantrasyonu, partikül boyutunu, boyut dağılımını ve yüzey yükünü değerlendirmek için diğer yöntemlerle karakterize edilir.

Burada gösterilen tam korumalı diano tarafı, otomasyon platformu kullanılarak sentezlendi. Sentezlenen bileşik, bir VXR 400 megahertz spektrometresinde proton NMR ile karakterize edildi. Çözücü olarak CDC 13 kullanılarak, ürünün oluşumu bazı karakteristik piklerin varlığından doğrulanabilir.

Proton NMR diyagramında, 1.79'dan 2.21'e kadar olan dört proton ve 3.38'deki iki proton çiçekçi etiketindendir. 2.16'daki singlet zirvesi, 4.94'teki asetat tepe zirvelerine karşılık gelir ve 5.11, reaksiyon süresinin nanopartiküllerin nihai morfolojisi üzerindeki etkisini ve elde edilen şeker bağlanma derecesini değerlendirmek için anomerik protonlardır. Nanopartiküller, burada gösterildiği gibi artan reaksiyon süreleri ile işlevselleştirildi, 50 50 CPT CPH nanopartiküllerinin yüzeyindeki diano konsantrasyonu toplam reaksiyon süresi ile arttı ve 18 saat sonra maksimuma ulaştı.

24 saatlik toplam reaksiyon süresi ile işlevselleştirilen nanopartiküller daha sonra burada gösterildiği gibi akış sitometrisi kullanılarak fare kemik iliği türevli dendritik hücreler üzerindeki CLR'leri hedefleme yeteneklerini değerlendirmek için kullanıldı. İşlevselleştirilmemiş laktoz ve dano işlevselleştirilmiş nanopartiküller ile stimülasyondan sonra DC işaretinin ve mano reseptörünün C tipi lektin reseptörlerine artan ekspresyonu gözlendi. Bu, etkili hedeflemeyi gösterir.

Bununla birlikte, Diano işlevselleştirilmiş parçacıklar, incelenen reseptörler için bu ligandın özgüllüğünü gösteren daha yüksek bir ifade seviyesi gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, oligosakkaritlerin yüksek verimli otomatik sentezinin yanı sıra poli nanopartiküllerin işlevselleştirilmesinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu karbonhidrat bazını hedefleme ajanlarında kullanarak, donör alıcı korumalı şekerin sentezine hakim olduktan sonra, aparatın montajı 24 ila 48 saat içinde yapılabilir.

Tabii ki, zaman uzunluğu kütüphanenin boyutuna ve işlevselleştirme süresine bağlıdır. Bu yönteme katılırken, nanoparçacık kimyasına bağlı olarak biyolojik olarak parçalanabilen poli hidro parçacıkların işlevselleştirilmesinin reaksiyon koşullarını optimize edebileceğinizi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü izleyerek, immünolojik sonucu etkilemek için farklı hücre reseptörlerini hedeflemek için çeşitli karbonhidrat yapıları sentezlenebilir.