Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Bu yaklaşımın genel amacı, mikrobiyal ekzopolisakkarit üreticileri için hızlı ve güvenilir tarama ve karbonhidrat parmak izlerinin tanımlanmasıdır. Bu, ekzopolisakkaritlerin keşfedilmemiş çeşitliliğini kullanmak için önemli bir adımdır. Yöntemimiz, mikrobiyal ekzopolisakkaritler alanındaki polimer araştırmalarını hızlandırmaya yardımcı olabilir.

Belirli uygulamalar için farklı özelliklere sahip yeni polisakkarit varyantlarının hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, farklı ekzopolisakkarit algılama sistemlerinin modüler ve tamamen otomatik hale getirilmiş bir tarama konseptinde birleştirilmesidir. Bu, onu son derece hızlı ve güvenilir hale getirir.

Bu teknik, otomasyon platformunun bulunmadığı laboratuvarlarda manuel olarak da gerçekleştirilebilir, bu nedenle kullanımı çok esnektir ve farklı tarama ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Bu ekzopolisakkarit veya EPS tarama platformu, protokolün Otomatik Tarama ve Karbonhidrat Parmak İzi olmak üzere iki ana bölüme ayrılmasına izin veren modüler bir kuruluma sahiptir. İlk görev, tarama için suşları yetiştirmek ve hücreleri santrifüjleme ile çıkarmaktır.

Suşlar, 30 santigrat derece ve 1.000 RPM'de mikro titre plaka çalkalayıcı üzerinde nefes alabilen sızdırmazlık filmi ile kaplanmış 96 oyuklu plakalarda karbon kaynağı olarak glikoz üzerinde kültürlenir. Ekranın açılacağı gün, robot çalışma masasını ve saklama karuselini protokol metninde anlatıldığı gibi hazırlayın. Nefes alabilen sızdırmazlık filmini plakalardan çıkarın ve ana kültürleri 1-1 ila 1-4 arasındaki atlıkarınca konumlarına yerleştirin.

Otomatik robotik programı başlatın. Yetiştirme işleminden sonra hücreleri çıkarmak için, ana kültür derin kuyu plakalarını atlıkarıncadan santrifüje aktarın ve 30 dakika boyunca 4, 300 x g ve 20 santigrat derecede santrifüjleyin. Filtrasyondan önce çökeltme için, mikro titre plakalarını ve pH indikatör mikro titre plakalarını karuselden çalışma masasına hareket

Ayrıca tüm bakteri hücrelerinin tamamen uzaklaştırılmasını sağlayan filtrasyon plakalarını, kolektör plakaları ile birlikte çalışma masası konumlarına aktarın. Santrifüjlemeden sonra, ana kültür süpernatanının 180 mikrolitresini filtrasyon plakasına aktarın. Ana kültür süpernatından 150 mikrolitre aspire edin ve filtrasyondan önce çökeltme için mikro titre plakasına 50 mikrolitre ve pH gösterge plakasına 100 mikrolitre dağıtın.

EPS üretimini değerlendirmek için süpernatantın 2-propanol ile çökeltilmesi yapılır. Her oyuğa manuel olarak 150 mikrolitre 2-propanol eklemek için 12,5 mililitrelik çok adımlı bir pipet kullanın. Mikro titre plakalarını oda sıcaklığında 900 RPM'de 10 dakika çalkaladıktan sonra, EPS üretimini gösteren lif veya pul oluşumlarını görsel olarak gözlemleyin.

Ana kültür plakaları atlıkarıncaya geri depolandıktan sonra, santrifüjlemeden sonra azalmış sedimantasyon göstermesi gereken fermantasyon sularını inceleyin. Viskozitedeki artış, EPS üretiminin bir başka göstergesidir. İkinci görev, 96 oyuklu bir filtrasyon yoluyla viskoz fermantasyon suyundan tam hücre uzaklaştırılmasını sağlamaktır.

Filtrasyon plakalarını 3.000 x g ve 20 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından plakaları atlıkarınca ana konumlarına geri getirin ve protokol metninde açıklandığı gibi jel filtrasyonunun dengesini gerçekleştirin. Daha sonra, dengelenmiş jel filtrasyon plakasının ortasına 35 mikrolitre süzüntü ve çökeltme için kullanılan mikro titre plakasına 50 mikrolitre pipetleyin.

Jel filtreleme plakalarını santrifüje taşıyın ve diğer tüm plakaları çalışma masasından karuseldeki ana konumlarına geri getirin. Tüm plakaların karuselde tekrar saklanmasından sonra, filtre plakasındaki kalıntılarla gösterildiği gibi yüksek viskoziteli süpernatantlara dikkat edin. Süzüntü eksikliği, aşağıdaki analitik modüllerde yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.

Otomatik taramadaki üçüncü görev, kalan monomerik şekerlerin 96 oyuklu bir jel filtrasyonu yoluyla büyüme ortamından uzaklaştırılmasıdır. Jel filtrasyon plakalarını 1.000 x g ve 20 santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Jel filtratları işlemek için çalışma masasını robotik manipülatör aracılığıyla hazırlayın.

Jel filtrasyonundan sonra kalan glikozu tespit etmek için, 25 mikrolitre çift damıtılmış suyu taze bir mikro titre plakasına aktarmak için 50 mikrolitrelik uçlar kullanırız. 20 mikrolitre çift damıtılmış su, beş mikrolitre hava ve 5 mikrolitre jel süzüntü aspire edin ve aynı plakaya dağıtın. 200 mikrolitrelik uçlar alın ve ilk testi başlatmak için 50 mikrolitre glikoz tahlili reaktif karışımını çalışma masası konumu 1-2'den aspire edin.

Mikro titre plakalarını inkübatöre taşıyın. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden mikro titre okuyucuya taşıyın ve 418 ve 480 nanometrede absorbasyonu kaydedin. Fenol-sülfürik asit yöntemiyle toplam karbonhidrat içeriğini belirlemek için, mikro titre plakalarına 20 mikrolitre jel süzüntü pipetleyin.

Plakaları karuselden manuel olarak çıkarın ve sıvı işleme istasyonuna yerleştirin. Kalibrasyon plakasını üç kopyalar halinde 20 mikrolitre farklı glikoz konsantrasyonlarına dahil edin. 1 konumuna bir atık kabı, 2 konumuna 300 mikrolitrelik bir uç kutusu ve 3 konumuna 110 mililitre taze hazırlanmış fenol-sülfürik asit içeren 250 mililitrelik bir oluk yerleştirin.

Tüm plakaların her sırasına 180 mikrolitre fenol-sülfürik asit aktarmak için 300 mikrolitre uçlu 8 kanallı bir pipet kullanın. Tüm mikro titre plakalarını kapaklarla kapatın ve oda sıcaklığında 900 RPM'de beş dakika çalkalayarak karıştırın. Renk reaksiyonu için bir fırında 80 derecede 35 dakika inkübe edin.

Plakaları bir davlumbaz altında soğuttuktan sonra, 480 nanometrede sönmeyi ölçün. Otomatik taramadan elde edilen suşlar, aşağıdaki üç kriterden en az ikisini karşılıyorlarsa EPS pozitif olarak belirlenir. Viskozite kontrolü, polimerin tespiti ve hesaplanan glikoz eşdeğeri.

Glikoz eşdeğeri bu denklem kullanılarak hesaplanır. Tarama platformunun Karbonhidrat Parmak İzi, manuel olarak gerçekleştirilen son üç görevi içerir. İkinci görevdeki pozitif isabetlerin kalan süzüntüsü, beşinci görevdeki jel süzüntü için temel oluşturur.

Altıncı görev, jel filtratın 96 oyuklu mikro hidrolizidir. Bunu başarmak için, önce 20 mikrolitre jel filtratı yeni bir PCR plakasına aktarmak için 12 kanallı 50 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Ardından, her bir oyuğa 20 mikrolitre dört molar trifloroasetik asit eklemek için 1,25 mililitrelik çok adımlı bir pipet kullanın.

PCR plakasını bir termoplastik elastomer kapak matı ile örtün ve PCR plakasını özel bir cl'ye yerleştirin.ampcihaz. Sıkıştırma cihazını 10 kez ters çevirerek çözeltileri karıştırın. PCR plakasını santrifüjledikten ve sıkıştırma cihazına sabitledikten sonra, güvenli sıkıştırma cihazını önceden ısıtılmış bir kum banyosuna yerleştirin ve 121 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin.

12 kanallı 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, pH'ı yaklaşık sekize ayarlamak için %3,2'lik bir amonyak çözeltisi ekleyin. PCR plakasını bir termoplastik elastomer kapak matı ile örtün ve cl'yi kullanarak manuel olarak sallayın.ampcihaz. Son görev, Karbonhidrat Parmak İzini yüksek verimli 1-fenil-3-metil-5-pirazolon veya HTPMP yöntemi ile analiz etmektir.

Bu prosedüre başlamak için, nötralize hidrolizatın 25 mikrolitresini yeni bir PCR plakasına aktarmak için 12 kanallı 50 mikrolitrelik bir pipet kullanın. 75 mikrolitre türevlendirme reaktifi karışımı ekleyin ve plakayı bir termoplastik elastomer kapak matı ile örtün. PCR plakasını 100 dakika boyunca 70 santigrat derecede bir PCR döngüleyiciye yerleştirin ve ardından 20 santigrat dereceye kadar soğutun.

20 mikrolitrelik bir alikotu yeni bir mikro titre plakasına aktarın, ardından her satıra 130 mikrolitre 19.23 milimolar asetik asit eklemek için 12 kanallı 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. En az altı kez aspirasyon ve dağıtım yoluyla doğrudan karıştırın ve tüm sıvıyı bir mikro titre toplayıcı plakaya sahip 0,2 mikrometrelik bir filtre plakasına aktarın. Plakayı beş dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin, filtre plakasını çıkarın ve mikro titre toplayıcı plakayı bir silikon kapak matı ile kapatın.

Karbonhidrat Parmak İzi'nin belirlenmesi için mikro titre plakasını UHPLC-UV-ESI-MS'ye yerleştirin. Bu tablo, bu tarama platformuyla başarılı bir şekilde tanımlanan üç örnek yeni suşun sonuçlarını göstermektedir. Tablonun sol kısmı, ayrıntılı Karbonhidrat Parmak İzi analizi için değerlendirme parametreleri olarak kullanılan viskozite oluşumu, polimer üretimi ve toplam hidrolizden elde edilen glikoz eşdeğeri ile ilgili otomatik tarama modüllerinin sonuçlarını göstermektedir.

Kalibre edilmiş şekerlerin yanı sıra bilinmeyen şekerler, dimerler ve ikame edicilere dayalı Karbonhidrat Parmak İzi, tablonun sağ tarafında verilmiştir. Bu bilgilerin kullanılmasıyla, monomerik bileşim hesaplanabilir ve halihazırda bilinen polimer yapılarıyla karşılaştırılabilir. Ayrıca, ilginç monomerik bileşimler ve nadir karbonhidratlar için hedefli bir tarama yapılabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sadece beş saat içinde 386 suş için yapılabilir. Bu prosedürü takiben, ekzopolisakkarit beyanı ile ilgili ek soruları yanıtlamak için halihazırda mevcut olan piruvat veya asetatlar için daha ileri testler veya fosfat gibi ek testler dahil edilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, yüksek hassasiyetiyle, değiştirilmiş ekzopolisakkarit biyosentetik yolakların kalan kimyasal yapı üzerindeki etkisini araştırmak için genetik mühendisliği, mikrobiyal ekzopolisakkarit üreticileri alanındaki araştırmamızın yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, yeni ekzopolisakkarit üreticilerini çok hızlı ve güvenilir bir şekilde nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.