T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Bu prosedürün genel amacı, indüklenmiş pluripotent kök veya IPS hücrelerinden T lenfositlerini oluşturmak ve karakterize etmektir. IPS hücreleri daha sonra bir OP dokuz DL bir kültür sistemi üzerinde in vitro olarak farklılaştırılabilir ve daha sonra bez eksikliği olan bir farede in vivo olarak olgunlaştırılabilir. Ya da hücreler, OT'yi bir TCR'yi aşırı eksprese etmek için genetik olarak tasarlanabilir ve daha sonra in vivo gelişim için evlat edinilebilir şekilde aktarılabilir.

Altı haftalık in vivo farklılaşmadan sonra, farelere EEG yedi tümör hücresi ile intraperitoneal enjeksiyon uygulanabilir ve daha sonra IPS'den türetilen T hücrelerinin antijen özgüllüğü değerlendirilebilir. Sonuç olarak, IPS hücreleri hem geleneksel hem de antijene özgü T hücrelerine farklılaşabilir, ikincisi hayvanları tümör tehdidinden koruyabilir. Bu tekniğin etkileri, bireyselleştirilmiş kanser immünoterapisine kadar uzanır.

Yöntem, hastanın minimum miktarda kan veya cilt dokusundan elde edilen çok sayıda tümör reaktif T hücresinin üretilmesine izin verir Sıfırıncı günde, beşinci günde% 20 FBS alfa MEM ortamında birleşik bir OP dokuz, DL tek hücreli tek tabaka içeren 100 milimetrelik bir kültür kabına beş kez 10 ila dördüncü IPS hücresine aktarın, tripsin gözleri. Daha sonra hücreleri, 30 dakika boyunca taze bir 100 milimetre kültür kabı ve 37 derecelik inkübatör plakası üzerinde inkübe ettikten sonra, yüzen hücrelerin beşte beşi 10 ila beşte birbiri olan %20 FBS alfa, MEM ortamı ve fare düz üç ligandı üzerinde tek katmanlı OP dokuz içeren yeni bir 100 milimetrelik tabak üzerinde santrifüjleyin. Sekizinci günde DL bir hücre, gevşek bir şekilde bağlanmış hücreleri nazikçe pipetler, hücreleri santrifüjler ve daha sonra hücreleri, birleşik OP dokuz DL ile kaplanmış altı kuyulu bir kültür plakasının tek bir kuyusuna aktarır, hücreleri 37 santigrat derecede, 22. günde iki hafta daha% 5 karbondioksitte inkübe eder.

Ayrılmış IPS hücrelerini taze ortamda 37 santigrat derecede yeni bir kültür kabında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra yüzen hücrelerin yaklaşık yarısını çıkarın ve hücre kümelerini dışlamak için 70 mikronluk bir naylon süzgeçten geçirin ve elde edilen tek hücre süspansiyonunu soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, PBS'deki hücreleri mililitre başına yedinci hücrelerin 10'da 1.5 oranında yeniden süspanse edin ve IV enjeksiyonundan önce hücreleri buz üzerinde tutun.

Kuyruk damarını genişletmek için dört haftalık bir bez eksik fareyi kızılötesi ışığın altına yerleştirin. Daha sonra, 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ile 26 buçuk gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırıngayı doldurun ve hücreleri genişlemiş kuyruk damarından evlat edinici olarak aktarın. Üç hafta sonra, evlat edinilen farenin ötenazisini onayladıktan sonra, dokuları mekanik olarak parçaladıktan sonra lenf düğümlerini ve dalağı çıkarın.

Tek hücreli süspansiyonu bir CK lizis tamponu ile ayarlayın ve daha sonra elde edilen mononükleo sitleri soğuk PBS'de iki kez yıkayın. Daha sonra, hücre yüzey belirteçleri için boyamadan sonra, hücreleri sıfırıncı günde akış sitometrik analizi ile değerlendirin, gece boyunca kaplanmış plaka E paketleme hücrelerini bir OT ile bir MIDR ile bir tohum bir kez 10 ila altı IPS hücresine, ikinci günde% 0.1 jelatin önceden kodlanmış 24 oyuklu bir plakaya, plat E hücrelerinden S natin içeren sahte virüsü toplayın ve daha sonra santrifüjden sonra potansiyel kirleticileri dışlamak için 0.4 mikronluk bir filtreden geçirin. Hücrelerin poli beyin varlığında bir saat boyunca 330 kez G'de 32 santigrat derecede transdüksiyonu.

Transdüksiyon prosedürünü tekrarladıktan sonra gece boyunca aynı sıcaklıkta inkübe edin. Tripsin, dördüncü günde transdüksiyona uğramış IPS hücrelerini gözler ve daha sonra peletlemeden sonra, hücreler hücreleri taze ortamda yeniden askıya alır ve bunları önceden kodlanmış ışınlanmış snl 7 6 7 besleyici hücrelere tohumlar. Dönüştürülen hücreler akıcılığa ulaştığında, GFP ve DS kırmızı çift pozitif hücreleri akış sitometrisi ile sıralayın.

IPS hücrelerinin evlat edinme transferinden altı hafta sonra, tümör tehdidinin 50. gününde aynı farenin periton boşluğuna 50 mikrolitre EEG yedi thoma hücresi enjekte edilir. Evlat edinilen hayvanın dalak ve lenf düğümlerinden CD sekiz pozitif T hücresini ayırmak için bir mil E biyoteknoloji CD sekiz pozitif T hücresi izolasyon kiti kullanın. İzole edilmiş CD sekiz pozitif T hücresini, saf bir C 57 siyah altı J fareden ışınlanmış SPOC boyutuyla bir ila 10 oranında karıştırın ve ko-kültürü 40 saat boyunca mil yumurta başına 0.5 mikromol ile vurun.

Daha sonra, dört saat daha hücrelere felden A ekleyin. Son olarak, saf bir C 57 siyah altı J faresinden SP sitlerini izole ettikten sonra hücre popülasyonlarını akış sitometrik analizi ile değerlendirin. Hücre süspansiyonunu iki gruba ayırın.

CFSE yüksek grubunu mil başına beş mikromol CFSE ile etiketleyin ve hücreleri bir saat boyunca mil başına 10 mikrogram yumurta peptidi ile nabız atın, mil CFSE başına 0.5 MİKROMOL ile ACFSE düşük grup olarak etiketlendi ve nabız atmayın. PBS'de 2,5 çarpı 10'u altıncıya, CFSE yüksek hücrelerini 2,5 çarpı 10'a altıncıya, CFSE düşük hücrelerini karıştırın. Daha sonra sitleri CFSE ekspresyonu için akış sitometrisi ile analiz edin.

İlgilenilen fareye evlat edinici transferden 16 saat sonra Tümör mücadelesinin 20. gününde intraperitoneal tümör hücrelerini saymak için. Periton boşluğunu lavajlamak için 18 buçuk gauge iğne ve soğuk PBS ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Tümör sızan hücreleri tanımlamak için kurtarılan tümör hücrelerini sayın.

Tümör tehdidinin geç bir aşamasında tümörü çıkarın ve ardından tümörü üç parçaya bölün. İlk tümör parçasını bir kriyo şişesine yerleştirin ve şişeyi kuru buzun üzerine yerleştirin. İkinci parça formaldehiti hemen sabitleyin.

Üçüncü parçayı, kriyoprezervasyonlu doku bölümlerini havayla kuruttuktan sonra şartlandırılmış RPMI 1640 ortamında saklayın. Sabit bölümleri 15 dakika daha havayla kuruttuktan sonra 15 dakika soğuk asetonda sabitleyin. Slaytları yıkamadan sonra PBS'de beş dakika yıkayın.

Slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için doku bölümlerini 30 mikrolitre% 3 B, SA ve PBS ile 30 dakika boyunca örtün. Daha sonra bloke edici tamponu kurulayın ve doku bölümlerini, inkübasyonun sonunda nemli odada iki saat boyunca PBS'de% 3 PSA ile seyreltilmiş 50 mikrolitrelik bir pe anti TCR RV alfa iki antikor ve fitzy anti ova antikoru karışımı ile inkübe edin. Slaytları soğukta üç kez yıkayın, PBS, son olarak, tümör sızan T hücrelerinin akış sitometrik analizi için floresan mikroskobik incelemeden önce bölümleri su bazlı bir montaj ortamı ile monte edin.

Tümörü tek hücreli bir süspansiyona sıkıştırın. Ardından, belirli yüzey işaretleyicileri için hücreleri analiz edin. C, CD üç ve TCR beta, IPS hücrelerinin çentik ligandı DL bir ile uyarılmasının T hücresine katkıda bulunup bulunamayacağını belirlemek için T hücrelerinin belirteçleri olarak kullanılır; CD dört, ve CD sekiz, CD üç pozitif TCR r beta pozitif IPS hücresinden türetilmiş hücrelerde hücre yüzey ekspresyonu değerlendirildi.

22. gün CD'sini, üç pozitif TCR R'yi, beta pozitif CD'yi, dört negatif CD'yi, in vitro olarak IPS hücrelerinden üretilen sekiz pozitif tek pozitif T hücresini gösteren sağdaki nokta grafiğine dikkat edin. Ek olarak, önceki şekilden elde edilen IPS hücresinden türetilmiş tek pozitif hücreler, in vitro olarak plaka kaplı anti CD üç ve çözünür anti CD 28 antikorları tarafından uyarıldığında interlökin iki ve interferon gama üretti, bu da IPS hücresinden türetilen T hücrelerinin alıcı farelere evlat edinici transferden sonra işlevsel olduğunu doğruladı. TCR geni ile transdüksiyona uğrayan IPS hücrelerinin çoğu, havuzlanmış lenf nodu ve dalak hücrelerinden bu nokta grafiklerinde interlökin iki ve interferon gama salgılayarak in vitro peptit stimülasyonuna yanıt veren CD sekiz pozitif CTL'lere farklılaştı.

CD, sekiz pozitif V, beta, beş pozitif T hücresi, TCR ile evlat edinilerek transfer edilen farelerde üretildi, ancak transdüksiyonlu IPS hücrelerini kontrol etmedi. CD sekiz pozitif V beta beş pozitif popülasyon, bu histogramlarda koyu çizgilerle temsil edilen interlökin iki için hücre içi sitokin boyama ve interferon gama üretimi için pozitifti, bu da IPS'den türetilmiş CTL'lerin işlevsel olduğunu gösteren gölgeli izotip kontrol histogramlarına kıyasla. Bu veriler, her grafikte sağdaki tepe noktaları ile temsil edilen eptid ile darbeli CFSE yüksek hücrelerinin ve IPS hücre transferinden 10 hafta sonra veya O OT bir CTL transferinden bir gün sonra farelere enjekte edilen soldaki tepe noktaları ile temsil edilen CFSE düşük kontrol hücrelerinin olduğunu göstermektedir.

Antijene özgü IPS'den türetilmiş CTL'ler, antijen stimülasyonuna yanıt verdi ve burada CFSE yüksek hücrelerinin yokluğu ile gösterildiği gibi sitotoksik aktiviteye sahipti. OT, bir TCR geni dönüştürülen IPS hücreleri, C 57 siyah altı fareye evlat edinilerek aktarıldı ve daha sonra fareler EEG ile zorluğa tabi tutuldu, 20. günde yedi tümör hücresi, periton boşluğundaki tümör hücreleri numaralandırıldı. Kontrol gruplarına kıyasla TCR TRANSDUCED IPS alan farelerde tümör hücresi sayılarındaki önemli azalmaya dikkat edin.

En önemlisi, TCR transdüksiyonlu IPS hücrelerinin evlat edinme transferi, aşırı reaktif CTL'lerin tümör dokularına infiltrasyonunu tetikledi ve tümör dokularının bu h ve e boyanmasında görüldüğü gibi hayvanları tümör tehdidinden korudu, tümör meydan okumasından 30 ila 35 gün sonra geri kazanıldı, TCR transdüksiyonlu hücreler veya OT bir CTL'ler ile evlat edinilen farelerden alınan tümörler, ancak sahte enjekte edilmedi veya kontrol edilmedi. Dönüştürülen hücreler, burada kırmızı oklarla gösterildiği gibi enflamatuar hücreler tarafından infiltre edildi. Kırmızı renkte ova spesifik V alfa iki pozitif CTL'nin yeşil renkte tümör dokularını eksprese eden yumurtaları infiltrasyon ettiği bulundu.

Kontrol gruplarından farelerdeki tümörler, bu şekilde daha az tümör infiltre eden hücreye sahipken veya hiç yokken, tümör dokularından tek hücreli süspansiyonlar, CD sekiz pozitif popülasyon üzerinde geçit yapıldıktan sonra akış sitometrisi ile V alfa iki pozitifliği ve V beta beş pozitifliği ekspresyonu için analiz edildi. TCR Transduced IPS hücreleri ile evlat edinilen farelerden alınan tümör dokularının, kontrol alan farelerden alınan tümörlerin en yüksek düzeyde tümör sızan hücreler sergilediğini unutmayın. Transdüksiyonlu IPS, ova spesifik CD sekiz pozitif T hücresi tarafından infiltrasyon göstermedi.

Bu videoyu izledikten sonra, IPS hücrelerinden antijene özgü T hücrelerinin nasıl oluşturulacağını ve T hücrelerinden türetilen IPS'nin fonksiyonlarının nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.