Name: T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Öğrenin, iPS hücrelerinden T lenfositleri üretme ve karakterize etme yöntemini. Bu teknik, kanser immünoterapisinde kişiselleştirilmiş tedavi potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sağlamak için Dr Shinya Yamanaka (Kyoto Üniversitesi) teşekkür iPS-MEF-Ng-20D-17 hücre hattı, OT1-2A destekleyen Dr Dario Vignali (St Jude Çocuk Araştırma Hastanesi) • pMig II yapı, Dr Juan Carlos PÇ9-DL1 hücre hattı destekleyen Zuniga-Pflucker (İmmünoloji Bölümü, University of Toronto), ve bu çalışmanın tasarımı yardım için Dr Kent E Vrana (Farmakoloji Anabilim Dalı, Tıp Penn State Üniversitesi). Bu proje Ulusal Kanser Enstitüsü, Barsumian Güven ve Melanom Araştırma Vakfı (J. Şarkısı) adlı Hibe Numarası K18CA151798 ile hibe altında finanse edilmektedir.

<ol><li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
<li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li>
<li>Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+a+tumor-specific%2C+MHC-unrestricted+T-cell+receptor+expressed+on+effector+cells+of+the+innate+and+the+adaptive+immune+system+through+bone+marrow+transduction+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution.</a> Blood. 105, 4583-4589 (2005).</li>
<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
<li>Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoztug%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Peerani, R., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+stem+cell+therapies+through+synthetic+stem+cell-niche+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering.</a> J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329, 1345-1348 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> ACT-temelli tedaviler için, in vivo tekrar infüzyon için son derece reaktif Ag-spesifik T hücreleri çok sayıda in vitro nesil optimal bir yaklaşımdır. Bizim in vitro yöntem iPS hücreleri iPS hücre türetilmiş hücreler, özellikle dört hafta sonra, dört hafta içinde ölmek çok sayıda fonksiyonel dan T hücrelerinin yol açmaktadır rağmen. Bu çentik dan hayatta kalma sinyallerini DL1 hem de IL-7 ve FLt3L iPS hücrelerden türetilen ata T hücrelerinin hayatta kalma korumak için yeterli de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> C57BL/6J fareler </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 000664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 002216 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (2C11) antikoru </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553058 </td></tr><tr><td> Anti-CD28 (37,51) adı geçen antikor </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553295 </td></tr><tr><td> Anti-CD3 (17A2) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 100202 </td></tr><tr><td> Anti-CD4 (GK1.5) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 100417 </td></tr><tr><td> Anti-CD8 (53-6,7) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 100714 </td></tr><tr><td> Anti-CD25 (3C7) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 101912 </td></tr><tr><td> Anti-CD44 (1M7) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 103012 </td></tr><tr><td> Anti-CD117 (2B8) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 105812 </td></tr><tr><td> Anti-TCR-β (H57597) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 109220 </td></tr><tr><td> Anti-IL-2 (JES6-5H4) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 503810 </td></tr><tr><td> Anti-IFN-γ (XMG1.2) antikoru </td><td> BioLegend </td><td> 505822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td> Bir Brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B7651 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td> Entegre Bilimler </td><td> 204130 </td></tr><tr><td> RNA kiti &lt;/ Td&gt; <td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNA seti </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> CD8 İzolasyon Kiti </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> ACK lizis tamponu </td><td> Lonza </td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td> PeproTech </td><td> 250-31L </td></tr><tr><td> MIL-7 </td><td> PeproTech </td><td> 217-17 </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC-anti-OVA antikor </td><td> Rockland Immunokimyasallar </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td> Permeabilization tampon </td><td> Biolegend </td><td> 421002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td></tr><tr><td> Formaldehit </td><td> Sigma </td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0.4 um bir filtreden </td><td> Millipore </td><td></td></tr><tr><td&gt; Moflo Hücre Sıralayıcısı </td><td> Dake Cytomation </td><td></td></tr><tr><td> Calibur Flow Sitometri </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> LSR II Akış Sitometresi </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Fare süzgeç </td><td> Braintree Bilimsel </td><td></td></tr></tbody></table>

t lenfositler doğru İsteyerek pluripotent kök hücrelerinin yönetmen farklılaşma

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Antijen-spesifik CD8 + sitotoksik T lenfositler (CTL) ve evlatlık hücre transferi (ACT) maligniteleri 1 çeşitliliği için umut verici bir tedavi yöntemidir. CTL&#39;leri Malign hücreleri öldürmek için T hücre reseptörleri (TCR) ve serbest sitotoksin gibi sitokinler ile tümör antijenleri etkileşim suretiyle habis hücrelerin tanıyabilirsiniz. Bu CTL&#39;leri yüksek proliferatif potansiyeli var çünkü, az diferansiye ve merkezi-bellek gibi (yüksek derecede reaktif adlandırılır) CTL&#39;leri ACT tabanlı immünoterapi için optimal nüfus olduğu bilinmektedir, daha farklılaşmış hücreler daha apoptoz daha az yatkındır ve sahip bir homeostatik sitokin 2-7 yanıt yüksek yeteneği. Ancak, hastaların bu tür CTL&#39;leri yüksek bir sayı elde zorluklar nedeniyle, başarılı ACT-temelli tedaviler için son derece reaktif Ag spesifik CTL oluşturmak için yeni bir yaklaşım bulmak için acil bir ihtiyaç vardır. Kendini yenilenebilir kök TCR transdüksiyonimmün sulandırma için hücre hastalıkların 8-10 tedavisi için terapötik bir potansiyele sahiptir. Ancak, hastaların embriyonik kök hücreler (EKH) elde etmek için bir yaklaşım mümkün değildir. Tedavi amaçlı hematopoetik kök hücrelerin kullanımı (HKH&#39;lerin) yaygın klinik 11-13 uygulanmış olmasına rağmen, HKH&#39;lerin farklılaşma ve proliferatif kapasiteleri azalmış ve HKH&#39;lerin in vitro hücre kültürleri 14-16 in genişletmek için zordur. Son iPS hücre teknolojisi ve gen aktarımı için in vitro bir sistem içinde bir gelişme, herhangi bir cerrahi yaklaşım olmadan hastaların iPS hücreleri oluşturma yeteneğine sahiptirler. Buna ek olarak, EKH gibi iPS hücreleri, in vitro olarak belirsiz proliferatif kapasitesine sahip olması, ve hematopoietik hücrelerin farklılaşması için gösterilmiştir. Böylece, iPS hücreleri EKH veya HKH&#39;lerin ile karşılaştırıldığında ACT-tabanlı immünoterapi kullanılmak üzere, daha büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, T lenfosit üretimi için yöntemler mevcutin vitro iPS hücrelerden cytes, kanser ve immün gözetim teşvik etmek için iPS hücreleri antijen-spesifik CTL in vivo programlama. Bir Çentik ligand ile in vitro olarak uyarılması iPS hücrelerden T-hücresi farklılaşması sürücüler ve tümör büyümesini engelleyen in vivo antijen-spesifik T hücrelerinin içine ayırt iPS hücreleri içinde TCR gen transdüksiyonu ile sonuçlanır. Böylece, iPS hücreleri antijen-spesifik T hücre farklılaşmasını göstermektedir. Çalışmalarımız ACT-temelli tedaviler için antijen spesifik CTL oluşturmak için bir potansiyel olarak daha verimli bir yaklaşım sağlamak ve hastalıklar için tedavi stratejilerinin geliştirilmesini kolaylaştırmak.

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da göstermektedir<em&gt; In vitro</em&gt; Veya<em&gt; In vivo</em&gt; Indüksiyon sistemi, iPS hücreleri konvansiyonel ve antijen spesifik hem T lenfositlerin içine ayırt edebiliyoruz.

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Antijen spesifik CD8+ sitotoksik T lenfositlerin (CTL'ler) adaptif hücre transferi (ACT), çeşitli maligniteler için gelecek vadeden bir tedavi yöntemidir 1. CTL'ler ...

Bu prosedürün genel amacı, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPS hücreleri) T lenfositleri üretmek ve bunları karakterize etmektir. IPS hücreleri daha sonra in vitro ortamda bir OP9-DL1 kültür sisteminde farklılaştırılabilir ve ardından rag eksik bir farede in vivo olarak olgunlaştırılabilir. Alternatif olarak, hücreler OT-1 TCR'yi aşırı eksprese edecek şekilde genetik olarak mühendislebilir ve ardından in vivo gelişim için adaptif olarak transfer edilebilir.Altı haftalık in vivo diferansiyasyonun ardından, farelere intraperitonal yolla EEG seven tümör hücreleri enjekte edilerek challenge uygulanabilir ve ardından iPS kaynaklı T hücrelerinin antijen spesifisitesi değerlendirilebilir. Nihayetinde, iPS hücreleri hem konvansiyonel hem de antijen spesifik T hücrelerine diferansiye olabilir ve bu hücrelerin ikincileri hayvanları tümör challenge'ına karşı koruyabilir. Bu tekniğin etkileri, kişiselleştirilmiş kanser immünoterapisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem, hastanın minimum miktardaki kan veya deri dokusundan türetilen çok sayıda tümör reaktif T hücresinin üretilmesine olanak tanır. Sıfırıncı günde, %20 FBS içeren alpha MEM ortamında, konfluen bir OP9-DL1 hücre monokatmanına sahip 100 milimetrelik bir kültür kabına 5 × 10⁴ iPS hücresi aktarın. Beşinci günde hücreleri tripsinize edin. Ardından, hücreleri taze bir 100 milimetrelik kültür kabında 30 dakika boyunca 37 °C inkübatörde inkübe ettikten sonra santrifüjleyin. Yüzen hücrelerden 5 × 10⁵ tanesini, %20 FBS içeren alpha MEM ortamı ve fare FLT3 ligandı ile birlikte, OP9-DL1 hücre monokatmanına sahip yeni bir 100 milimetrelik kaba ekleyin. Sekizinci günde, gevşek yapışmış hücreleri nazikçe pipetle aşağı indirin, hücreleri santrifüjleyin ve ardından hücreleri konfluen OP9-DL1 hücreleri ile kaplanmış altı kuyucuklu bir kültür plağının tek bir kuyucuğuna aktarın. Hücreleri 37 °C'de, %5 CO₂ ortamında iki hafta daha inkübe edin. 22. günde.Ayrıştırılmış iPS hücrelerini yeni bir kültür kabında, taze besiyerinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, yüzen hücrelerin yaklaşık yarısını alın, hücre kümelerini ayıklamak için 70 µm naylon süzgeçten geçirin ve elde edilen tek hücre süspansiyonunu soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra hücreleri 1,5 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda PBS içinde resüspande edin ve IV enjeksiyondan önce hücreleri buz üzerinde muhafaza edin.Dört haftalık rag eksik bir fareyi, kuyruk venini genişletmek için bir kızılötesi ışık altına yerleştirin. Ardından, 26,5 gauge iğne takılı bir mililitrelik bir şırıngayı 200 µL hücre süspansiyonu ile doldurun ve hücreleri genişlemiş kuyruk veni aracılığıyla adaptif olarak transfer edin. Üç hafta sonra, adaptif transfer yapılan farenin ötanazyasını onayladıktan sonra, dokuları mekanik olarak parçalayarak lenf düğümlerini ve dalağı çıkarın.Tek hücre süspansiyonunu CK liziz tamponu ile lize edin ve ardından elde edilen mononükleer hücreleri soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücre yüzey markerları için boyama yaptıktan sonra, sıfırıncı günde hücreleri akış sitometrisi analizi ile değerlendirin; birinci günde, plat E paketleme hücrelerini bir OT one MIDR ile gece boyunca transfekte etmek için gene JAMA transfeksiyon reaktifi kullanın; ikinci günde, 1x10⁶ iPS hücresini %0,1 jelatin ile ön kaplanmış 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna ekleyin; santrifüjden sonra, plat E hücrelerinden psödovirüs içeren supernatantı toplayın ve potansiyel kontaminantları dışlamak için 0,4 mikronluk bir filtreden geçirin. Hücreleri polybrene varlığında bir saat boyunca 330 ×g'de 32 °C'de transdüse edin.Transdüksiyon prosedürünü tekrarladıktan sonra, hücreleri aynı sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Dördüncü günde transdükse edilmiş iPS hücrelerini tripsinleyin ve ardından pelletleme işleminden sonra hücreleri taze medyada yeniden süspande ederek önceden kodlanmış ışınlanmış snl 7 6 7 feeder hücreleri üzerine ekini yapın. Transdükse edilmiş hücreler konfluense ulaştığında, GFP ve DS red çift pozitif hücreleri akış sitometrisi ile ayıklayın.IPS hücrelerinin adoptif transferinden altı hafta sonra, tümör challenge'ının 50. gününde, aynı farenin periton boşluğuna 50 µL EEG seven thoma hücresi enjekte edin. Adoptif transfer yapılan hayvanın dalak ve lenf düğümlerinden CD8 pozitif T hücrelerini ayırmak için Miltenyi Biotec CD8 pozitif T hücresi izolasyon kiti kullanın. İzole edilen CD8 pozitif T hücrelerini, naif bir C57BL/6J faresinden alınan ışınlanmış SPOC hücreleri ile 1:10 oranında karıştırın ve ko-kültürü 40 saat boyunca 0,5 µmol/mL OVA ile pulse edin.Ardından, hücrelere dört saat daha felden A ekleyin. Son olarak, hücre popülasyonlarını akış sitometrik analiz ile değerlendirin. Naif bir C 57 black six J faresinden SP sitleri izole ettikten sonra, hücre süspansiyonunu iki gruba ayırın.CFSE yüksek grubunu mililitre başına beş mikromol CFSE ile işaretleyin ve hücreleri mililitre başına 10 mikrogram ova peptidi ile bir saat boyunca pulse edin; CFSE düşük grubunu ise mililitre başına 0,5 µM CFSE ile işaretleyin ve pulse uygulamayın. 2,5 × 10⁶ CFSE yüksek hücreyi, PBS içerisinde 2,5 × 10⁶ CFSE düşük hücre ile karıştırın. Ardından, hücreleri CFSE ekspresyonu için akış sitometrisi ile analiz edin.İlgili fareye adaptif transfer yapıldıktan 16 saat sonra; tümör challenge'ının 20. gününde intraperitoneal tümör hücrelerini saymak için. Periton boşluğunu yıkamak amacıyla, 18,5 gauge iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga ve soğuk PBS kullanın. Tümör infiltre eden hücrelerin belirlenmesi için geri kazanılan tümör hücrelerini sayın.Tümör challenge'ının geç bir aşamasında tümörü çıkarın ve ardından tümörü üç parçaya bölün. İlk tümör parçasını bir kriyotüpe yerleştirin ve tüpü kuru buz üzerine koyun. İkinci parçayı derhal formaldehit ile sabitleyin.Kriyokorunan doku kesitlerini havada kuruttuktan sonra üçüncü parçayı kondisyonlu RPMI 1640 medyumunda muhafaza edin. Sabitlenmiş kesitleri 15 dakika daha havada kuruttuktan sonra soğuk asetonda 15 dakika boyunca sabitleyin. Yıkama işleminin ardından lamları PBS içerisinde beş dakika boyunca yıkayın.Slaytları nemli bir hazneye yerleştirin ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için doku kesitlerini 30 µL %3 B, SA ve PBS ile 30 dakika boyunca örtün. Ardından bloklama tamponunu kurulayın ve doku kesitlerini, %3 PSA içeren PBS içinde seyreltilmiş 50 µL pe anti TCR RV alpha two antikoru ve fitzy anti ova antikoru karışımı ile nemli haznede iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda slaytları soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve son olarak, tümör infiltre T hücrelerinin akış sitometrik analizi için floresan mikroskobik incelemeden önce kesitleri su bazlı bir montaj medyası ile kapatın.Tümörü tek hücre süspansiyonu haline getirin. Ardından hücreleri spesifik yüzey belirteçleri açısından analiz edin. IPS hücrelerinin notch ligandı DL1 ile stimülasyonunun T hücrelerine katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için T hücresi belirteçleri olarak CD3 ve TCR beta kullanılmıştır; CD3 pozitif TCR beta pozitif IPS hücre türevli hücrelerde CD4 ve CD8 hücre yüzeyi ekspresyonu değerlendirilmiştir.Sağdaki, in vitro ortamda iPS hücrelerinden üretilen gün 22 CD3 pozitif TCR $\beta$ pozitif CD4 negatif CD8 pozitif tek pozitif T hücrelerini gösteren nokta grafiğine dikkat ediniz. Ayrıca, önceki şekildeki iPS hücre türevli tek pozitif hücreler, plaka kaplı anti-CD3 ve çözünür anti-CD28 antikorları ile in vitro stimüle edildiklerinde interlökin 2 ve interferon gama üreterek, iPS hücre türevli T hücrelerinin alıcı farelere adaptif transfer sonrası fonksiyonel olduğunu doğrulamıştır. TCR geni transdükse edilmiş iPS hücrelerinin çoğunluğu, birleştirilmiş lenf nodu ve dalak hücrelerinden elde edilen bu nokta grafiklerinde, interlökin 2 ve interferon gama salgılayarak peptit stimülasyonuna in vitro yanıt veren CD8 pozitif CTL'lere diferansiye olmuştur.CD8 pozitif V beta 5 pozitif T hücreleri, TCR ile transdüse edilmiş IPS hücrelerinin adoptif transferi yapılan farelerde üretilirken, kontrol transdüksiyonu yapılan farelerde üretilmemiştir. CD8 pozitif V beta 5 pozitif popülasyonlar, interlökin 2 ve interferon gamma üretimi için yapılan hücre içi sitokin boyamasında pozitif sonuç vermiştir; bu durum, gölgeli izotip kontrol histogramlarına kıyasla bu histogramlardaki koyu çizgilerle gösterilerek IPS türevli CTL'lerin fonksiyonel olduğu belirtilmiştir. Bu veriler, IPS hücresi transferinden 10 hafta sonra veya OT-I CTL transferinden bir gün sonra farelere enjekte edilen, her grafikte sağdaki piklerle temsil edilen eptit ile pulse edilmiş CFSE yüksek hücreleri ve soldaki piklerle temsil edilen CFSE düşük kontrol hücrelerini göstermektedir.Antijen spesifik IPS kaynaklı CTL'ler antijen stimülasyonuna yanıt verdi ve buradaki CFSE yüksek hücrelerin yokluğuyla belirtildiği üzere sitotoksik aktivite sergiledi. OT-1 TCR geni transdükse edilmiş IPS hücreleri C57BL/6 farelere adaptif olarak transfer edildi ve ardından farelere EEG7 tümör hücreleri ile challenge uygulandı; 20. günde periton boşluğundaki tümör hücreleri sayıldı. Kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında, TCR TRANSDÜKSE IPS alan farelerdeki tümör hücre sayılarındaki anlamlı azalmaya dikkat ediniz.En önemlisi, TCR transduksiyonu yapılmış iPS hücrelerinin adaptif transferi, aşırı reaktif CTL'lerin tümör dokularına infiltrasyonunu tetiklemiş ve hayvanları tümör meydan okumasından korumuştur; bu durum, tümör meydan okumasından 30 ila 35 gün sonra geri kazanılan tümör dokularının şu H&E boyamasında görülmektedir; TCR transduksiyonlu hücreler veya OT-I CTL'leri adaptif olarak transfer edilen farelerden alınan tümörlerde bu durum görülürken, mock enjekte edilenlerde veya kontrollerde görülmemiştir. Transduksiyonlu hücreler, buradaki kırmızı oklarla belirtildiği üzere inflamatuar hücreler tarafından infiltre edilmiştir. Kırmızıyla gösterilen Ova spesifik V$\alpha$2 pozitif CTL'lerin, yeşille gösterilen Ova eksprese eden tümör dokularına infiltre olduğu tespit edilmiştir.Kontrol gruplarındaki farelerin tümörlerinde bu şekilde daha az tümör infiltre hücre bulunmasına veya hiç bulunmamasına rağmen, tümör dokularından elde edilen tek hücre süspansiyonları, CD sekiz pozitif popülasyona kapıleme (gating) yapıldıktan sonra V alfa iki pozitifliği ve V beta beş pozitifliği yönünden akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. TCR Transdükte edilmiş IPS hücreleri adaptif olarak transfer edilen farelerden alınan tümör dokularının en yüksek düzeyde tümör infiltre hücreleri sergilediğine, kontrol Transdükte IPS alan farelerin tümörlerinde ise ova spesifik CD sekiz pozitif T hücreleri tarafından hiçbir infiltrasyon görülmediğine dikkat ediniz.Bu videoyu izledikten sonra, iPS hücrelerinden antijene özgü T hücrelerinin nasıl üretileceği ve iPS kaynaklı T hücrelerinin fonksiyonlarının nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

directed-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-towards-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Video, farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonunu inhibe etmek için insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi CD8+ T hücrelerinin kullanıldığı bir testi göstermektedir. HBV'ye özgü reseptörlerle tasarlanan bu T hücreleri, transgenik farelere aktarılır. Replikasyona yetkin HBV genom plazmitleri daha sonra doğrudan karaciğere enjekte edilerek viral DNA alımını sağlar. Viral antijenler hibrid MHC-I molekülleri tarafından eksprese edilip sunulduğunda, tasarlanmış T hücreleri bu...

Viral Antijene Özgü T Hücreleri Kullanılarak Hepatit B Virüsü Replikasyonunun Baskılanması

Bu video, tümör antijenine özgü indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi CD8αβ+ T Hücreleri oluşturmak için bir testi göstermektedir. Tümör antijenine özgü iPSC'ler, stromal hücreli bir tek tabaka üzerinde büyütülür ve hematopoietik progenitör hücrelere (HPC'ler) farklılaşır. HPC'ler, bir farklılaşma ortamı kullanılarak CD4 + CD8 + çift pozitif T hücrelerine farklılaştırılır. Bu hücreler daha sonra CD8 eksprese eden tek pozitif T hücreleri oluşturmak üzere uyarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Tek Pozitif CD8 T Hücrelerinin Üretilmesi

Fare embriyonik kök hücreleri, OP9-DL1 ko-kültür sistemi kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırılabilir. Bu prosedürde başarı, reaktif/hücre bakımına ve tekniğe duyarlı temel adımlara dikkat edilmesini gerektirir. Burada bu kritik parametreleri tartışıyor ve bu teknolojinin benimsenmesini teşvik etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokolün amacı, melanom tümörüne sızan lenfositlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanması için protokolü göstermektir.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, bir murin modelinde otoimmün artritin immünoterapisi için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) fonksiyonel antijene (Ag) özgü düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Bu makalede, OP9/DLL1 co-kültür sistemini kullanarak fonksiyonel tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş CD8αβ+ tek pozitif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Öğrenin, iPS hücrelerinden T lenfositleri üretme ve karakterize etme yöntemini. Bu teknik, kanser immünoterapisinde kişiselleştirilmiş tedavi potansiyeli sunar.

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Daha fazla video keşfet