Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Küçük pikolitre boyutunda damlalar halinde kapsüllenmiş hücreleri kullanan uygulamalar, genellikle damla başına hücre sayısını kontrol edememe ile sınırlı kalmıştır. Bu protokol, iki farklı mikroakışkan fenomeni, akışkan dinamik hücre sıralamasını ve akış odaklı bir mikro nozulda damla oluşumunu birleştirerek hücre kapsüllemesini kontrol etmek için bir yöntem gösterir. Bir yukarı akış kanalında, aşağı akış yönünde eşit aralıklı trenlerin oluşumuna neden olmak için askıda hücreler veya parçacıklar ile yeterince yüksek bir sulu çözelti akış hızı sağlanır.

Bir yüzey aktif madde stabilize edilmiş kabul edilebilir yağ taşıyıcı sıvısında kilohertz oranlarında sulu damlalar oluşturmak için bir akış odaklamalı damla oluşturma nozulu kullanılır. Sıralı hücre parçacık dizileri daha sonra, parçacıklar hücre vekilleri olarak kullanılırken, damla üretim nozülünde uzunlamasına sıralı hücrelerin veya parçacıkların gelişiyle senkronize edilen damla üretim hızlarını sağlamak için sulu ve yağ akış hızlarını ayarlayarak damla üretimi ile birleştirilir. Bu protokolü göstermek için akış hızları, sıvıyı sınırlayacak kadar küçük olmalıdır.

Biyolojik hücreler üzerindeki katıksız stresler, hücrenin üst üste binmesi, damla oluşumu ve hücre canlılığı sırası. Sulu akış hızı kısıtlamaları, tekli ve çoklu hücrelerin kontrollü kapsüllenmesi için ideal bir çalışma rejimi sağlar. Video mikroskobu verilerinin analizi, hem tek hem de çift hücreli veya parçacık kapsülleme verimliliklerinin rastgele kapsülleme verimliliklerinden daha iyi performans gösterdiğini ve istenen sayıda hücre veya parçacık içermeyen damla sayısını büyük ölçüde azalttığını göstermektedir.

Hücrelerin ve damlaların hapsedilmesi, hücre salgılarının seyreltilmesini sınırlar, hücre heterojenliğini vurgular ve ayrıca toplu bir süspansiyonla karşılaştırıldığında hücreler arası sinyalleri kontrol eder. Bu hücreleri damlalar halinde kapsüllemek için etkili araçlar, biyolojik araştırmacılar için değerli bir araç sağlar Bu işleme başlamak için. AutoCAD yazılımında bu şekilde gösterildiği gibi bir mikro kanal deseni tasarlayın.

Uzun kanal bölümü, 27 mikron genişliğinde sulu akış sipariş kanalını temsil eder. Büyütülmüş nozul şeması, sulu sipariş kanalı ve yağ kanalı için 27 mikronluk eşit kanal genişliklerini, ardından 22 mikronluk nozul büzülmesini ve daha geniş bir 61 mikronluk kanala ani genişlemeyi gösterir. Cihaz yüksekliği 52 mikrondur.

Hem sulu hem de yağ girişleri, yağ girişinin bu büyütülmüş şemasında gösterildiği gibi, sipariş kanalı genişliğine göre boşluklara sahip büyük kalıntı filtrelerine sahiptir. Gösterilen. İşte boya enjekte edilen sipariş kanalının ve nozülün gerçek bir görüntüsü. Kanalların koyu bir arka plan üzerinde saydam olduğu Mylar film veya kuvars üzerine yüksek çözünürlüklü bir saydamlık maskesi basmak için üçüncü taraf bir üretici kullanın.

Daha sonra, replika kalıplama için bir silikon ve SU sekiz fotorezist master oluşturun. PDMS replika kalıplama için ana kalıbı bir Petri kabının altına bantlayın. Replika kalıplama tamamlandıktan ve cihaz taslağı kesildikten sonra, bu şekilde gösterilen üç yuvarlak bölgedeki akışkan portları delmek için 0.75 milimetre dış çaplı bir biyopsi zımbası kullanın, PDMS'nin desen tarafına sevgili bir viski bandı ve plazma bağlamasından sonra herhangi bir tozu temizlemek için soyun.

PDMS'yi temiz bir cam mikroskobu kaydına. Tüm cihazı bir fırına yerleştirin ve fırını kademeli olarak 120 santigrat dereceye kadar ısıtın. Yapıştırmayı tamamlamak ve PDMS'yi orijinal hidrofobik durumuna döndürmek için cihazı gece boyunca 120 santigrat derece fırında bırakın.

Kanalın cam yüzeyini hidrofobik hale getirmek için alternatif bir yöntem, akışkan portlara aquae gibi bir kaplama enjekte etmek ve ardından hava ile temizlemektir. Bir mililitrelik bir şırınga ve bir şırınga iğnesi kullanarak birkaç yüz mikrolitre hava çekin, ardından sadece metal şırınga ucunu dikkatlice doldurmaya yetecek kadar küçük bir miktar aquil koyun, ancak suyu sıkıca enjekte edin ve ardından temizleme havasını akışkan portlara enjekte edin. PDMS'yi kırmadan cama agresif bir şekilde bağlanır.

Kuruduktan sonra kanalları tıkayabilecek herhangi bir tortuyu önlemek için fazla suyu silerken tüm giriş ve görünüm portlarında hava tahliyesini tekrarlayın. Hücre konsantrasyonunu kontrol etmek, uygun sayıda hücreyi uygun damla sayısına ulaşmak için çok önemlidir. Bunun iki zorlu bileşeni vardır.

Birincisi, uygun konsantrasyonu önceden tahmin etmektir ve ikincisi, deney sırasında bu konsantrasyonu korumaktır Bu çalışmada kullanılan belirli bir cihaz için, sekiz ila 15 mikron hücre veya parçacık, kontrollü kapsülleme için yeterli şekilde sıralanmalıdır. Bu gösterimde, 9.9 mikronluk polis günlük mikro küreler, ideal denetim kapsüllemesini elde etmek için sulu partikül süspansiyon konsantrasyonunu hazırlamak için hücre vekilleri olarak kullanılacak, tam sipariş için önceki verileri kullanarak ağırlıkça %1 katı maddelik bir mikroküre stok konsantrasyonu ile başlayacaktır. Bir kılavuz olarak, stok numunesinin bir mililitresini nazikçe santrifüjleyerek, 250 mikrolitre supinat sıvıyı çıkararak ve parçacıkları girdap karıştırma veya daha yumuşak karıştırma ile Resus süspanse ederek konsantrasyonu %1,5 katıya yükseltin.

Hücreleri kullanırken, hem hücreler hem de polistiren parçacıkları, bu videoda gösterilmemesine rağmen, birden büyük bir özgül ağırlığa sahiptir. Dakikalarca ila saatlerce süren uzun süreli deneyler için, çözelti, partiküller için kalsiyum klorür veya hücreler için opti prep gibi bir çözünen madde eklenerek yüzdürme ile eşleştirilebilir. Hücre veya partikül süspansiyonu hazır olduktan sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpü girdabında sürekli florokarbon yağı fazının 10 mililitrelik bir numunesini hazırlayın.

Yüzey aktif madde ve florokarbon yağını ağırlığın yaklaşık %2,5'ine kadar karıştırın. Burada, mikro kapsülleme deneyini kurmak için kabul edilebilir olan 2.4 ağırlık karışımında bir ağırlık elde ediyoruz. İlk olarak, ters çevrilmiş optik mikroskop ve yüksek hızlı kameranın gücünü açın.

Mikro kanal katmanına odaklanın ve kanallarda tıkanıklık ve yerinden çıkabilecek kalıntılar olup olmadığını kontrol edin. Büyük kalıntılar veya belirgin tıkanıklıklar olmayan bir kanal seçin. Ölü hacmi en aza indirmek için sulu giriş yağı girişi ve emülsiyon çıkışı için üç uzunlukta yarı saydam tigon PVC boru kesin.

Şırınga pompalarından mikroskoba ulaşacak kadar boru kesin. Kademeli kesilmiş boru uçları 45 derecelik bir açıyla Akışkan portlara yerleştirmeyi kolaylaştırmak için, tüp uçlarını akışkan portlara oturtmak için cımbız kullanın. Ardından, 30 gauge kör uçlu paslanmaz çelik şırınga iğnesini sulu giriş borusunun serbest ucuna bastırın.

Yağ giriş borusu için tekrarlayın. Cihazı hareket ettirin ve 20 kez objektif hizalama kullanarak hortumu mikroskop aşamasına takın ve cihaz nozuluna odaklanın. Odak düzleminde optimum aydınlatma sağlamak için Kohler aydınlatması için mikroskobu manuel olarak ayarlayın.

Yüksek hızlı kamera yazılımını kullanarak, daha yüksek kare hızlarına izin vermek için nozulun etrafındaki görüş alanını kırpın ve ardından optimum kayıt için kare hızını, pozlama süresini ve diğer kamera ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın. Daha sonra, bir mililitrelik bir şırıngayı önceden hazırlanmış iyi karıştırılmış sulu faz çözeltisi ile doldurun. Üç mililitrelik bir şırıngayı yağ fazı çözeltisiyle doldurun.

Doldurulmuş şırıngalardan birini dikey olarak eğin ve hava kabarcıklarını şırınga çıkışına taşımak için hafifçe vurun. Şırıngayı dikey olarak tutarak havayı şırınga ucuna itecek kadar uzun süre pistona yavaşça bastırın. Şırıngayı, cihaza önceden bağlı olan ilgili şırınga iğnesine bağlayın.

Sıvı, borudan neredeyse cihaza itilene kadar havayı şırınga iğnesi ölü hacminden zorlamak için pistona bastırın, şırıngayı bir şırınga pompasına güvenli bir şekilde monte edin ve piston bloğunu devreye sokun. İkinci şırınga için bağlantıları tekrarlayın ve her bir şırınga pompasındaki ikinci bir şırınga pompası gücüne monte edin ve her pompayı programlayın. Üreticinin protokollerini kullanarak, ilk akış hızlarını yağ fazı için dakikada 50 mikrolitre ve dakikada beş mikrolitre olarak ayarlayın.

Sulu faz başlangıcı için, pompalar her sıvının cihaza girmesini bekler ve kalan ölü havayı dışarı iterek kanalları doldurur. Bu, ilk akış hızları kullanıldığında birkaç dakika sürebilir. Memede damla oluşumunu gözlemleyin.

Uzun sulu çözelti kanalındaki partiküllerin sırasını gözlemlemek için sulu akış hızını yavaşça artırın. Akış hızı artışları, akış hızını, bu örnekte gösterildiği gibi nozulda sulu sıvı akışının püskürtülmesinin tetiklendiği noktaya kadar artırmadığından, farklı bir damla oluşturma nozulu notu kullanarak, kararsız akış ve tutarsız damla buradadır. Partikül konsantrasyonu, nispeten az sayıda eksik partikül içeren alternatif trenler sağlamak için çok düşükse ve numunenin kaldırma kuvveti eşleşmediyse, partiküllerin şırınga çıkışlarına doğru kademeli olarak çökelmesini sağlamak için şırınga pompasını fiziksel olarak şırınga çıkışına doğru eğin.

Yeterli sipariş oluştuğunda, damlaların üretim sıklığını ve boyutunu ayarlamak için yağ akış hızını ayarlayın. İstenen kapsülleme hızlarını ve düşme hacimlerini elde etmek için her iki akış hızını da yinelemeli olarak ayarlayın. Kararlı sıralı kapsülleme onaylandıktan sonra, çıkış borusunu atık haznesinden ileride kullanmak üzere bir toplama haznesine taşıyın.

Tek ve çift parçacıklı veya hücre kapsülleme, yüksek verimlilikte elde edilebilir. Burada gösterilen bu protokolün kullanılması, dakikada 60 mikrolitrelik bir yağ akış hızı ve dakikada dokuz mikrolitrelik bir sulu akış hızı ile tek parçacıklı kapsüllemenin temsili bir sonucudur. Lambda, düşme için ortalama parçacık sayısı 0.95'tir.

Akış yönündeki partikül aralığı, tam sıralı alternatif partiküller için yaklaşık 17 ila 18 mikrondur. Bu örnekteki damla üretim hızı 6,1 kilohertz'dir ve ortalama damla boyutu 24,4 pikolitredir. Histogram, tek parçacık kapsülleme sırasının damla kapsülleme parçacık verimliliğini artı ile karşılaştırır.

İstatistiklerde, 517 damlalık bir örneklem büyüklüğü için rastgele kapsülleme, bir parçacık içeren damlaların ortalama fraksiyonu %79,5'tir%36,7'lik tahmin edilen rastgele kapsülleme fraksiyonunun aksineDoğru kapsüllenmiş damlalarda sona eren partiküllerin fraksiyonunun, 491 parçacıklık bir örneklem boyutu için %83,7 olduğu gözlemlenmiştir, rastgele kapsülleme fraksiyonu %37.3 iken, çift partikül kapsüllemesi, sulu akış hızını dakikada dokuz mikrolitrede tutarken, yağ akış hızını dakikada 30 mikrolitreye düşürerek elde edilir. Burada lambda, damla başına ortalama parçacık sayısı 1.8'dir. Tek parçacıklı kapsüllemeye benzer.

Akış yönündeki partikül aralığı, tam sıralı alternatif partiküller için yaklaşık 17 ila 18 mikrondur. Daha büyük damlaların ortalama damla boyutu 39.8 pikolitredir ve rastgele kapsüllemeye kıyasla 3.8 kilohertz oranında oluşmuştur. 383 damlalık bir örneklem büyüklüğü için, iki parçacık içeren sıralı kapsülleme damlalarının ortalama fraksiyonu, %26,8'lik tahmin edilen rastgele kapsülleme fraksiyonunun aksine %71,5'tir. Doğru kapsüllenmiş damlalarda ortaya çıkan partiküllerin fraksiyonunun, 689 parçacıklık bir numune boyutu için %79,5 olduğu gözlemlenirken, rastgele kapsülleme fraksiyonu %33,4 idiAlındı.

Birlikte, bu sonuçlar hem tek hem de çift parçacıklı kapsülleme verimliliklerinin rastgele kapsülleme verimliliklerinden iki kattan fazla daha iyi performans gösterdiğini ve istenen sayıda hücre veya parçacık içermeyen damla sayısını büyük ölçüde azalttığını göstermektedir. Yüksek kapsülleme verimliliği için uygun partikül veya hücre konsantrasyonlarının önemi bu deneysel çalışmada gösterilmektedir. Yağ ve sulu akış hızları, daha önce gösterilen çift parçacıklı kapsülleme çalışmasındaki ile aynı olsa da, damla lambda başına ortalama hücre sayısı 1.57'ye düşürülür.

Sonuç olarak, tam sıralama gerçekleşmez ve bu nedenle trenlerde delikler ortaya çıkar ve güneş damlalarını beklenenden daha az parçacıkla bırakır. Bu histogram, Lambda'nın daha düşük değeri nedeniyle iki parçacıklı kapsülleme için azalan verimliliği gösterir. 324 damlalık bir numune boyutu için, iki parçacık içeren damlaların ortalama oranı %55.9 idi ve neredeyse çift parçacık damlası kadar tek parçacık damlası vardı.

Bu, damla başına daha az veya daha fazla hücrenin tolere edilebilir olup olmadığına bağlı olarak, doğru şekilde kapsüllenmiş parçacıkları veya seçilen lambda'nın tam değerine sahip hücreleri en üst düzeye çıkarmak için Lambda'nın damla başına istenen hücre sayısına eşit veya yakın olması gerektiğini gösterir. Bu gösterimde, deney sırasında konsantrasyonun gerçek zamanlı kontrolünü sağlamak için kaldırma kuvveti uyumsuzluklarından yararlanıyoruz. Bununla birlikte, daha uzun süreli deneyler için, hücrelerin sulu damlalar halinde kapsüllenmesini takiben daha tutarlı sonuçlar için yüzdürme eşleşmesi tavsiye edilebilir.

Zamana bağlı deneyler, bir santrifüj tüpünde veya mikroskop altında, damlaların mikroakışkan dizilere yeniden enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilir.