Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Sıvı biyopsi yoluyla hassas onkolojiyi ilerletmek için yüksek performanslı CTC izolasyon ve analiz yöntemleri geliştirmeye odaklanıyoruz. Mevcut ticari CTC izolasyon platformları düşük verimlilik ve verimliliğe sahiptir. Ayrıca, biyolojik bilgi geri kazanımını sınırlayan aşağı akış analiz platformlarıyla da uyumsuzdurlar.

Bu çalışma, tespit oranlarını büyük ölçüde artırmak için mikrofluidik bir CTC izolasyon platformu kullanmaktadır. Ayrıca, daha derin sıvı biyopsi analizi için nadir bir hücreli tek hücreli dizileme çipi uygularız. Başlangıç olarak, 25 mikrolitre yıkanmış ve yeniden askıya alınmış streptavidin değiştirilmiş manyetik boncukları bir mikrogram biyotinile EpCAM antikoru içeren bir tüpte pipetleyin.

Karışımı oda sıcaklığında, dakikada 20 devir hızla 40 dakika boyunca döndürerek immünomanyetik boncukları hazırlamak için kuluçka yapın. Manyetik bir raf kullanarak boncukları süpernatanttan ayırın. Süpernatant çıkarıldıktan sonra, boncukları 25 mikrolitre izolasyon tamponunda tekrar askıya alın.

Manyetik boncuk süspansiyonundan 20 mikrolitre pipetle bir ila iki saniye içinde hava kabarcıklarının oluşmamasını sağlar. Çipi hemen dikey olarak bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve boncukların beş dakika boyunca rahatsız etmeden yerleşmesini sağlayın. Dört mililitre kan örneği bir şırıngaya toplanarak hava kabarcıklarının temizlenmesinden emin olun.

Çipin giriş ve çıkışını sıvı ile kapatarak hava kabarcıklarını giderin, ardından örnek giriş ve çıkış tüplerini çipe yerleştirin. Bir şırınga pompası kullanarak, numuneyi saatte 1,5 mililitre akış hızında enjekte edin. Numune yüklendikten sonra, bağlanmamış hücreleri yıkamak için HB çipine saatte 0,2 mililitre akış hızıyla 60 mikrolitre DPBS enjekte edilir.

Mıknatıst çıkarılır ve çipi yıkamak ve yakalanan tümör hücrelerini serbest bırakmak için manuel olarak 1,5 mililitre %5BSA enjekte edilir. Etanolde %10 MPTS çözümü hazırlayın. Hemen 20 mikrolitre çözeltiyi HB çipine sokup oda sıcaklığında bir saat kuluçka yapın.

HB çipini bir kez susuz etanol ile durulayın, ardından 100 derece Celsius'ta bir saat kurutun. Sonra, GMBS çözeltisini etanolde mililitrede 0,5 miligram konsantrasyonda hazırlayın. Çipi 37 derece Celsius'a soğuttuktan sonra GMBS çözeltisi eklenin ve kuluçka yapın.

HB çipini iki kez çift damıtılmış suyla durulayın, ardından DPBS ile iki kez durulayın. HB çipine hemen mililitrede 15 mikrogram streptavidin ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört derece Celsius'ta kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra HB çipini DPBS saliniyle iki kez durulayın.

Şimdi CD45 antikor tamponunu %0,2 BSA ve mililitrede 20 mikrogram biyotinile CD45 antikoru DPBS'ye ekleyerek hazırlayın ve son hacme göre ayarlayın. Beyaz kan hücrelerinin negatif seçilimi için HB çipine 20 mikrolitre CD45 antikor tamponu enjekte edin. Oda sıcaklığında bir saatlik kuluçkadan sonra çipi DPBS ile durulayın.

HB çipine %3BSA ve %0.05Tween 20 içeren bir bloklama çözeltisi ekleyin. Hazırlanan örneği bir şırıngaya üfleyin, hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Sonra çipin giriş ve çıkışını sıvı ile mühürleyin ve giriş ile çıkış tüplerini çipe bağlayın.

Bir şırınge pompası kullanarak, örneği saatte 0,6 mililitre akış hızında enjekte edin. Çip çıkışından saflaştırılmış tümör hücrelerini saymak ve tek hücre dizileme için toplamak. DPBS'de hazırlanmış %0,5 F-68 çözeltisi 200 mikrolitreyi çip girişine pipetleyin.

Çipi tutarken su banyosu sonikasyonu yapın. Mikro gözenekli bölgede baloncuklar göründüğünde, çift kuyulardan kabarcıkları çıkarmak için sonikasyona 30 saniye devam edin. Sonra, 60.000 çift kuyu içeren çipe 200 mikrolitre tümör hücresi süspansiyonu enjekte edilir.

Çipteki hücre süspansiyonunu nazikçe iki kez yukarı aşağı pipetleyin. Sonra tekrar beş dakika boyunca renk giderici bir shaker koyarak yakalanmamış hücreleri tekrar askıya alın ve tekrar yerleşmelerine izin verin. Şimdi 200 mikrolitre DPBS ve %0,5 F-68 solüsyolu girişten ve çıkıştan aspirasyon ekleyin.

Barkodlu boncuk askısını yeniden askıya aldıktan sonra, hemen çip girişine 200 mikrolitre süspansiyon enjekte edin ve 20 saniye boyunca dakikada 10 devirde sallayın. Pipet boncuk süspansiyonunu iki kez nazikçe koyun, sonra tekrar silkeleyiciye koyun. Şimdi çıkıştan barkodlu boncuk süspansiyonunu çıkarın, ardından 20X Tris-EDTA ve 50 millimolar ditiothreitol çözeltisi 200 mikrolitre pipetleyin.

Sıvıyı prizden çekin. Hücre lizisi ve MRNA yakalaması için, çip girişine yavaşça 200 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. Çift kuyuları kapatmak için hemen 200 mikrolitre mineral yağ ekleyin.

Çip çıkışından atık rezervuarına akan çözeltiyi çıkarın. Sonra çipi yatay olarak yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Girişe yavaşça 200 mikrolitre 6X tuzlu sodyum sitrat çözeltisi ekleyin.

Atık sıvıyı çıkarın ve kalan çözeltiyi çip çıkışından aspire edin. Çipi doldurmak için yavaşça 200 mikrolitre 6X tuzlu sodyum sitrat ekleyin. Bir mıknatısı çip yüzeyine yakın tutun ve barkodlu boncukları toplamak için girişten çıkışa yavaşça hareket ettirin.

Çözelti ve boncukları hızla 6X tuzlu sodyum sitrat içeren bir santrifüj tüpüne aspire edin. Barkodlu boncukları 200 mikrolitre 6X tuzlu sodyum sitrat ile üç kez yıkayın, ardından bir kez ters transkripsiyon tamponuyla yıkayın. Manyetik alan altında eşit bir immünomanyetik boncuk dağılımı gözlemlenmiş, manyetik çıkarmadan sonra minimal kalıntı boncuklar ise başarılı bir şekilde serbest bırakılmıştır.

CTC izolasyon çipi, hem 1 mililitre hem de 10 mililitre örneklerden tümör hücrelerini etkili şekilde yakaladı. Arıtma çipinin eklenmesi tümör hücresinin saflığını daha da artırdı. Minimal LNCaP hücreleriyle takviye edilen periferik kan örneklerinde, CTC ayırma sistemi yüksek yakalama verimliliği ve saflığını korudu.

Tek hücreli barkod çipi, %85,6 hücre ve %95,7 barkodlu boncuk doluluk oranı elde ederek %81,9 eşleşme oranı elde etti. Yüklü hücre sayısının artırılması, yakalama verimliliğini azaltmadan mikro kuyu doluluk oranını iyileştirdi. Entegre CTC izolasyonu ve tek hücre dizileme iş akışı, yüksek saf tümör hücreleri üretmiş ve orijinal tümör hücre oranlarını doğru şekilde korudu. TSNE analizi, PC3, LNCaP ve Jurkat hücrelerini benzersiz belirtici ekspresyonuyla karakterize edilen üç kümeye ayırdı.

Jurkat hücre kümesi, TRBC1, IGLL1, CD1E ve CD3D'nin güçlü ekspresyonuyla tanımlandı ve T-hücre aktivasyonu için yol zenginleştirmesiyle doğrulandı. PC3 ve LNCaP kümeleri, PC3'ün yüksek mikroseminoprotein ekspresyonu, LNCaP'nin ise NEDD4'ü eksprese ettiği farklı ekspresyon genlerle ayrıldı.