Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Bu prosedürün genel amacı, küçük hücre popülasyonlarını yetiştirmek ve uyarmak ve moleküler analizler için hücre lizatlarını geri kazanmak için yarı otomatik mikroakışkan tabanlı bir platform oluşturmak ve kullanmaktır. Bu, ilk olarak hücre perfüzyon odaları olarak adlandırılan fibronektin kaplı mikro kılcal damarlarda mikro ölçekli hücre kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, perfüzyon odalarını, reaktiflerin mikro ölçekli hücre kültürlerine ve bu hücrelerden yönlendirilmesi için esnek bir araç sağlayan bir dijital mikroakışkan veya DMF modülüne bağlamaktır.

Daha sonra, DMF modülü, ilgilenilen uyarıyı perfüzyon odalarına iletir ve hücreler, önceden belirlenmiş bir maruz kalma süresi boyunca uyaranla inkübe edilir. Son olarak, hücreler kimyasal yollarla parçalanır ve lizatlar moleküler analiz için DMF modülüne geri kazanılır. Geri kazanılan lizatlar daha sonra hücre popülasyonunun uyarana transkripsiyonel tepkisini karakterize etmek için kantitatif R-T-P-C-R kullanılarak analiz edilir.

Bu tekniğin geleneksel hücre kültürleme yöntemlerine göre en büyük avantajı, bu teknikle küçük miktarlarda hücre kullanarak hücre stimülasyon çalışmaları yapabilmeniz ve ayrıca az miktarda reaktif kullanabilmenizdir. Araştırmamız, platformun hücreleri ve reaktifleri mikro ölçekte hassas bir şekilde ele almasının, deney değişkenliğini deney yapmak için deneyi en aza indirdiğini göstermiştir. Platform aynı zamanda çok yönlüdür.

Dijital mikro akış modülü, hücreleri ve reaktifleri perfüzyon odalarına ve perfüzyon odalarından büyük bir esneklikle yönlendirebilir, böylece deneyler hızlı ve kolay bir şekilde özelleştirilebilir ve yeniden yapılandırılabilir. Başlamak için, mililitre fibronektin başına 50 mikrogramlık steril bir çözelti hazırlayın ve mikro kılcal iç yüzeylerin kaplanmasını hızlandırmak için her bir mikro kılcal damara 30 mikrolitre çözelti çekmek için çok portlu bir şırınga pompası kullanın. İki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, daha sonra fibronektin çözeltisini geri çekin ve atın ve mikro kılcal damarların altı saat boyunca oda sıcaklığında kurumasına izin verin.

Daha sonra, fiber nin kaplı mikro kılcal damarları veya perfüzyon odalarını polikarbonat boruya ve boruyu kapit bağlantı parçaları kullanarak şırınga pompasına bağlayın. Burada gösterilen kurulum, altı perfüzyon odasını destekleyen bir yardım portu şırınga pompası kullanır. Bant kullanarak, her perfüzyon odasının gövdesini bir ısı bloğuna sabitleyin ve ısı bloklarının sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Daha sonra, perfüzyon odalarının açık uçlarını, mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda eşit olarak dağılmış, taze büyümede asılı hücreler içeren bir rezervuara daldırın. Şırınga pompasına her perfüzyon odasına 10 mikrolitre hücre süspansiyonu çekmesi talimatını verin. Daha sonra perfüzyon odalarının açık uçlarını hücre süspansiyonundan çıkarın ve şırınga pompasına, sıvı tapalarını ısı bloğuna sabitlenmiş bölümlere hareket ettirmek için yeterli havayı çekmesi talimatını verin.

Hücrelerin, perfüzyon odalarının fibronektin kaplı iç yüzeylerine 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe ederek yapışmasına izin verin. Bu arada, perfüzyon odalarının açık uçlarını taze büyüme ortamı içeren yeni bir rezervuara aktarın. Yapışma süresinden sonra, şırınga pompasına sıvı tapalarını boşa göndermesi talimatını verin ve ardından her bir bolluk odasına 10 mikrolitre taze ortam çekin, ardından taze ortamı yapışan hücrelerin üzerine yerleştirmek için yeterli hava verin.

Hücreleri 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin, kültürler yeterince dengelenene ve genişleyene kadar ortamı her iki saatte bir değiştirin. Desen. 46 indiyum kalay oksit elektrotlu DMF modülünün alt plakası. Standart fotolitografik teknikler kullanılarak, DMF modülünün alt plakasını kimyasal buhar biriktirme yoluyla beş mikron Lene C ile kaplayın ve ardından 50 nanometre Teflon af ile döndürün.

Üst plaka olarak kullanılacak 50 nanometre Teflon AF içeren bir sonraki spin coat ve desensiz indiyum kalay oksit cam alt tabaka. Plakaları, plakalar arasında 400 mikronluk bir boşluk bırakan girintilere sahip bir polimer döküme sabitlemek için metal sıkıştırma çerçeveleri kullanın. Bu aralık, 2,5 milimetre karelik çalıştırma elektrot boyutu ile birleştiğinde, damlacık hacmini elektrot başına 2,5 mikrolitre olarak tanımlar.

Daha sonra Teflon kaplı transfer mikro kılcal damarlarını DMF plakaları arasındaki boşluğa yerleştirin. Her birini, her bir transferin karşı ucuna kadar aynı kökenli çalıştırma elektrodunun kenarına kadar uzanacak şekilde konumlandırmak. Mikro kılcal bir kapit bağlantı parçası takın.

Ardından, İndiyum 10 oksit elektrotlarına voltaj sağlamak için elektrik konektörlerini devreye sokun. Elektrot aktivasyon dizileri, önceden belirlenmiş komut dosyalarını çalıştıran bilgisayar kontrollü bir elektronik arayüz kullanılarak otomatikleştirilir. Ardından, yerleşik rezervuarlardaki DMF modüllerini hücre stimülasyonu, yıkama ve lizis için uygun reaktiflerle doldurun.

Bazı durumlarda, uyarıcının kendisini kullanımdan hemen önce daha sonraki bir adımda yüklemek en iyisidir Yüklü yerleşik rezervuarlardan çizim yaparak, mikro damlacıkları DMF modülüne dağıtın. DMF modülü ile transfer mikro kılcal damarlar arasındaki taşınmaları da dahil olmak üzere mikro damlacıkların test edilmesi, çalıştırılması. Blais. İlk olarak, uyarıcıyı mililitre başına 100 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda% 0.1 onik F1 27 ile taze ortamda hazırlayın.

Ardından, 80 ila 100 mikrolitre uyarıcıyı belirlenmiş yerleşik rezervuarına yükleyin. Daha sonra, perfüzyon odalarının açık uçlarını orta rezervuardan çıkarın ve bunları transfer Mikro kılcal damarlarının uçlarına yapıştırılmış kapit bağlantı parçalarına yerleştirin ve ardından şırınga pompasına perfüzyon odaları içindeki sıvı tapalarını atık kabına göndermesi talimatını verin. Ardından, DMF modülüne 10 mikrolitrelik uyarı damlacıkları üretmesi ve bunları transfer mikro kılcal damarlar yoluyla perfüzyon odalarına iletmesi talimatını verin.

Gerekirse hücreleri uyaranla 37 santigrat derecede bir ila dört saat boyunca inkübe edin. Stimülasyon periyodunu takiben düzenli aralıklarla yeni uyaran değişimi. Şırınga pompasına uyaranı atık kabına göndermesi talimatını verin ve DMF modülüne her perfüzyon odasına 10 mikrolitrelik bir damla yıkama tamponu vermesi talimatını verin.

Hücreleri yıkama tamponu ile beş dakika inkübe edin. Daha sonra yıkama tamponunu 10 mikrolitre lizis çözeltisi ile değiştirin ve beş dakika daha inkübe edin. Ardından, şırınga pompasına her hücre lizatını DMF modülüne göndermesi talimatını verin.

Damlacıklar arasında çapraz kontaminasyona neden olabileceğinden, plakayı yana eğmemeye dikkat ederek DMF modülünün üst plakasını çıkarın. Son olarak, platformu bir sonraki deneye hazırlamak için gen ekspresyonu, kantitatif R-T-P-C-R yoluyla profil oluşturma gibi platform dışı analizler için bir pipet adamı kullanarak açık DMF modülünden lizatları toplayın. İlk olarak, transfer mikro kılcal damarlarını, CAPITE bağlantı parçalarını ve DMF modül plakalarını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %10'luk ağartıcıya daldırın, DMF modül plakaları izopropanol ile durulanır, ardından deiyonize su ile durulanır ve nitrojen gazı kullanılarak kurutulur ve ardından 160 santigrat derecede 10 dakika pişirin.

Bu protokolde tarif edilen tohumlama yöntemleri, perfüzyon odası başına yaklaşık 500 miren makrofajın yapışması ile sonuçlanmıştır. Hücrelerin 16 saat boyunca 37 santigrat derecede büyüme ortamı ile inkübe edilmesinden sonra, popülasyon büyüklüğü perfüzyon odası başına yaklaşık 1000 hücreye iki katına çıktı. Burada, bakterilere karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinde önemli rol oynadığı bilinen dört genin kantitatif R-T-P-C-R analizinden elde edilen sonuçlar gösterilmektedir.

Makrofajlar, konvansiyonel veya mikro ölçekli kültürlerde büyütüldü ve bir veya dört saat boyunca e coli biyo partikülleri ile uyarıldı. Mavi çubuklar, geleneksel olarak kültürlenmiş hücrelerin uyarılması üzerine gen ekspresyonundaki ortalama kat artışını gösterirken, kırmızı çubuklar, büyüyen ve uyarılan hücrelerde indüklenmiş ekspresyonu gösterir. Mikro ölçekli kültürlerde, hata çubukları, üç bağımsız deneyden elde edilen biyolojik kopyalar arasındaki standart sapmaları gösterir.

Konvansiyonel kültürler kuyu başına yaklaşık 50.000 hücre içeren 96 kuyucuk plakası kullanmasına rağmen, gen ekspresyonu profilleme sonuçları çok benzerdi, oysa mikro ölçekli kültürler perfüzyon odası deneyi başına yaklaşık 1000 hücreli mikro kılcal damarlar kullandı değişkenlik en azından karşılaştırılabilir ve genellikle mikro ölçekte çalışan daha kısa hata çubukları ile belirtildiği gibi mikro ölçekli kültürlerde azaltılmıştır. Hücre tüketimini beş kat azalttı ve reaktif tüketimini üç ila 50 kat azalttı. Geleneksel deneylere göre.

Yöntem, bazı durumlarda farklı bir hücre dışı matris bileşeni veya büyümesi kullanarak, hemen hemen her yapışma hücre tipini kültürlemek için kullanılabilir. Orta düzeyde uyumsuz hücre tipleri zor olabilir, ancak hücre bağlama stratejilerinin benzer bağlamlarda başarılı olduğu gösterilmiştir. Burada açıklanan yaklaşım, 24 saate kadar mikro ölçekli kültürü destekler.

Platform, uzun vadeli bir kültür yapmak için tüm işlevleri de içerir, ancak bir hücre geçirme protokolünün geliştirilmesi gerekir. Ek modüller, mikro kılcal ara bağlantılar yoluyla dijital mikroakışkan küpe entegre edilebilir. Bu şekilde DMF, karmaşık iş akışlarını gerçekleştirmek için çevresel modülleri bağlamak için merkezi bir merkez görevi görür.

Öncelikle enfeksiyöz ajanlara karşı konak transkripsiyonel yanıtlarını karakterize etmeye odaklandık, ancak platform son derece çok yönlü olacak şekilde tasarlanmıştır ve bu nedenle çok çeşitli araştırma uygulamalarını desteklemelidir.