Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

Bu prosedürün amacı, 3D olarak kültürlenen hücreleri interstisyel sıvı akışına maruz bırakmak ve hücre istilası üzerindeki akış aracılı etkileri ölçmektir. Bu, önce tip bir kollajen ve matrijelden oluşan bir jel çözeltisi hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, jel çözeltisine belirli bir hücre konsantrasyonu eklemektir.

Daha sonra, hücre süspansiyonu 12 milimetre çapında, sekiz mikron gözenek boyutunda bir transwell eklenir ve matris jelleşene kadar 37 santigrat derecede inkübe edilir. Tahlil kurulumundaki son adım, statik ve akış koşulları oluşturmak için transwell'lara belirli miktarlarda ortam eklemektir. 24 saat sonra, transwell zarları sabitlenir, boyanır ve istila edilen hücre sayısının ölçülmesi için görselleştirilir.

Bu tekniğin mikroakışkan, interstisyel akış odaları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, pompa veya özel ekipman gerektirmemesi ve araştırmacıların birden fazla koşulu veya tedaviyi kolay ve hızlı bir şekilde test etmesine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem hücresel göç ve istila hakkında bilgi sağlayabilse de, interstisyel sıvı akışının protein ekspresyonu, hücre çoğalması ve hücre sinyallemesindeki değişiklikler gibi diğer ilgili hücresel davranışlar üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir veya uygulanabilir. Bu prosedürü göstermek bir LIMA iki chaa olacaktır.

Laboratuvarımdaki bir yüksek lisans öğrencisi: Bu işleme dört santigrat derecede buzun üzerine küçük bir matri jeli alikotu atarak başlayın. Ardından, PBS steril su, sodyum hidroksit, matrigel ve sıçan kuyruğu tip bir kollajen ile jel tarifini hazırlayın. Daha sonra jelin bileşenlerini buz üzerinde aynı sırayla karıştırın ve son çözeltiyi dört santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Şimdi bir çift sterilize forseps kullanarak 12 milimetre çapında sekiz mikro po hücre kültürü ekini 12 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Daha sonra hücreleri sayın ve serum serbest ortamda beş kez 10 ila mililitre başına altı hücreye yeniden süspanse edin, 900 mikrolitre jel çözeltisine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Bundan sonra, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.

Daha sonra, her bir parçaya 150 mikrolitre son karışım ekleyin. Ardından, ekleri jel polimerize olana kadar 30 dakika boyunca 37 santigrat derece %5'lik bir karbondioksit inkübatöre aktarın. Statik durum için, jelin üzerine 100 mikrolitre serum içermeyen ortam ve ekin altına 1.200 mikrolitre mikrolitre ekleyin.

Kuyucuktaki ek parçanın içindeki ve dışındaki sıvı seviyeleri yaklaşık olarak eşit olmalıdır, bu da jel boyunca minimum bir basınç farkı ile sonuçlanır ve interstisyel akış olmaz. Akış koşulu için, ek parçanın altına 100 mikrolitre serum içermeyen ortam ve jelin üzerine 650 mikrolitre ekleyin. Aynı zamanda, bu konumlarda hücrelerin zardan geçmesini önleyeceğinden, ekin altında herhangi bir hava kabarcığı oluşturmaktan kaçının.

Ardından plakayı 24 saat boyunca 37 derece Santigrat derece% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Bu adımda, ekleri yıkamak için 24 oyuklu yeni bir plakaya oyuk başına 500 mikrolitre bir kez PBS ekleyin. Ardından, akış eğilimleri kuyularının üst kısmında kalan ortamı çıkarın.

Ardından, jeli eklerden çıkarmak için pamuklu çubuklar kullanın. VA olmayan hücreleri çıkarmak için zar yüzeyinin üst kısmını silin. Daha sonra ekleri 15 saniye boyunca bir kez PBS içeren 24 oyuklu plakaya yerleştirerek yıkayın.

Bundan sonra, PBS'yi çıkarın ve her bir parçanın altına 500 mikrolitre %4 para formaldehit ekleyin. Trans göç etmiş hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra PFA'yı çıkarın ve kalan fiksatifi çıkarmak için 500 mikrolitre bir kez PBS ile bir kez durulayın.

Daha sonra, eklerin altına 500 mikrolitre %0,5 Triton X 100 çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücrelere nüfuz etmek için, bir tıraş bıçağı kullanarak zarları ekten kesin. Daha sonra bunları bir kez PBS çözeltisinde mililitre DPI başına 100 mikrolitre iki mikrogram içine yerleştirin.

Zarın alt tarafını aşağı bakacak şekilde yerleştirmeye dikkat edin. DPI çözeltisi kullanımdan birkaç dakika önce hazırlanmalı ve karanlıkta tutulmalıdır. Şimdi plakayı alüminyum folyoya sarın.

30 dakikalık oda sıcaklığında 150 RPM'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra membranları 500 mikrolitrede bir kez PBS'de yıkayın ve 10 dakika boyunca çalkalayıcıya geri koyun. Serbest jy'yi çıkarmak için yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Bir sonraki adım, zarları, trans göçü olan hücreler yukarı bakacak şekilde cam slaytlar üzerine yerleştirmektir. Membranlara montaj solüsyonu ekleyin. Sonra üzerlerini kapak fişleri ile örtün.

Daha sonra, lekeli lekeyi çekirdeklere kadar sayın ve beraberindeki el yazmasına göre istila edilen hücrelerin sayısını hesaplayın. Bu şekil, zar üzerindeki trans göç etmiş MDA MB 4 35 s hücrelerini göstermektedir. İstila edilen hücreler, interstisyel sıvı akışı invazyon testinden sonra sabitlendi ve invaze hücrelerin sayımını kolaylaştırmak için DPI ve Alexa Fluor 4 88 konjuge foid ile boyandı.

Bu, parlak alanın altındaki zar ve işte zarif leke çekirdekleri. F aktin ile boyanmış Alexa Fluor 4 88 foid burada gösterilmektedir. Bu grafik, MDA MB 4 35 s metastatik melanom hücrelerinin invazyonunun interstisyel akış ile önemli ölçüde arttığını göstermektedir.

24 saat sonra, sonuçlar statik invazyon durumunun ortalamasına normalize edilir ve altı hücre kültürü ekinden elde edilen ortalama sunulur. Koşullar arasındaki fark, 0.003'lük bir P değeri ile istatistiksel olarak anlamlıdır. Bir kez ustalaştıktan sonra, interstisyel sıvı akış testi iki saat içinde ayarlanabilir, ardından 24 saatlik bir inkübasyon ve ardından dönüşüm membranlarının sabitlenmesi ve boyanması için iki saat içinde ayarlanabilir.

Bu prosedürü takiben, hücreler, proteinler veya nükleik asitler, interstisyel sıvı akışına yanıt olarak gen ve protein ekspresyonunun nasıl değiştiği gibi ek soruları yanıtlamak için kolayca ekstrakte edilebilir. Geliştirilmesinden bu yana, bu, interstisyel akışın kanser hücreleri üzerindeki etkilerini inceleyen araştırmacılar için önemli bir test haline geldi.