Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

Bu prosedürün amacı, 3B kültürde yetiştirilen hücreleri interstisiyel sıvı akışına maruz bırakmak ve akışla aracılık edilen hücre invazyonu etkilerini nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle tip 1 kolajen ve matrigel içeren bir jel solüsyonu hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, jel solüsyonuna belirlenen konsantrasyonda hücre eklemektir.

Ardından, hücre süspansiyonu 12 milimetre çapında ve sekiz mikron gözenek boyutuna sahip bir transwell'e eklenir ve matris jelleşene kadar 37 °C'de inkübe edilir. Deney düzeneğinin son adımı, statik ve akış koşulları oluşturmak için transwell'lere belirli miktarlarda medya eklemektir. 24 saat sonra, invaze olan hücre sayısının belirlenmesi için transwell membranları fikse edilir, boyanır ve görüntülenir.

Bu tekniğin, mikroakışkanlar veya interstisyel akış odacıkları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, pompa veya özel ekipman gerektirmemesi ve araştırmacıların birden fazla koşulu veya tedaviyi kolay ve hızlı bir şekilde test etmelerine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, hücresel göç ve invazyon hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, interstisyel sıvı akışının protein ekspresyonu, hücre proliferasyonu ve hücre sinyalizasyonundaki değişiklikler gibi diğer ilgili hücresel davranışlar üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir veya uygulanabilir. Bu prosedürün gösterimi bir LIMA iki chaa olacaktır.

Laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrencisi, küçük bir miktar matrigeli 4 °C'de buz üzerinde bekleterek bu prosedüre başlar. Ardından; PBS steril su, sodyum hidroksit, matrigel ve sıçan kuyruğu tip 1 kolajen ile jel formülünü hazırlar. Daha sonra jel bileşenlerini aynı sırayla buz üzerinde karıştırır ve nihai çözeltiyi 4 °C'de bir saat boyunca inkübe eder.

Şimdi, sterilize edilmiş bir pens yardımıyla 12 milimetre çapında sekiz mikro po hücre kültürü insertini 12 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. Ardından hücreleri sayın ve mililitrede beş x 10⁶ hücre olacak şekilde serumsuz medyada yeniden süspande edin, 100 µL hücre süspansiyonunu 900 µL jel çözeltisine ekleyin. Bundan sonra, pipetle nazikçe aşağı yukarı yaparak iyice karıştırın.

Ardından, her bir insert'e 150 µL nihai karışımdan ekleyin. Daha sonra, jel polimerleşene kadar insert'leri 30 dakika boyunca 37 °C, %5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin. Statik kondisyon için, jelin üzerine 100 µL serumsuz besiyeri ve insert'in altına 1.200 µL ekleyin.

Kuyucuktaki insertin içindeki ve dışındaki sıvı seviyeleri yaklaşık olarak eşit olmalı; böylece jel boyunca minimum basınç farkı oluşmalı ve interstisyel akış gerçekleşmemelidir. Akış koşulu için, insertin altına 100 µL serumsuz besiyeri ve jelin üzerine 650 µL ekleyin. Aynı zamanda, hücrelerin bu bölgelerde membran boyunca göç etmesini engelleyeceği için insertin altında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Ardından plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de %5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin. Bu adımda, insertleri yıkamak için yeni bir 24 kuyucuklu plağın her kuyucuğuna 500 µL 1x PBS ekleyin. Sonrasında, flow trends kuyucuklarının üst kısmında kalan medyumu uzaklaştırın.

Ardından, eklerin üzerindeki jeli temizlemek için pamuklu çubuklar kullanın. VA dışı hücreleri uzaklaştırmak için membranın yüzeyinin üst kısmını silin. Daha sonra, ekleri 1x PBS içeren 24 kuyucuklu plakaya 15 saniye boyunca yerleştirerek yıkayın.

Ardından, PBS'yi uzaklaştırın ve her bir insert'in altına 500 microliter %4 paraformaldehit ekleyin. Transmigre olmuş hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra PFA'yı uzaklaştırın ve kalıntı fiksatifleri temizlemek için 500 microliter PBS ile bir kez durulayın.

Ardından, insertlerin altına 500 µL %0,5 Triton X 100 çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri permeabilize etmek için, membranları bir jilet yardımıyla insertten kesin. Daha sonra membranları, 1x PBS çözeltisi içinde hazırlanmış 2 mg/mL DPI içeren 100 µL hacmindeki çözeltiye yerleştirin.

Membranın alt tarafının aşağıya bakmasına dikkat edin. DPI çözeltisi kullanımdan birkaç dakika önce hazırlanmalı ve karanlıkta tutulmalıdır. Şimdi plakayı alüminyum folyo ile sarın.

Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 150 RPM hızında bir çalkalayıcıya yerleştirin. Ardından membranları bir kez 500 µL PBS ile yıkayın ve 10 dakika boyunca tekrar çalkalayıcıya yerleştirin. Serbest jy'yi uzaklaştırmak için yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın.

Bir sonraki adım, membranların transmigre olmuş hücreler yukarı bakacak şekilde lamlar üzerine yerleştirilmesidir. Membranlara kapatma solüsyonu ekleyin. Ardından üzerlerini lamellerle kapatın.

Ardından, çekirdeklere göre DAPI boyamasını sayın ve ekteki makaleye göre istila eden hücre sayısını hesaplayın. Bu şekil, membran üzerindeki transmigre olmuş MDA MB 4 35 s hücrelerini göstermektedir. İstila eden hücreler, interstisyel sıvı akış istila testi sonrası fikse edilmiş ve istila eden hücrelerin sayımını kolaylaştırmak için DPI ve Alexa Fluor 4 88 konjuge phalloidin ile boyanmıştır.

Bu, parlak alan görüntüsü altındaki memrandır ve burada dappy boyamalı çekirdekler görülmektedir. Alexa Fluor 4 88 ile boyanmış foid ve F-aktin ile boyanmış yapılar burada gösterilmiştir. Bu grafik, MDA MB 4 35 s metastatik melanoma hücrelerinin invazyonunun interstisyel akış ile önemli ölçüde arttığını göstermektedir.

24 saat sonra, sonuçlar statik invazyon koşulunun ortalamasına göre normalize edilir ve altı hücre kültürü insertinden elde edilen ortalama değer sunulur. Koşullar arasındaki fark, 0,003 P değeri ile istatistiksel olarak anlamlıdır. Yöntem uzmanlaşıldıktan sonra, interstisyel sıvı akış testi iki saatte kurulabilir, bunu 24 saatlik bir inkübasyon ve ardından transwell membranlarının fiksasyonu ve boyanması için iki saatlik bir süreç takip eder.

Bu prosedürün ardından; gen ve protein ekspresyonunun interstisyel sıvı akışına yanıt olarak nasıl değiştiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla hücreler, proteinler veya nükleik asitler kolayca ekstre edilebilir. Geliştirildiğinden beri bu yöntem, interstisyel akışın kanser hücreleri üzerindeki etkilerini inceleyen araştırmacılar için temel bir analiz haline gelmiştir.