DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme
28 Eylül 2012
Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.
Bu gösteri, DNA hasar tepkisinde yer alan proteinlerin uzamsal zamansal ilişkilerini anlamak için iki ve 3D canlı hücre görüntüleme kullanır. İlk olarak, uygun floresan belirteçleri içeren ifade yapılarıyla seçtiğiniz hücre hattını transfekte edin veya transdüksiyon yapın. Burada, M Cherry ve GFP daha sonra floresan etiketli hücreleri normal koşullar altında gösteren bir dizi kontrol videosu elde ediyor.
Daha sonra uygun bir tedavi uygulayın ve floresan hücreler üzerindeki tedavi etkilerinin verilerini yakalayın, proteinlerin uzamsal zamansal ilişkileri için video verilerini işleyin ve analiz edin. Sonuç olarak, canlı hücre floresan mikroskobu, DNA'ya zarar veren ajanlara yanıt olarak 53 BP bir odak oluşumu veya mitoz sırasında 53 BP kişinin davranışı gibi hücresel dinamikleri detaylandırabilir. İlk olarak, çeşitli tedavilerin belirli hücre dizilerinde mitozu nasıl etkilediğini incelemek istediğimizde iki ve 3D yaşam tarzı görüntülemeye ilgi duymaya başladık.
Bu deneysel yaklaşım, DNA hasar tepkisini ve genomik stabilitenin korunmasını geleneksel yöntemlerden daha kolay incelememizi sağlar. Ek olarak, belirli proteinlerin çeşitli sinyal yollarında ve çeşitli hücre hatlarında nasıl etkileşime girdiğini incelemek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. Yaşam tarzı görüntülemenin sito kimyası gibi geleneksel tekniklere göre temel avantajı, DNA hasar yanıt proteinlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesine izin vermesidir.
Doğru kayıt koşullarını optimize etmek zor olabilir. Bu gösteri, başarıyı sağlamak için gereken birçok küçük adımı görmek için kullanılabilir. Fotoğraf ağarmasını en aza indirmek, doğru kayıt aralıklarını ve doğru kayıt süresini bulmak vb. söz konusu olduğunda kalıcılığın işe yaradığını unutmayın.
mCherry ve GFP füzyon protein ekspresyonu için plazmitlerle uygun hücre hatlarını transfekte edin veya transdüksiyon yapın. Kültürleri ilaç seçimi altında tutun ve görüntü alımından bir gün önce floresan proteinlerin ekspresyonunu periyodik olarak kontrol edin. Tripsin kullanarak hücreleri hasat edin.
Daha sonra düşük yoğunluklu kültürleri 3,5 santimetre floro çanak cam alt plakalara tohumlayın. Bu protokol, bir axio gözlemcisi Z bir stand ile donatılmış Zeiss hücre gözlemcisi SD eğirme diski konfokal mikroskobu kullanılarak geliştirilmiştir İlk olarak, CO2 gazının inkübasyon sisteminin CO2 modülüne çalıştığını doğrulayın. Mikroskop titreşim önleyici bir Airtable tarafından destekleniyorsa, Airtable için hava beslemesini açın.
Şimdi mikroskop standı, dönen disk ünitesi, kameralar, inkübasyon modülleri, HXP aydınlatıcı, motorlu sahne, argon lazer ve bilgisayarın gücünü açın. Kullanılacak lazer çizgileri için anahtarları açın. Axio görüntü işleme yazılımını başlatın.
Avision yazılımı, kontrol ettiği mikroskoba ve bileşenlerine özgü pencereler ve açılır menülerle özelleştirilebilir. Bu nedenle, her kullanıcı arayüzü, görüntülemeden yaklaşık bir saat önce potansiyel olarak benzersiz bir görünüme sahiptir. İnkübatör kontrollerini bulun ve üst hazne ve sahne plakası için ısıtmayı açın.
Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. CO2 kontrolünü açın ve seviyeyi %5'e ayarlayın Bu çalışmada görüntüleme için objektif lensi seçin. Objektif lens, suya benzer bir kırılma indisine sahip bir daldırma ortamının kullanılmasını gerektirir.
Uzun süreler boyunca birden fazla konumu görüntülemeniz gerekiyorsa, dürbünün kurumaması için yeterli daldırma ortamı uyguladığınızdan emin olun. Kültür çanağını sahneye yerleştirin ve mikroskop kontrollerini veya yazılımı kullanarak objektif lensi alt kısımla temas ettirin. Yayılan ışığı göz merceklerine yönlendirin ve ilgilenilen floresan sinyali için uygun geniş alan filtre setini seçin.
Şimdi oküler lenslerden görüntüleyin. Görüntüyü odaklayın ve yazılımı veya mikroskop kontrollerini kullanarak uygun bir hücre alanını bulun. Yazılımda bulunan konfokal eğirme diski ünitesi ile yayılan ışığı göz merceklerinden uzağa bağlantı noktasına yönlendirin.
Bu çalışma için uygun lazeri açın. Her kanal için, kuo optik ayarlanabilir filtre kontrolünü uygun bir seviyeye ayarlayarak lazerin yoğunluğunu ayarlayın. Ardından, uygun dikroik aynayı ve emisyon filtrelerini seçin.
Dönen disk ünitesinin deklanşörünü açın. Şimdi mevcut görüş alanını görüntülemek için canlı pencereyi seçin. Şimdi kamera kontrol penceresini açın.
Kullanılacak kamerayı seçin ve pozlama süresini yaklaşık 100 milisaniye olarak ayarlayın. Yüzdeyi ve EM kazancını gerektiği gibi ayarlayın. Ayrıca, konfokal eğirme diski ünitesinin kontrolünü açın ve uygun bir görüntü yakalamak için ayarlanan kamera pozlama süresini girerek dönen disk hızını ayarlayın.
Değişikliği kilitlemek için ayarla'yı tıklayın. Şimdi çok boyutlu alım penceresini açın. Kanal sekmesini seçin ve Flora Fours için tanımlanan uygun kanalları yükleyin veya seçin.
Görüntü kaydını sağlamak için, her iki kanal için ortak bir dikroik ayna kullanın. Yazılımı otomatik odaklamaya ayarlayın. MDA penceresine ilerleyin ve ZS yığını sekmesine tıklayın.
Geçerli odak konumunda ZS yığınını seçin. 10 mikronluk bir Zack için aralığı ayarlayın ve Z üzerinden nyquist örneklemesini sağlamak için adım sayısı için en uygun olanı seçin.Şimdi başlat'a tıklayın ve elde edilen Z yığını görüntüsünü analiz edin. Zaman sekmesini seçin.
Görüntüleme zaman noktaları ile oturumun genel süresi arasındaki aralığı ayarlayın. Çanaktaki birkaç hücrenin çok noktalı görüntülenmesi için MDA penceresini açın. Pozisyon sekmesini seçin ve uygulama ayarının pozisyon başına zaman noktasından önce veya sonra işaretli olduğunu doğrulayın.
Şimdi işareti seçin. Canlı görüntüyü kullanarak bulun, çanağı hareket ettirin ve uygun görüş alanlarını seçin. Deneyi başlatmak ve bir kontrol videosu kaydetmek için çok boyutlu alım menüsünde başlat'a tıklayın.
Uygun tedaviyi eklemeye devam edin ve deneysel videoyu belirli bir süre boyunca belirlenen zaman aralıklarında kaydedin. Bu hücre hattı için ve tüm mitoz sürecini izlemek için yedi buçuk dakikalık bir aralık kullandık ve dört ila beş saat sürdü. Hücre hattınız ve çalışmak istediğiniz şey için belirli ayarları belirlemeniz gerekecektir.
Velocity yazılımını açın, yeni bir kitaplık oluşturun ve adlandırın ve dosyaları görüntülemek için deneysel video dosyalarını içe aktarın. Genişletilmiş odak ayarını kullanmayı deneyin, videoları gerektiği gibi ayarlayın. Velocity, elde ettiğiniz görüntülerin kalitesini artırmaya yardımcı olacak bir dizi araçla donatılmıştır.
Mikroskop üzerindeki ayarlar uygunsa, daha sonra düzenlemede çok zaman kazandıracaktır. Genellikle, görüntülerinizi aktarmak ve parlaklığı ve kontrastı ayarlamak, özel ihtiyaçlarınızın deneyinize bağlı olarak değişeceği yararlı olur: Hücreleri 3B olarak görüntülemek için. 3D opaklık ayarına geçin.
Bu, 3B işlenmiş hücrelerin uzayda dönmesine izin verir, böylece hücreler içinde ilgilenilen yapıların çoklu perspektiflerini sağlar. Film. Durağan görüntüler, kontrollerle karşılaştırıldığında kullanıcı tercihine bağlı olarak çeşitli dosya türlerine dışa aktarılabilir. CPT'ye maruz kalan fibroblast hücreleri beş ila 10 dakika içinde odaklar oluşturdu ve bu odakları kayıt süresi boyunca korudu.
İlginç bir şekilde, insan embriyonik böbrek hücrelerinde, 53 BP, mitozun başlangıcında kromatinden ayrışır ve yoğunlaşan kromozomların etrafında ince bir pus oluşturur. Teleph meydana geldiğinde ve mitoz sona erdiğinde, 53 BP bir, bir kez daha farklı odaklar halinde toplanır. Bu videonun, DNA hasar tepkisinde yer alan proteinlerin uzay-zamansal ilişkilerini ve diğer yolakları incelemenizi sağlayacağını umuyoruz.
Örneğin, kromatin dinamiği alanında, bu teknik, 53 BP bir bağlanmanın DNA'nın telomerik uçlarının hareketini nasıl etkilediğini incelemek için kullanıldı. Genetiği değiştirilmiş hücrelerin oluşturulmasından sonra yaklaşık dört ila sekiz saat içinde iki ve 3 boyutlu canlı hücre görüntülemesi yapılabilmektedir. Optimum görüntüleme için mikroskop ayarlarının uygun şekilde ayarlandığından emin olun.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, DNA hasarına yanıt olarak aktive olan bir DNA çift sarmal kırığı sinyal proteinini ve mitoz sırasındaki lokalizasyonunu görselleştirmek için bir yöntem tanımlar. Gösterim, DNA hasarı yanıtında yer alan proteinlerin uzamsal zamansal ilişkilerini keşfetmek için iki ve 3D canlı hücre görüntülemesini kullanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- DNA Hasarı Yanıtı
- Canlı Hücre Görüntüleme
Arka Plan
- DNA hasarı yanıtını anlamak, hücre döngüsü düzenlemesi için kritiktir.
- Floresan markörler, canlı hücrelerde protein dinamiklerini görselleştirmeye yardımcı olur.
- İki ve 3D görüntüleme teknikleri, uzamsal ve zamansal analizi artırır.
- 53 BP1, DNA hasarı yanıtında yer alan önemli bir proteindir.
Çalışmanın Amacı
- DNA hasarı sinyal proteinlerinin aktivasyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek.
- DNA hasar verici ajanların hücresel dinamikler üzerindeki etkilerini analiz etmek.
- Mitoz sırasında proteinlerin davranışını incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre hatlarına floresan markörlü konstrüktlar ile transfekte veya transdük et.
- Normal koşullar altında floresan olarak etiketlenmiş hücrelerin kontrol videolarını al.
- Tedavileri uygula ve tedavi etkileri üzerindeki verileri kaydet.
- Proteinlerin uzamsal zamansal ilişkileri için video verilerini analiz et.
Ana Sonuçlar
- Canlı hücre floresan mikroskobu, 53 BP1 fokus oluşumunun dinamiklerini ortaya koyar.
- Mitoz sırasındaki protein davranışı, DNA hasar verici ajanlar tarafından etkilenir.
- İki ve 3D görüntüleme, tedavilere karşı hücresel yanıtlar hakkında içgörüler sağlar.
- Proteinlerin uzamsal zamansal ilişkileri etkili bir şekilde analiz edilebilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, DNA hasarı yanıtı proteinlerinin detaylı gözlemlenmesini sağlar.
- Canlı hücre görüntüleme, hücresel dinamikleri incelemek için güçlü bir araçtır.
- Bu süreçleri anlamak, DNA hasarına karşı terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Live cell 2D and 3D imaging of DNA damage response proteins such as 53BP1 enables direct visualization of spatiotemporal protein dynamics following genotoxic stress. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for targets and pathways involved in genomic stability. Integrating these imaging approaches informs target validation and portfolio triage decisions in oncology and genome maintenance programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment.
- Supports functional validation of DDR targets by visualizing protein localization and kinetics.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pathway engagement and cellular context.
- Provides predictive confidence for advancing DDR modulators or synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell systems for quantitative assessment of DDR protein dynamics.
- Enables reproducible measurement of foci formation and chromatin changes post-treatment.
- Supports assay standardization for compound screening targeting DNA repair pathways.
- Allows for scalable adaptation to multiple cell lines and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of genomic instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DDR-targeting agents.
- Enables risk-adjusted advancement by linking mechanistic readouts to translational endpoints.
- Supports biomarker development for DDR pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and downstream assay development for DDR-focused programs.
- Discovery Biology: Visualizes protein recruitment and chromatin remodeling in response to DNA damage, clarifying pathway function.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts of DDR protein foci for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of spatiotemporal protein dynamics and comparison across treatments or cell lines.
- Translational Research: Connects mechanistic imaging outputs to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DDR proteins and pathways across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of DDR-targeting assets and translational biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescent protein engineering, and image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and environmental control systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various cell lines and DDR proteins with appropriate construct design.
- Imaging conditions must be optimized to minimize photobleaching and ensure data quality.
