DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Bu gösteri, DNA hasar tepkisinde yer alan proteinlerin uzamsal zamansal ilişkilerini anlamak için iki ve 3D canlı hücre görüntüleme kullanır. İlk olarak, uygun floresan belirteçleri içeren ifade yapılarıyla seçtiğiniz hücre hattını transfekte edin veya transdüksiyon yapın. Burada, M Cherry ve GFP daha sonra floresan etiketli hücreleri normal koşullar altında gösteren bir dizi kontrol videosu elde ediyor.

Daha sonra uygun bir tedavi uygulayın ve floresan hücreler üzerindeki tedavi etkilerinin verilerini yakalayın, proteinlerin uzamsal zamansal ilişkileri için video verilerini işleyin ve analiz edin. Sonuç olarak, canlı hücre floresan mikroskobu, DNA'ya zarar veren ajanlara yanıt olarak 53 BP bir odak oluşumu veya mitoz sırasında 53 BP kişinin davranışı gibi hücresel dinamikleri detaylandırabilir. İlk olarak, çeşitli tedavilerin belirli hücre dizilerinde mitozu nasıl etkilediğini incelemek istediğimizde iki ve 3D yaşam tarzı görüntülemeye ilgi duymaya başladık.

Bu deneysel yaklaşım, DNA hasar tepkisini ve genomik stabilitenin korunmasını geleneksel yöntemlerden daha kolay incelememizi sağlar. Ek olarak, belirli proteinlerin çeşitli sinyal yollarında ve çeşitli hücre hatlarında nasıl etkileşime girdiğini incelemek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. Yaşam tarzı görüntülemenin sito kimyası gibi geleneksel tekniklere göre temel avantajı, DNA hasar yanıt proteinlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesine izin vermesidir.

Doğru kayıt koşullarını optimize etmek zor olabilir. Bu gösteri, başarıyı sağlamak için gereken birçok küçük adımı görmek için kullanılabilir. Fotoğraf ağarmasını en aza indirmek, doğru kayıt aralıklarını ve doğru kayıt süresini bulmak vb. söz konusu olduğunda kalıcılığın işe yaradığını unutmayın.

mCherry ve GFP füzyon protein ekspresyonu için plazmitlerle uygun hücre hatlarını transfekte edin veya transdüksiyon yapın. Kültürleri ilaç seçimi altında tutun ve görüntü alımından bir gün önce floresan proteinlerin ekspresyonunu periyodik olarak kontrol edin. Tripsin kullanarak hücreleri hasat edin.

Daha sonra düşük yoğunluklu kültürleri 3,5 santimetre floro çanak cam alt plakalara tohumlayın. Bu protokol, bir axio gözlemcisi Z bir stand ile donatılmış Zeiss hücre gözlemcisi SD eğirme diski konfokal mikroskobu kullanılarak geliştirilmiştir İlk olarak, CO2 gazının inkübasyon sisteminin CO2 modülüne çalıştığını doğrulayın. Mikroskop titreşim önleyici bir Airtable tarafından destekleniyorsa, Airtable için hava beslemesini açın.

Şimdi mikroskop standı, dönen disk ünitesi, kameralar, inkübasyon modülleri, HXP aydınlatıcı, motorlu sahne, argon lazer ve bilgisayarın gücünü açın. Kullanılacak lazer çizgileri için anahtarları açın. Axio görüntü işleme yazılımını başlatın.

Avision yazılımı, kontrol ettiği mikroskoba ve bileşenlerine özgü pencereler ve açılır menülerle özelleştirilebilir. Bu nedenle, her kullanıcı arayüzü, görüntülemeden yaklaşık bir saat önce potansiyel olarak benzersiz bir görünüme sahiptir. İnkübatör kontrollerini bulun ve üst hazne ve sahne plakası için ısıtmayı açın.

Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. CO2 kontrolünü açın ve seviyeyi %5'e ayarlayın Bu çalışmada görüntüleme için objektif lensi seçin. Objektif lens, suya benzer bir kırılma indisine sahip bir daldırma ortamının kullanılmasını gerektirir.

Uzun süreler boyunca birden fazla konumu görüntülemeniz gerekiyorsa, dürbünün kurumaması için yeterli daldırma ortamı uyguladığınızdan emin olun. Kültür çanağını sahneye yerleştirin ve mikroskop kontrollerini veya yazılımı kullanarak objektif lensi alt kısımla temas ettirin. Yayılan ışığı göz merceklerine yönlendirin ve ilgilenilen floresan sinyali için uygun geniş alan filtre setini seçin.

Şimdi oküler lenslerden görüntüleyin. Görüntüyü odaklayın ve yazılımı veya mikroskop kontrollerini kullanarak uygun bir hücre alanını bulun. Yazılımda bulunan konfokal eğirme diski ünitesi ile yayılan ışığı göz merceklerinden uzağa bağlantı noktasına yönlendirin.

Bu çalışma için uygun lazeri açın. Her kanal için, kuo optik ayarlanabilir filtre kontrolünü uygun bir seviyeye ayarlayarak lazerin yoğunluğunu ayarlayın. Ardından, uygun dikroik aynayı ve emisyon filtrelerini seçin.

Dönen disk ünitesinin deklanşörünü açın. Şimdi mevcut görüş alanını görüntülemek için canlı pencereyi seçin. Şimdi kamera kontrol penceresini açın.

Kullanılacak kamerayı seçin ve pozlama süresini yaklaşık 100 milisaniye olarak ayarlayın. Yüzdeyi ve EM kazancını gerektiği gibi ayarlayın. Ayrıca, konfokal eğirme diski ünitesinin kontrolünü açın ve uygun bir görüntü yakalamak için ayarlanan kamera pozlama süresini girerek dönen disk hızını ayarlayın.

Değişikliği kilitlemek için ayarla'yı tıklayın. Şimdi çok boyutlu alım penceresini açın. Kanal sekmesini seçin ve Flora Fours için tanımlanan uygun kanalları yükleyin veya seçin.

Görüntü kaydını sağlamak için, her iki kanal için ortak bir dikroik ayna kullanın. Yazılımı otomatik odaklamaya ayarlayın. MDA penceresine ilerleyin ve ZS yığını sekmesine tıklayın.

Geçerli odak konumunda ZS yığınını seçin. 10 mikronluk bir Zack için aralığı ayarlayın ve Z üzerinden nyquist örneklemesini sağlamak için adım sayısı için en uygun olanı seçin.Şimdi başlat'a tıklayın ve elde edilen Z yığını görüntüsünü analiz edin. Zaman sekmesini seçin.

Görüntüleme zaman noktaları ile oturumun genel süresi arasındaki aralığı ayarlayın. Çanaktaki birkaç hücrenin çok noktalı görüntülenmesi için MDA penceresini açın. Pozisyon sekmesini seçin ve uygulama ayarının pozisyon başına zaman noktasından önce veya sonra işaretli olduğunu doğrulayın.

Şimdi işareti seçin. Canlı görüntüyü kullanarak bulun, çanağı hareket ettirin ve uygun görüş alanlarını seçin. Deneyi başlatmak ve bir kontrol videosu kaydetmek için çok boyutlu alım menüsünde başlat'a tıklayın.

Uygun tedaviyi eklemeye devam edin ve deneysel videoyu belirli bir süre boyunca belirlenen zaman aralıklarında kaydedin. Bu hücre hattı için ve tüm mitoz sürecini izlemek için yedi buçuk dakikalık bir aralık kullandık ve dört ila beş saat sürdü. Hücre hattınız ve çalışmak istediğiniz şey için belirli ayarları belirlemeniz gerekecektir.

Velocity yazılımını açın, yeni bir kitaplık oluşturun ve adlandırın ve dosyaları görüntülemek için deneysel video dosyalarını içe aktarın. Genişletilmiş odak ayarını kullanmayı deneyin, videoları gerektiği gibi ayarlayın. Velocity, elde ettiğiniz görüntülerin kalitesini artırmaya yardımcı olacak bir dizi araçla donatılmıştır.

Mikroskop üzerindeki ayarlar uygunsa, daha sonra düzenlemede çok zaman kazandıracaktır. Genellikle, görüntülerinizi aktarmak ve parlaklığı ve kontrastı ayarlamak, özel ihtiyaçlarınızın deneyinize bağlı olarak değişeceği yararlı olur: Hücreleri 3B olarak görüntülemek için. 3D opaklık ayarına geçin.

Bu, 3B işlenmiş hücrelerin uzayda dönmesine izin verir, böylece hücreler içinde ilgilenilen yapıların çoklu perspektiflerini sağlar. Film. Durağan görüntüler, kontrollerle karşılaştırıldığında kullanıcı tercihine bağlı olarak çeşitli dosya türlerine dışa aktarılabilir. CPT'ye maruz kalan fibroblast hücreleri beş ila 10 dakika içinde odaklar oluşturdu ve bu odakları kayıt süresi boyunca korudu.

İlginç bir şekilde, insan embriyonik böbrek hücrelerinde, 53 BP, mitozun başlangıcında kromatinden ayrışır ve yoğunlaşan kromozomların etrafında ince bir pus oluşturur. Teleph meydana geldiğinde ve mitoz sona erdiğinde, 53 BP bir, bir kez daha farklı odaklar halinde toplanır. Bu videonun, DNA hasar tepkisinde yer alan proteinlerin uzay-zamansal ilişkilerini ve diğer yolakları incelemenizi sağlayacağını umuyoruz.

Örneğin, kromatin dinamiği alanında, bu teknik, 53 BP bir bağlanmanın DNA'nın telomerik uçlarının hareketini nasıl etkilediğini incelemek için kullanıldı. Genetiği değiştirilmiş hücrelerin oluşturulmasından sonra yaklaşık dört ila sekiz saat içinde iki ve 3 boyutlu canlı hücre görüntülemesi yapılabilmektedir. Optimum görüntüleme için mikroskop ayarlarının uygun şekilde ayarlandığından emin olun.