Name: DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin, DNA hasarı yanıt proteinlerinin iki ve üç boyutlu canlı hücre görüntüleme ile uzamsal-zamansal ilişkilerini incelemeyi. Bu yöntem, 53BP1 fokus oluşumunu ve mitoz sırasındaki davranışını gerçek zamanlı gözlemlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01NS064593 ve R21ES016636 (KV) tarafından kısmen desteklenir. Mikroskopi VCU yapıldı - Nörobiyoloji &amp; Anatomi Mikroskopi Tesis Bölümü, NIH-NINDS Merkezi çekirdek hibe 5P30NS047463 fon ile, kısmen desteklenmektedir. Dönen diske konfokal mikroskop bir NIH-NCRR ödülü (1S10RR027957) ile satın alınmıştır.

A. Hücre Hazırlanması <ol><li> Normal insan primer fibroblast (GM02270) Coriell Hücre Deposu, Camden, New Jersey, elde ve hTERT 6 ile ölümsüzleştirdi edilmiştir. Hücreler CellStar yetiştirilen ve genişletilmiştir% 20 fetal bovin serumu (Gibco), non-essential/essential amino asitler, vitaminler, sodyum piruvat, ve penisilin / streptomisin (HyClone ile desteklenmiş MEM oluşan ortam içinde, 6 cm tabaklar (4 ml) ). </li><li> İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri, American Type Culture Collection&#39;dan temin edilebilir ve CellStar 6 cm tabaklar içinde yetiştirilen ve genişletilmiştir. Hücreler,% 10 fetal bovin serumu, zaruri olmayan amino asitler, L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM, ve penisilin / streptomisin içeren ortam (4 mi) içinde tutuldu. </li><li> 53BP1-mCherry (N-myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plazmid 19836) ve H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plazmid 17735) füzyon geni de puromisin veya G418 direnç genleri ifade yapıları, sırasıyla, (fibrobla transdüklü edildiSTS) ya da transfekte (HEK293) hücrelerin içine SuperFect (Qiagene) kullanarak ve ilaç seçimi altında yapılmaktadır. Floresans Bakım periyodik olarak kontrol edildi. </li><li> 24-48 saat görüntü elde etme önce, hücreleri tek bir hücre süspansiyonu içine tripsinize edildi ve 3,5 cm FluroDish cam alt plakalar üzerine düşük bir yoğunlukta ekildi. </li></ol> B. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition Bu protokol bir AxioObserver Z1 standı, çift kanallı Yokagawa CSU-X1A 5000 iplik disk birimi, 2 Fotometrik QuantEM 512SC emCCD kameralar, bir HXP 120C fiber tabanlı aydınlatıcı, 4 ile donatılmış Zeiss Cep Gözlemci SD iplik diski konfokal mikroskop kullanılarak geliştirilmiştir lazerler (Bir Lasos 100mW multi-line Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diyot, 40 mW 561 nm diyot, ve 30 mW 635 nm diyot), AOTF bir Pecon XL multiS1 sahne kuluçka sistemi, Zeiss inkübasyon modülleri (O 2 Modül S, CO 2 Modül G, TempModule S, Isıtma Ünitesi XL S) ve Geçmiş moBir NanoScanZ piezo Z ekiyle torized XY tablası. Görüntüleme canlı hücreleri sulu bir ortamda, bir C-Apochromat 63x/1.20 Su / Corr objektif lens ve Zeiss İmmersol W daldırma sıvısı (bir kırılma indisi n = 1.334) ile desteklenir ise küresel sapmaları en aza indirmek için kullanılmıştır. 2 kanal konfokal görüntüleme, bir RQFT 405/488/568/647 dikroik ayna ve BP525/50 (yeşil) ve BP629/62 için (kırmızı) emisyon filtresi kullanılmıştır. Kullanılan sistem yazılımı AV4 Multi-channel/Z/T, Hızlı Görüntüleme, Fizyoloji, Mosaix, Mark &amp; ​​Bul, Çift Kamera, 4D İçeride, Otofokus ve 3-D Dekonvolüsyon modülleri ile Zeiss Axiovision (vers. 4.8.2.0) idi. <ol><li> O CO 2 gazı kuluçka sisteminin CO 2 Modül için çalışıyor olduğundan emin olun. Mikroskop bir anti-titreşim hava tablo tarafından destekleniyorsa, hava tablo için hava beslemesi (veya N 2 gazı) açın. </li><li> Iplik disk birimi, kameralar, kuluçka modülleri, HXP aydınlatıcı, motorlu sahne, Argon, mikroskop standı için gücü açınlazer ve bilgisayar. </li><li> Isınma süresi 1 dakika sonra, &quot;On&quot; Argon lazer için kontak anahtarını açın. </li><li> Zeiss lazer kontrol panelinde kullanılacak lazer çizgileri için anahtarları açın. </li><li> &quot;Lazer run&quot; için &quot;bekleme&quot; dan Lasos Argon lazer denetleyicisi için geçiş anahtarı açın ve optimum düzeyde (sadece aşağıdaki yani yeşil gösterge kırmızı yanar noktası) ışık denetleyicisi ayarlayın. </li><li> AxioVision yazılımını başlatın Not:. AxioVision için kullanıcı arayüzü, denetlediği özel mikroskop ve bileşenler için belirli olan pencere ve açılan menüleri ile özelleştirilmiş olabilir. Bunun gibi, her sistem potansiyel olarak benzersiz bir arayüze sahiptir. Bu nedenle, yazılım manipülasyonu için genel talimatlar yerine özel yazılım pencereler, sekmeler ve / veya açılır menüler için yön daha sonraki adımlarda verilmiştir. </li><li> Görüntüleme öncesinde yaklaşık 1 saat, yazılım, kuvöz için denetimlerini bulmak veüst kamara ve sahne plaka ısıtma açın. 37 ° C&#39;ye sıcaklığı ayarlayın CO 2 kontrol açın ve% 5 seviyesini ayarlayın. </li><li> Görüntüleme için objektif lens seçin. Bu çalışmada, bir 63x/1.20 NA C-Apochromat Su / Corr objektif lens kullanılmıştır Not:. Bu lens için, su (Zeiss İmmersol B daldırma sıvı) &#39;e benzer bir kırılma indisi olan bir daldırma ortamı ihtiyaç vardır. </li><li> Birden fazla ayrı konumları, uzun bir süre boyunca örneklenmesi için ise, bu bir konumdan diğerine yapılmasını sağlamak için daldırma orta yeterli bir miktarı uygulamak için emin olmak. </li><li> Sahnede çanak yerleştirin ve alt temas objektif lens getirmek. </li><li> Mikroskop denetimleri veya yazılımı kullanarak, göz mercekleri için yaydığı ışığın yönlendirmek ve uygun Widefield filtre ilgi floresan sinyal (bu çalışma için, &quot;Kırmızı&quot; filtresi 53BP1 ve &quot;GFP&quot; filtre için ayarlanan H2B için belirlenen için belirlenen seçin ). &lt;/ Li&gt; <li> , Oküler lensler sayesinde görüntüle Görüntüyü odaklamak ve hücrelerin uygun bir alan bulun. </li><li> Yazılım veya mikroskop denetimlerini kullanarak, konfokal dönen disk ünitesi ile bağlantı noktasına okuler dan yayılan ışık uzak yönlendirmek. </li><li> Yazılım, uygun lazer (Bu çalışmada, 53BP1 için 561 nm lazer ve H2B için Argon lazer 488 nm hattı için) açın. </li><li> Her kanal için uygun bir seviyeye acousto-optik ayarlanabilir filtre (AOTF) kontrol ayarlayarak lazer yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Uygun dikroik ayna (RQFT 405/488/568/647) ve emisyon filtresi (H2B için 53BP1 ve BP 525/50 BP 629/62) seçin. Dönen disk ünitesi için deklanşör açın. </li><li> Görüş mevcut alanı görüntülemek için &quot;Canlı&quot; penceresini seçin. </li><li> Yazılımda, &quot;Kamera&quot; kontrol açmak, kamera (çift kamera sistemi varsa) kullanılacak seçin ve yaklaşık 100 ms pozlama süresini ayarlayın. % Ayarlayın ve EM kazanmak yerde sınıflandırılmamış olarak. Gerekli veri Not: 53BP1-mCherry yapı biraz loş görünür. Biz EM kazancı artırmak için yararlı buldu. </li><li> Yazılımda, konfokal dönen disk ünitesi için kontrol panelini açmak ve uygun bir görüntü (örneğin ~ 100 ms) yakalamak için kuruldu kamera pozlama süresini girerek dönen disk hızını ayarlayabilirsiniz. Değişiklik kilitlemek için &quot;Set&quot; i tıklayın. </li><li> &quot;Çok boyutlu kazanım&quot; açın. Kanal sekmesini seçin ve yük / uygun kanalları seçmek. Bu araştırma için, DsRed (561 nm lazer uyarma ve BP 629 / emisyon için 62 filtre) ve GFP (eksitasyon ve emisyon için BP525/50 filtresi için 488 nm lazer hattı) için tanımlanan kanalları kullanarak ediyoruz. </li><li> Görüntü kaydı sağlamak için, ortak bir dikroik ayna (RQFT 405/488/568/647) iki kanal için kullanılmıştır. &quot;Otofokus&quot; için yazılım ayarlayın Not:. MDA ayarlarını yapmak için Araçlar → Ayarlar editörü gidin. Yeterli lazer güç (&quot;Yeterli lazer güç&quot; sağlayan bir etken olarak ayarlandığından emin olunfoto-ağartma azaltırken) uygun fluorofor heyecanlandırmak için. </li><li> MDA penceresinde, z-yığını sekmesini seçin. &quot;Z-yığın geçerli odak konumda&quot; seçeneğini seçin. Z-yığınının tam boyutu hücre yükseklik bağlıdır: ~ 10 mikron z-yığını ve Z. Not yoluyla Nyquist örnekleme sağlamak için adım sayısı için &quot;optimum&quot; seçmek için aralığı ayarlayın. Buna göre ayarlayın. </li><li> 23. &quot;Başlat&quot; ve ayarları soruşturma ne uygun olmasını sağlamak için çıkan z-yığın görüntüyü analiz tıklayın (örn. Bu çalışmada, bu görüntü tüm çekirdeğine önemliydi). </li><li> &quot;T&quot; (zaman) sekmesini seçin. Kamptotesin ile denemeniz için, 5 dakika ve bir kontrol (arıtılmamış hücreleri) video için 1 saat için oturumun toplam süresi görüntüleme zaman noktalarında arasındaki süreyi ayarlamak Not:. Hücrelerinin fotoğraf beyazlatma en aza indirmek için, deney yapılandırılmış olması gerekir gibi görüntüleme zamanı noktaları arasındaki AOTF boşlukları lazer olduğunu. </li><li> Fveya çanak çeşitli hücrelerin çoklu nokta görüntüleme, MDA penceresinde, pozisyon sekmesini seçin. Kontrol edilir &quot;başına konum &#39;zaman noktasında önce / sonra ayar&#39; Uygula&quot;. Olun &quot;Mark_Find&quot; seçeneğini seçin. &quot;Canlı&quot; görünümünü kullanarak, etrafında hareket ettirin ve görünümü uygun alanları seçin. </li><li> Deneme başlayacak ve (işlenmemiş hücrelerin) bir kontrol video kaydetmek için çok boyutlu edinme menüden &quot;Başlat&quot; a tıklayın. </li><li> Kontrolü video sonra, uygun işlem (Bu durumda, 10 uM kamptotesin içinde) ilave edin. Biz 2-4 saat için 5-10 dk aralıklarla deneysel (ilaçla tedavi hücreleri) video kaydı Not:. Dikkate almak önemli bir konu, belirli bir etkisi tedavi sonrası meydana geldiği ile hızıdır. Video da görüldüğü gibi, 53BP1 odakları CPT eklenmesinden sonra ~ 5 dk başlar. Nispeten kolay bir süreç, elle çanak ilaç ekleyerek ve mikroskop yeniden kalibre zaman alıyor olsa. Deneyler tasarlarken göz önünde bulundurulması Bu verilmelidir. </li><li> M izlenmesi içinitosis, biz 7.5 dk aralığını ayarlayabilir ve 4-5 saat (belirli ayarları kullanılan hücre dizisi ve onun hücre döngüsünün süresine bağlıdır) kaydedildi. Ayarlamalar uzun kayıt sırasında foto-ağartma önlemek için yapılması gerekebilir. </li></ol> C. Görüntü İşleme ve Analizi Bu protokol Volocity yazılımı (Perkin Elmer) kullanılarak geliştirildi. Bu veriler (AxioVision) elde etmek için kullanılan yazılım aynı zamanda görüntü işleme ve analiz yeteneğine sahiptir. Kullanıcılar kendilerine sunulan yazılımları kullanabilir ve bunların uygulanmasına ilişkin ilgili literatür danışmak için teşvik edilir. <ol><li> Volocity yazılımını açın. Oluşturun ve yeni bir kütüphane adlandırın ve video dosyalarını içe. </li><li> Dosyalarını görüntülemek için, biz genellikle &quot;Genişletilmiş Odak&quot; ayarını kullanmak için en yararlı buluyorum. Bu z-yığını dilimleri üst üste bindirir ve bu protokol için, bize çekirdeğin farklı alanlarda 53BP1 odaklar görüntülemenizi sağlar. </li><li> Gerektiğinde videoları ayarlayın. Volocity alınan görüntülerin kalitesini artırmak için bir araç yelpazesi ile donatılmıştır. Mikroskop ayarlarının uygun olduğunu sağlayarak, çok zaman sonra düzenleme kaydedilebilir. Çoğu zaman, bu görüntüleri deconvolve ve parlaklık / kontrast ayarlamak için yardımcı olur. Sizin özel düzenleme ihtiyaçları deneye dayanan değişecektir. </li><li> Göreli bir zaman damgası ve ölçek çubuğu ekleyin. </li><li> 3-D hücreleri görüntülemek için, &quot;3-D Saydamlık&quot; ayarına getirin. Bu nedenle hücre içinde ilgi yapıların farklı bakış açıları sağlayarak, uzayda 3 boyutlu render hücrelerin rotasyonu verir Not:. It belirlemek için farklı düzlemlerde hücreleri görselleştirmek için yardımcı olduğu faiz seyahat yapıları. Örneğin, &quot;Genişletilmiş Focus&quot; bir ortamda bu 53BP1, aslında, mitoz sırasında DNA dan ayrıştırmak olmadığını anlamak için zordur. Ancak, bu 3-D kolayca görülmektedir. </li><li> Filmler ve hareketsiz görüntüler kullanıcı tercihlerine göre dosya türleri çeşitli içine ihraç edilebilir. </l<html> i&gt; </ol> D. Temsilcisi Sonuçlar CPT yanıt olarak 53BP1 odak oluşumu bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Hücreler 5-10 dk içinde CPT formu odaklar maruz, ve kayıt süresi boyunca bu odaklar korumak. Gibi yoğuşmalı kromozomların etrafında ince bir sis oluşturarak, Şekil 2, mitoz başlangıcında kromatin adlı 53BP1 dissosiye gösterilmiştir. Telofaz oluşur ve mitoz sona gelince, farklı odaklar haline 53BP1 tekrar agregalar. HEK293 hücreleri CPT maruz kalmamış olsa da, yine de endojen DNA hasarı tarafından üretilen bol, spontan 53BP1 onarım odakları oluşur. Bu gözlem bizi 53BP1 iyonizan radyasyon ve radyomimetik ilaçlar 5 hücrelerin maruz kaldıktan sonra benzer bir etki gösteren bir önceki raporu doğrultusunda, erken mitoz sırasında odak teşkil etmemektedir sonucuna izin. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Kamptotesin (10 uM) DSBs ve orta için ilaç ekleme 30 dakika içerisinde fibroblastlar döngüsünde 53BP1 odaklar oluşumuna neden olur. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Şekil 2. 53BP1 HEK293 hücrelerinde telophase/G1 kadar mitoz sırasında odaklar oluşturmaz.

<ol><li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li>
<li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li>
<li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+study+DNA+repair%3A+what%27s+in+the+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li>
<li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li>
<li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Give+me+a+break%2C+but+not+in+mitosis%3A+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li>
<li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li>
<li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li>
<li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459(2010).</li>
<li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1%3A+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li>
<li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+binding+protein+1+%2853BP1%29+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li>
<li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li>
<li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%2C+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li>
<li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Genomik bütünlüğünün korunması hücrenin yaşaması için önemlidir. Erken yaşlanma, karsinogenez veya ölüm 8 genom sonuçları korumak için başarısızlık. Sezmek yoğun ilgi var nasıl temel ve klinik hem de araştırma için önemini kaynaklanan DDR fonksiyonları. Birçok teknikleri hücreleri algılamak ve DNA hasarı onarmak nasıl çalışmaya yardımcı olmak için yıllar içinde geliştirilmiştir. Teknolojideki son gelişmeler giderek daha sofistike yöntemler gelişmeye izin olsa blot gibi immünsitokimya ve batı gibi geleneksel y...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ürün </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> CellStar kültür tabaklarında </td><td> Greiner Bio-one </td></tr><tr><td> FluroDish cam alt yemekler </td><td> Dünya Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM ortam </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Amino asitler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminler </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cep Gözlemci SD Görüntüleme sistemi </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (sürüm 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss İmmersol W Yağı </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity yazılımı (sürüm 6.0) </td><td> Perkin Elmer </td></tr></tbody></table>

dna hasarı tepki proteinler İki ve Üç boyutlu canlı hücre görüntüleme

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Çift iplikli sonları (DSBs) en zararlı DNA olan bir hücre karşılaşabilirsiniz Lezyon. Onarılamayan bırakılırsa, DSBs liman büyük potansiyel mutasyonlar ve kromozomal anomaliler 1. üretmek. DSBs algılamak için hücreler, DNA hasar cevabı (DDR) etkinleştirmek ve DNA tamir için genomik instabilite katalizleyen bu travma önlemek için çok önemlidir. Uyarıldığında, DDR onarım gerçekleşecek ya da apoptoz geçmesi hücre zorlamak için izin vermek için hücre döngüsü tutuklama tetikleyerek genomik bütünlüğünü korumak için çalışır. DSB onarım baskın mekanizmaları nonhomologous sonu katılmadan (NHEJ) ve homolog rekombinasyon tamiri (HRR) (2 yorum) yoluyla meydana gelir. Olan faaliyetleri kesin DDR düzgün çalışması için düzenledi gereken pek çok protein vardır. Ve bu proteinlerin birinin, 53BP1 3-boyutlu (D) görselleştirme - Burada, bir 2 için yöntem açıklanmaktadır. P53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) alanlarına lokalize5-15 dakika 5 içinde odaklarının oluşturulması, modifiye histon 3,4 bağlanarak DSBs. DSB sitelerine 53BP1 ve diğer DDR proteinlerin histon modifikasyonlar ve alım hasar bölgelerinin çevresinde kromatin yapısal yeniden düzenlenmesini kolaylaştırmak ve DNA tamir 6 katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Tamir doğrudan katılım da ötesinde, ilave rollerin, bir intra-S kapısı, bir G2 / M kontrol noktası, düzenleyici ve aşağı doğru DDR proteinleri 7-9 aktive olduğu gibi, DDR de 53BP1 için tarif edilmiştir. Son zamanlarda, 53BP1 yerine DSBs 6 civarına lokalize önce G1 girmek hücreleri bekliyor, mitoz sırasında indüklenen DNA hasarına yanıt olarak odaklar teşkil etmemektedir keşfedilmiştir. Bu tür 53BP1 gibi DDR proteinleri mitoz ile 10 arasındaki ilerlemesi esnasında mitotik yapılar (kinetochores gibi) ile ilişkilendirmek için tespit edilmiştir. Bu protokolü biz 2 kullanılmasını tanımlamak - ve 3-D canlı hücre görüntüleme görselleştirmek içinDNA hasarına neden olan ajan kamptotesin (CPT) yanı sıra, mitoz sırasında 53BP1 davranışı yanıt olarak 53BP1 odaklarının oluşumu. Kamptotesin öncelikle DNA replikasyonu sırasında DSBs neden ben inhibitörü bir topoizomeraz olduğunu. Bunu başarmak için, biz daha önce açıklanan 53BP1-mCherry floresan füzyon proteini DSBs 11 bağlamak mümkün bir 53BP1 proteinin etki oluşan inşa kullanılır. Buna ek olarak, bir histon H2B-GFP füzyon proteini floresan mitoz sırasında 12 hücre döngüsü boyunca ama özellikle kromatin dinamik izlemek mümkün yapı kullanılır. Birden fazla boyutta canlı hücre görüntüleme ökaryotik hücrelerde DDR proteinlerin fonksiyonu anlayışımızı derinleştirmek için mükemmel bir araçtır.

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Çift zincir kırıkları (ÇZK'ler), bir hücrenin karşılaşabileceği en zararlı DNA lezyonlarıdır. Onarılmadan bırakıldıklarında ÇZK'ler, ... oluşturma konusunda büyük bir potansiyele sahiptir.

Bu gösterim, DNA hasar yanıtında yer alan proteinlerin uzaysal-zamansal ilişkilerini anlamak için iki ve 3B canlı hücre görüntülemesini kullanmaktadır. İlk olarak, seçtiğiniz hücre hattını uygun floresan işaretleyiciler içeren ekspresyon konstrüktları ile transfekte edin veya transduksiyon yapın. Burada M Cherry ve GFP kullanılmıştır; ardından floresanla işaretlenmiş hücreleri normal koşullar altında gösteren bir dizi kontrol videosu elde edin.Ardından uygun bir işlem uygulayın, bu işlemin floresan hücre süreci üzerindeki etkilerine dair verileri kaydedin ve proteinlerin uzay-zamansal ilişkilerini belirlemek için video verilerini analiz edin. Nihayetinde, canlı hücre floresan mikroskobisi, DNA hasar verici ajanlara yanıt olarak 53 BP1 odaklarının oluşumu veya mitoz sırasında 53 BP1'in davranışı gibi hücresel dinamikleri detaylandırabilir. Belirli hücre hatlarında farklı işlemlerin mitozu nasıl etkilediğini incelemek istediğimizde, 2D ve 3D canlı hücre görüntülemeye ilgi duymaya başladık.Bu deneysel yaklaşım, DNA hasar yanıtını ve genomik stabilitesinin korunmasını geleneksel yöntemlere göre daha kolay incelememize olanak tanır. Ayrıca, bu yöntemi belirli proteinlerin çeşitli sinyal yollarında ve çeşitli hücre hatlarında nasıl etkileşime girdiğini çalışmak için kullanabilirsiniz. Canlı hücre görüntülemenin sitokimya gibi geleneksel tekniklere göre temel avantajı, DNA hasar yanıt proteinlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesine imkan vermesidir.Doğru kayıt koşullarını optimize etmek zorlayıcı olabilir. Bu gösterim, başarıyı garanti etmek için gereken birçok küçük adımı görmek amacıyla kullanılabilir. Fotobeyazlamayı en aza indirmek, doğru kayıt aralıklarını ve uygun kayıt süresini belirlemek vb. konularda kararlılığın sonuç vereceğini unutmayın.mCherry ve GFP füzyon protein ekspresyonu için ilgili plazmitlerle uygun hücre hatlarını transfect veya transduce edin. Kültürleri ilaç seçimi altında sürdürün ve görüntüleme işleminin bir gün öncesinde floresan proteinlerin ekspresyonunu periyodik olarak kontrol edin. Hücreleri tripsin kullanarak hasat edin.Ardından düşük yoğunluklu kültürleri 3,5 santimetre fluoro dish cam tabanlı plakalara ekleyin. Bu protokol, axio observer Z one stand ile donatılmış Zeiss cell observer SD spinning disc konfokal mikroskop kullanılarak geliştirilmiştir. Öncelikle CO2 gazının inkübasyon sisteminin CO2 modülüne ulaştığından emin olun. Eğer mikroskop titreşim önleyici bir Airtable ile destekleniyorsa, Airtable'ın hava beslemesini açın.Şimdi mikroskop standı dönen disk ünitesi kameraları, inkübasyon modülleri, HXP aydınlatıcı, motorize tabla, argon lazeri ve bilgisayarın gücünü açın. Kullanılacak lazer hatlarının anahtarlarını açın. Axio vision yazılımını başlatın.Avision yazılımı, mikroskoba ve kontrol ettiği bileşenlere özgü pencereler ve açılır menülerle özelleştirilebilir. Bu nedenle, her kullanıcı arayüzü potansiyel olarak benzersiz bir görünüme sahiptir. Görüntüleme işleminden yaklaşık bir saat önce, inkübatör kontrollerini bulun; üst haznenin ve tabla plakasının ısıtmasını açın.Sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın. CO2 kontrolünü açın ve seviyeyi %5 olarak belirleyin. Bu çalışmadaki görüntüleme için uygun objektif lensini seçin. Objektif lensi, kırıcılık indisi suya benzer bir daldırma ortamının kullanılmasını gerektirir.Uzun süreler boyunca birden fazla konumun görüntüsünü almanız gerekiyorsa, mikroskobun kurumaması için yeterli miktarda daldırma medyumu uyguladığınızdan emin olun. Kültür kabını sahneye yerleştirin ve mikroskop kontrollerini veya yazılımı kullanarak objektif lensi tabana temas ettirin. Yayılan ışığı okülerlere yönlendirin ve ilgilenilen floresan sinyali için uygun geniş alan filtre setini seçin.Şimdi oküler lensler üzerinden bakın. Yazılımı veya mikroskop kontrollerini kullanarak görüntüyü odaklayın ve uygun bir hücre alanı belirleyin. Yazılım üzerinden, yayılan ışığı okülerlerden uzaklaştırarak konfokal dönen disk ünitesinin bulunduğu porta yönlendirin.Bu çalışma için uygun lazeri açın. Her kanal için, kuo optik ayarlanabilir filtre kontrolünü uygun bir seviyeye getirerek lazerin yoğunluğunu ayarlayın. Ardından, uygun dikroik aynayı ve emisyon filtrelerini seçin.Döner disk ünitesinin panjurunu açın. Mevcut görüş alanını görüntülemek için canlı penceresini seçin. Şimdi kamera kontrol penceresini açın.Kullanılacak kamerayı seçin ve pozlama süresini yaklaşık 100 milisaniyeye ayarlayın. Gerektiğinde yüzde ve EM kazancını ayarlayın. Ayrıca, konfokal döner disk ünitesinin kontrol panelini açın ve uygun bir görüntü yakalamak için ayarlanan kamera pozlama süresini girerek döner disk hızını ayarlayın.Değişikliği onaylamak için set seçeneğine tıklayın. Şimdi çok boyutlu görüntüleme penceresini açın. Kanal sekmesini seçin ve Flora Fours için tanımlanmış uygun kanalları yükleyin veya seçin.Görüntü kaydırmasını (registration) önlemek için her iki kanal için de ortak bir dikroik ayna kullanın. Yazılımı otomatik odaklama (auto focus) moduna getirin. MDA penceresine geçin ve ZS stack sekmesine tıklayın.Mevcut odak konumunda ZS yığınını seçin. 10 mikronluk bir Z yığını için aralığı ayarlayın ve Z boyunca Nyquist örneklemesini sağlamak için adım sayısı için en uygun seçeneği belirleyin. Şimdi başlat'a tıklayın ve sonuçlanan Z yığını görüntüsünü analiz edin. Zaman sekmesini seçin.Görüntüleme zaman noktaları arasındaki aralığı ve oturumun toplam süresini ayarlayın. Kapta bulunan birkaç hücrenin çok noktalı görüntülemesi için MDA penceresini açın. Konum sekmesini seçin ve "pozisyon başına zaman noktasından önce veya sonra uygula" ayarının işaretli olduğunu doğrulayın.Şimdi işaretlemeyi seçin. Canlı görünümü kullanarak uygun görüş alanlarını bulun ve petri kabını hareket ettirerek seçin. Deneyi başlatmak ve bir kontrol videosu kaydetmek için çok boyutlu görüntüleme menüsündeki başlat düğmesine tıklayın.Uygun işlemi ekleyin ve belirlenen zaman aralıklarında, tanımlanmış bir süre boyunca deneysel videoyu kaydedin. Bu hücre hattı için ve mitozun tüm sürecini izlemek amacıyla, yedi buçuk dakikalık bir aralık kullandık ve bunu dört ila beş saat boyunca sürdürdük. Kendi hücre hattınız ve çalışmak istediğiniz konu için özel ayarları sizin belirlemeniz gerekecektir.Velocity yazılımını açın, yeni bir kütüphane oluşturup isimlendirin ve dosyaları görüntülemek için deneysel video dosyalarını içe aktarın. Genişletilmiş odak ayarını kullanmayı deneyin ve videoları gerektiği şekilde düzenleyin. Velocity, elde ettiğiniz görüntülerin kalitesini artırmaya yardımcı olacak bir dizi araçla donatılmıştır.Mikroskop ayarları uygun şekilde yapılırsa, daha sonra düzenleme aşamasında büyük ölçüde zaman tasarrufu sağlanacaktır. Görüntüleri geliştirmek ve parlaklık ile kontrastı ayarlamak genellikle faydalıdır; özel ihtiyaçlarınız deneyinize göre değişiklik gösterecektir. Hücreleri 3B olarak görüntülemek için 3B opaklık ayarına geçiş yapın.Bu, 3D olarak işlenmiş hücrelerin uzayda döndürülmesine izin vererek hücre içindeki ilgi çekici yapıların birden çok perspektiften görülmesini sağlar. Videolar. Sabit görüntüler, kullanıcı tercihine bağlı olarak çeşitli dosya türlerinde dışa aktarılabilir Kontrollere kıyasla. CPT'ye maruz kalan fibroblast hücreleri beş ila 10 dakika içinde odak noktaları oluşturmuş ve bu odak noktalarını kayıt süresi boyunca korumuştur.İlginç bir şekilde, insan embriyonik böbrek hücrelerinde, 53 BP one mitozun başlangıcında kromatinden ayrılır ve yoğunlaşan kromozomların etrafında ince bir pus oluşturur. Telofaz gerçekleşip mitoz sona erdiğinde, 53 BP one yeniden belirgin odaklarda toplanır. Bu videonun, DNA hasar yanıtında görev alan proteinlerin yanı sıra diğer yolakların spasyotemporal ilişkilerini incelemenize yardımcı olacağını umuyoruz.Örneğin, kromatin dinamiği alanında bu teknik, 53 BP1 bağlanmasının DNA'nın telomerik uçlarının hareketini nasıl etkilediğini incelemek için kullanılmıştır. Genetik olarak modifiye edilmiş hücrelerin oluşturulmasından sonra, yaklaşık dört ila sekiz saat içinde iki ve üç boyutlu canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirilebilir. Optimal görüntüleme elde etmek için mikroskop ayarlarının uygun şekilde düzenlendiğinden emin olun.

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, ışınlanmış hücre çekirdeğindeki çift sarmallı DNA kırılma bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'in lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan yöntemini açıklıyoruz.

DNA Onarım Protein Etkileşimlerinin İmmünofloresan Tabanlı Görselleştirilmesi

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Bu protokol, dna çift iplik kopmalarında transkripsiyonu tek molekül hassasiyetiyle tespit etmek için yeni bir muhabir gen sistemi ve deneysel kurulum sunar.

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

Öğrenin, DNA hasarı yanıt proteinlerinin iki ve üç boyutlu canlı hücre görüntüleme ile uzamsal-zamansal ilişkilerini incelemeyi. Bu yöntem, 53BP1 fokus oluşumunu ve mitoz sırasındaki davranışını gerçek zamanlı gözlemlemenizi sağlar.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Daha fazla video keşfet