DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Bu gösterim, DNA hasar yanıtında yer alan proteinlerin uzaysal-zamansal ilişkilerini anlamak için iki ve 3B canlı hücre görüntülemesini kullanmaktadır. İlk olarak, seçtiğiniz hücre hattını uygun floresan işaretleyiciler içeren ekspresyon konstrüktları ile transfekte edin veya transduksiyon yapın. Burada M Cherry ve GFP kullanılmıştır; ardından floresanla işaretlenmiş hücreleri normal koşullar altında gösteren bir dizi kontrol videosu elde edin.

Ardından uygun bir işlem uygulayın, bu işlemin floresan hücre süreci üzerindeki etkilerine dair verileri kaydedin ve proteinlerin uzay-zamansal ilişkilerini belirlemek için video verilerini analiz edin. Nihayetinde, canlı hücre floresan mikroskobisi, DNA hasar verici ajanlara yanıt olarak 53 BP1 odaklarının oluşumu veya mitoz sırasında 53 BP1'in davranışı gibi hücresel dinamikleri detaylandırabilir. Belirli hücre hatlarında farklı işlemlerin mitozu nasıl etkilediğini incelemek istediğimizde, 2D ve 3D canlı hücre görüntülemeye ilgi duymaya başladık.

Bu deneysel yaklaşım, DNA hasar yanıtını ve genomik stabilitesinin korunmasını geleneksel yöntemlere göre daha kolay incelememize olanak tanır. Ayrıca, bu yöntemi belirli proteinlerin çeşitli sinyal yollarında ve çeşitli hücre hatlarında nasıl etkileşime girdiğini çalışmak için kullanabilirsiniz. Canlı hücre görüntülemenin sitokimya gibi geleneksel tekniklere göre temel avantajı, DNA hasar yanıt proteinlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesine imkan vermesidir.

Doğru kayıt koşullarını optimize etmek zorlayıcı olabilir. Bu gösterim, başarıyı garanti etmek için gereken birçok küçük adımı görmek amacıyla kullanılabilir. Fotobeyazlamayı en aza indirmek, doğru kayıt aralıklarını ve uygun kayıt süresini belirlemek vb. konularda kararlılığın sonuç vereceğini unutmayın.

mCherry ve GFP füzyon protein ekspresyonu için ilgili plazmitlerle uygun hücre hatlarını transfect veya transduce edin. Kültürleri ilaç seçimi altında sürdürün ve görüntüleme işleminin bir gün öncesinde floresan proteinlerin ekspresyonunu periyodik olarak kontrol edin. Hücreleri tripsin kullanarak hasat edin.

Ardından düşük yoğunluklu kültürleri 3,5 santimetre fluoro dish cam tabanlı plakalara ekleyin. Bu protokol, axio observer Z one stand ile donatılmış Zeiss cell observer SD spinning disc konfokal mikroskop kullanılarak geliştirilmiştir. Öncelikle CO2 gazının inkübasyon sisteminin CO2 modülüne ulaştığından emin olun. Eğer mikroskop titreşim önleyici bir Airtable ile destekleniyorsa, Airtable'ın hava beslemesini açın.

Şimdi mikroskop standı dönen disk ünitesi kameraları, inkübasyon modülleri, HXP aydınlatıcı, motorize tabla, argon lazeri ve bilgisayarın gücünü açın. Kullanılacak lazer hatlarının anahtarlarını açın. Axio vision yazılımını başlatın.

Avision yazılımı, mikroskoba ve kontrol ettiği bileşenlere özgü pencereler ve açılır menülerle özelleştirilebilir. Bu nedenle, her kullanıcı arayüzü potansiyel olarak benzersiz bir görünüme sahiptir. Görüntüleme işleminden yaklaşık bir saat önce, inkübatör kontrollerini bulun; üst haznenin ve tabla plakasının ısıtmasını açın.

Sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın. CO2 kontrolünü açın ve seviyeyi %5 olarak belirleyin. Bu çalışmadaki görüntüleme için uygun objektif lensini seçin. Objektif lensi, kırıcılık indisi suya benzer bir daldırma ortamının kullanılmasını gerektirir.

Uzun süreler boyunca birden fazla konumun görüntüsünü almanız gerekiyorsa, mikroskobun kurumaması için yeterli miktarda daldırma medyumu uyguladığınızdan emin olun. Kültür kabını sahneye yerleştirin ve mikroskop kontrollerini veya yazılımı kullanarak objektif lensi tabana temas ettirin. Yayılan ışığı okülerlere yönlendirin ve ilgilenilen floresan sinyali için uygun geniş alan filtre setini seçin.

Şimdi oküler lensler üzerinden bakın. Yazılımı veya mikroskop kontrollerini kullanarak görüntüyü odaklayın ve uygun bir hücre alanı belirleyin. Yazılım üzerinden, yayılan ışığı okülerlerden uzaklaştırarak konfokal dönen disk ünitesinin bulunduğu porta yönlendirin.

Bu çalışma için uygun lazeri açın. Her kanal için, kuo optik ayarlanabilir filtre kontrolünü uygun bir seviyeye getirerek lazerin yoğunluğunu ayarlayın. Ardından, uygun dikroik aynayı ve emisyon filtrelerini seçin.

Döner disk ünitesinin panjurunu açın. Mevcut görüş alanını görüntülemek için canlı penceresini seçin. Şimdi kamera kontrol penceresini açın.

Kullanılacak kamerayı seçin ve pozlama süresini yaklaşık 100 milisaniyeye ayarlayın. Gerektiğinde yüzde ve EM kazancını ayarlayın. Ayrıca, konfokal döner disk ünitesinin kontrol panelini açın ve uygun bir görüntü yakalamak için ayarlanan kamera pozlama süresini girerek döner disk hızını ayarlayın.

Değişikliği onaylamak için set seçeneğine tıklayın. Şimdi çok boyutlu görüntüleme penceresini açın. Kanal sekmesini seçin ve Flora Fours için tanımlanmış uygun kanalları yükleyin veya seçin.

Görüntü kaydırmasını (registration) önlemek için her iki kanal için de ortak bir dikroik ayna kullanın. Yazılımı otomatik odaklama (auto focus) moduna getirin. MDA penceresine geçin ve ZS stack sekmesine tıklayın.

Mevcut odak konumunda ZS yığınını seçin. 10 mikronluk bir Z yığını için aralığı ayarlayın ve Z boyunca Nyquist örneklemesini sağlamak için adım sayısı için en uygun seçeneği belirleyin. Şimdi başlat'a tıklayın ve sonuçlanan Z yığını görüntüsünü analiz edin. Zaman sekmesini seçin.

Görüntüleme zaman noktaları arasındaki aralığı ve oturumun toplam süresini ayarlayın. Kapta bulunan birkaç hücrenin çok noktalı görüntülemesi için MDA penceresini açın. Konum sekmesini seçin ve "pozisyon başına zaman noktasından önce veya sonra uygula" ayarının işaretli olduğunu doğrulayın.

Şimdi işaretlemeyi seçin. Canlı görünümü kullanarak uygun görüş alanlarını bulun ve petri kabını hareket ettirerek seçin. Deneyi başlatmak ve bir kontrol videosu kaydetmek için çok boyutlu görüntüleme menüsündeki başlat düğmesine tıklayın.

Uygun işlemi ekleyin ve belirlenen zaman aralıklarında, tanımlanmış bir süre boyunca deneysel videoyu kaydedin. Bu hücre hattı için ve mitozun tüm sürecini izlemek amacıyla, yedi buçuk dakikalık bir aralık kullandık ve bunu dört ila beş saat boyunca sürdürdük. Kendi hücre hattınız ve çalışmak istediğiniz konu için özel ayarları sizin belirlemeniz gerekecektir.

Velocity yazılımını açın, yeni bir kütüphane oluşturup isimlendirin ve dosyaları görüntülemek için deneysel video dosyalarını içe aktarın. Genişletilmiş odak ayarını kullanmayı deneyin ve videoları gerektiği şekilde düzenleyin. Velocity, elde ettiğiniz görüntülerin kalitesini artırmaya yardımcı olacak bir dizi araçla donatılmıştır.

Mikroskop ayarları uygun şekilde yapılırsa, daha sonra düzenleme aşamasında büyük ölçüde zaman tasarrufu sağlanacaktır. Görüntüleri geliştirmek ve parlaklık ile kontrastı ayarlamak genellikle faydalıdır; özel ihtiyaçlarınız deneyinize göre değişiklik gösterecektir. Hücreleri 3B olarak görüntülemek için 3B opaklık ayarına geçiş yapın.

Bu, 3D olarak işlenmiş hücrelerin uzayda döndürülmesine izin vererek hücre içindeki ilgi çekici yapıların birden çok perspektiften görülmesini sağlar. Videolar. Sabit görüntüler, kullanıcı tercihine bağlı olarak çeşitli dosya türlerinde dışa aktarılabilir Kontrollere kıyasla. CPT'ye maruz kalan fibroblast hücreleri beş ila 10 dakika içinde odak noktaları oluşturmuş ve bu odak noktalarını kayıt süresi boyunca korumuştur.

İlginç bir şekilde, insan embriyonik böbrek hücrelerinde, 53 BP one mitozun başlangıcında kromatinden ayrılır ve yoğunlaşan kromozomların etrafında ince bir pus oluşturur. Telofaz gerçekleşip mitoz sona erdiğinde, 53 BP one yeniden belirgin odaklarda toplanır. Bu videonun, DNA hasar yanıtında görev alan proteinlerin yanı sıra diğer yolakların spasyotemporal ilişkilerini incelemenize yardımcı olacağını umuyoruz.

Örneğin, kromatin dinamiği alanında bu teknik, 53 BP1 bağlanmasının DNA'nın telomerik uçlarının hareketini nasıl etkilediğini incelemek için kullanılmıştır. Genetik olarak modifiye edilmiş hücrelerin oluşturulmasından sonra, yaklaşık dört ila sekiz saat içinde iki ve üç boyutlu canlı hücre görüntülemesi gerçekleştirilebilir. Optimal görüntüleme elde etmek için mikroskop ayarlarının uygun şekilde düzenlendiğinden emin olun.