Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Bu prosedürün genel amacı, konfokal bir floresan mikroskopi lazeri kullanarak bir hücrenin alt nükleer bölgesinde DNA hasarını indüklemektir. Bu yöntem, proteinlerin DNA hasarı bölgelerinde nasıl toplandığı ve tutulduğu gibi DNA onarımının temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen proteinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin vermesidir, böylece işe alım ve elde tutma profili oluşturulabilir.

Bu prosedüre, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulan bir sahne üstü inkübatöre ilgilenilen hücreleri içeren odacıklı bir slayt yerleştirerek başlayın. Kodlanmış bir otomatik mikroskop aşaması kullanarak görüntü alanlarını kaydedin. Kuyucuklar arasındaki bariyer gibi kültür kabının tanınabilir bir özelliğini seçin.

Bir görüntü toplayın ve XY konumunu kaydedin. Bu, numune hazırlamanın ardından seçilen alanların X-Y konumlarının hizalanmasına ve kaydedilmesine izin verecektir. Görüntü kaydı tamamlandıktan sonra, mikro ışınlama için bir alan seçin ve numuneyi odaklayın.

Floresan etiketli proteinleri ifade eden hücreler için, ilgilenilen floresan kanalında maksimum nükleer kesite sahip odak düzlemini seçin. Çekirdeğin maksimum kesitine odaklanmak çok önemlidir, çünkü ilgilenilen proteinin indüklenen hasar bölgesine alımını izlemek için odak noktasının çekirdek üzerinde merkezlenmesini sağlar. Çekirdek içinde çekirdekçik gibi net bir özellik seçin ve görünümdeki bu değişikliği gözlemlerken odak düzlemini yukarı ve aşağı hareket ettirin.

Gerçek odak düzlemi, aydınlıktan karanlığa geçişin içinde yer alacaktır. Örneğe odaklanmak için, seçilen unsurun en keskin kontrasta sahip olduğu odak düzlemini seçin. Bir sonraki adım, ilgilenilen alanın konumunu kaydetmektir.

Mikroskop yazılımında üçe üç piksel karelik bir ilgi alanı veya ROI oluşturun. Bu ROI'yi hasar görecek bir hücrenin çekirdeğinin üzerine yerleştirin ve bu ROI'yi hasarlı ROI olarak ayarlayın. Hasar ROI'sinin konumu da dahil olmak üzere bir hasar öncesi görüntü toplayın.

İlgilenilen protein için çiçeklenme kanalında parlak alan içeren bir görüntü elde edin. Hücreler artık lazer mikro ışınlaması için hazırdır. Bu gösteri için 405 nanometre lazer% 100 güçte kullanılacaktır.

405 nanometre lazer dozu, tarama hızının modüle edilmesi ve seçilen hasar ROI'sinin bir taramasının gerçekleştirilmesiyle kontrol edilir. Bu deneyde, 405 nanometrede mikro ışınlama için saniyede sekiz ve 0,5 kare kullanın. Hücrelere zarar vermek için uygun lazer gücünün seçilmesi, farklı DNA onarım yollarının ayrılması için kritik öneme sahiptir.

Hasardan sonra parlak alan ve floresan kanallarının hızlandırılmış görüntü alımını gerçekleştirin. Veri toplamayı optimize etmek için hızlandırılmış çekimin süresini ve sıklığını ayarlayın, ideal olarak floresan proteinin hasar ROI'sindeki birikimini ve deneyin zaman boyunca ayrışmasını yakalayın. Zaman seyri tamamlandıktan sonra, hasar için yeni bir hücre alanı seçin ve istenen hasarlı hücre sayısına ulaşılana kadar mikro ışınlama ve hızlandırılmış görüntülemeye devam edin.

Seçilen koşul başına 10 ila 25 hücre önerilir. İmmünofloresan analizi için toplam hücre sayısını artırmak için, hasar sonrası yanıtın çok alanlı bir zaman seyrini oluşturmak için kültür kabı içindeki ek alanlara zarar verin. Her alanın X-Y konumunu ve hasarın meydana geldiği zamanı kaydedin.

Hücreler hasardan hemen sonra sabitlenebilir veya sabitlemeden önce seçilen zaman aralıkları boyunca onarılmasına izin verilebilir. Bu analize başlamak için, alınan görüntüleri NIS-Elements gibi bir görüntü analizi uygulamasında açın. Ölçülecek her hücre için önce çekirdeği temsil eden bir referans ROI oluşturun.

Çekirdeği oluşturan pikselleri içeren çiçeklenme sinyali üzerinde bir eşik algoritması kullanın ve ardından bu alanı bir ROI'ye dönüştürün. Ardından, altıya altı piksellik bir yatırım getirisi oluşturun ve bunu hasar yatırım getirisinin üzerine yerleştirin. Bu daha büyük yatırım getirisi artık analiz için hasar yatırım getirisidir.

Ölçülecek her hücre için, referans ve hasar ROI'leri için ortalama çiçeklenme yoğunluğunu kaydedin. Zaman seyrinin her karesi için, nükleer alanın YG tarafından doğru bir şekilde kapsandığından emin olmak için referans yatırım getirisini ayarlayın ve hasarlı noktanın kapatıldığından emin olmak için hasar yatırım getirisini ayarlayın. Zaman seyrinin her karesi için her bir ROI içinde floresan sinyalinin ortalama floresan yoğunluğunu kaydedin.

Her hücre için, ortalama hasar ROI floresan yoğunluğunu, zaman atlamalı çekimin her karesinde karşılık gelen referans ROI'nin yoğunluğuna normalleştirin. Burada, referans ROI olarak ortalama nükleer floresan yoğunluğu kullanılır ve normalizasyon, ortalama referans ROI floresan yoğunluğunun ortalama hasar ROI floresan yoğunluğundan çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Normalleştirmeyi tüm hasarlı hücrelerin yanı sıra en az iki hasarsız kontrol hücresi için tekrarlayın.

Son olarak, deneysel tedavinin bir fonksiyonu olarak işe alım dinamiklerindeki değişiklikleri göstermek için zaman içinde normalleştirilmiş yoğunluk değerlerinin grafiğini çıkarın. XRCC1-GFP'yi stabil bir şekilde eksprese eden hücreler ışınlandı ve hasar indüksiyonundan önce ve sonra görüntülendi. XRCC1-GFP'nin hasar ROI'sine dahil edilmesi gözlemlendi ve işe alım dinamikleri ölçüldü.

Çift iplikçik kopmalarının oluşumu iki belirteç kullanılarak incelendi. Her iki belirteç için, 355 nanometrede iki saniyelik düşük doz stimülasyonu, beş dakika ve 20 dakikada yanıt vermez ve ışınlamadan 10 dakika sonra zayıf ve değişken bir yanıt verir. 355 nanometrede 10 saniyelik yüksek doz mikro ışınlama, ışınlamadan beş, 10 ve 20 dakika sonra hasar ROI'si içinde artan bir floresan sinyaline neden olur ve bu 40 dakikada azalır.

Bu sonuçlar, DNA çift sarmallı kırılma belirteçlerinin doza bağlı bir şekilde 355 nanometre mikro ışınlamada yanıt verdiğini göstermektedir. Buna karşılık, 405 nanometre lazer stimülasyonu, uygulanan dozdan bağımsız olarak hasar ROI'si içinde her iki belirteçin de önemli ölçüde birikmesine neden oldu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 10 hücre için yaklaşık dört saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu tekniği uygularken, lazer dalga boyunu ve uygulanan gücü izlenen onarım sürecine göre uyarlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek proteinlerin işe alınması veya fosforilasyon durumundaki değişiklikler veya diğer translasyon sonrası modifikasyonlar hakkındaki soruları yanıtlamak için immünofloresan yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların DNA onarım proteinlerinin dinamik alımını keşfetmelerine ve protein alanlarının ve mutasyonlarının DNA hasarının tanınmasını ve buna verilen yanıtı nasıl etkilediğini daha iyi belirlemelerine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA hasarını indüklemek ve DNA onarım proteinlerinin alımını izlemek için lazer taramalı konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Lazerler ve formaldehit gibi kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.