Name: Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Öğrenin lazer mikro-ışınlama ile DNA hasarı indüksiyonu ve onarım proteinlerinin gerçek zamanlı gözlemlenmesi yöntemini. Bu teknik memeli hücrelerinde çift sarmalık kırık onarım mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Dr Samuel H. Wilson, ulusal çevre sağlık Bilimler Enstitüsü Bu çalışmada kullanılan hücre hatları için teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+reversible+assembly+of+a+multiprotein+DNA+repair+complex+ensures+accurate+target+site+recognition+and+efficient+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair.</a> J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).</li>
<li>Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mammalian+NER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mammalian NER proteins.</a> DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+laser+uv-microirradiation+%28lambda+%3D+2573+A%29+on+proliferation+of+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells.</a> Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+laser--UV+microirradiation-induced+DNA+photolesions+by+immunofluorescent+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining.</a> Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).</li>
<li>Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+laser-UVA-microirradiation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells.</a> J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).</li>
<li>Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependence+of+oxidative+DNA+damage+induced+by+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).</li>
<li>Kielbassa, C., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+induced+by+ultraviolet+and+visible+light+and+its+wavelength+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence.</a> Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+breaks+and+alkali-labile+bonds+induced+by+ultraviolet+light+in+DNA+with+5-bromouracil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo.</a> Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+from+single+photochemical+events+in+DNA+containing+5-bromouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil.</a> Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).</li>
<li>Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dye+Hoechst+33258+in+a+modification+of+the+bromodeoxyuridine+photolysis+technique+for+the+analysis+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair.</a> Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).</li>
<li>Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+of+Chinese+hamster+cells+at+wavelength+365+nm%3A+effects+of+psoralen+and+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine.</a> Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).</li>
<li>Limoli, C. L., Ward, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+introducing+double-strand+breaks+into+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA.</a> Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).</li>
<li>Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0739626092900178">Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy.</a> Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1076567008702738">Confocal Microscopy: Recent Developments.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+accumulation+at+sites+of+DNA+damage+and+in+postreplicative+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin.</a> J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).</li>
<li>Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+PARP+triggers+nonhomologous+end-joining+in+repair-deficient+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts.</a> PLoS One. 7 (11), 49301(2012).</li>
<li>Bolin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cyclin-dependent+kinase+5+depletion+on+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+activity+and+responses+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Godon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition+versus+PARP-1+silencing%3A+different+outcomes+in+terms+of+single-strand+break+repair+and+radiation+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility.</a> Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).</li>
<li>Hanssen-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+coordinates+disparate+responses+and+multiprotein+repair+complexes+depending+on+the+nature+and+context+of+the+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage.</a> Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+regulatory+protein+recruitment+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites.</a> J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).</li>
<li>Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recruitment+of+DNA+Ligase+I+and+III+to+DNA+repair+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites.</a> Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).</li>
<li>Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+local+DNA+damage+by+visible+light+to+study+chromatin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair.</a> DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+near+infrared+femtosecond+lasers+as+sub-micron+radiation+microbeam+for+cell+DNA+damage+and+repair+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies.</a> Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Front Genet. 4, 135(2013).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Werner+protein+at+DNA+double-strand+breaks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells.</a> J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).</li>
<li>Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+oxidative+stress-induced+DNA+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">DNA single-strand break repair.</a> Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).</li>
<li>London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+XRCC1-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair.</a> DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).</li>
<li>Moser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+of+chromosomal+DNA+nicks+during+nucleotide+excision+repair+requires+XRCC1+and+DNA+ligase+III+alpha+in+a+cell-cycle-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner.</a> Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).</li>
<li>Campalans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+patterns+and+PARP+dependence+of+XRCC1+recruitment+to+single-strand+break+and+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).</li>
<li>Cooke, M. S., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooke%2C+MS+%22Immunochemical+detection+of+oxidative+DNA+damage.+Vol.+I%22">Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I</a>. , World Scientific. 275-293 (2003).</li>
<li>Rossner, P., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+oxidatively+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).</li>
<li>Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).</li>
<li>Rybak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+phosphorylation+of+histone+H2AX+on+serine+139+%28%CE%B3H2AX%29+is+not+associated+with+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks.</a> Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).</li>
<li>Haince, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+kinetics+of+recruitment+of+MRE11+and+NBS1+proteins+to+multiple+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites.</a> J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+break+repair+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-strand break repair and genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).</li>
<li>Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+aspects+of+clustered+DNA+damage+induction+by+ionising+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Prot+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation.</a> Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).</li>
<li>Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylation+base+damage+is+converted+into+repairable+double-strand+breaks+and+complex+intermediates+in+G2+cells+lacking+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease.</a> PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).</li>
<li>Siddiqi, M. A., Bothe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-+and+double-strand+break+formation+in+DNA+irradiated+in+aqueous+solution%3A+dependence+on+dose+and+OH+radical+scavenger+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration.</a> Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).</li>
<li>Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+laser+inactivation--towards+a+spatiotemporal-functional+analysis+of+proteins%2C+and+the+ablation+of+chromatin%2C+organelle+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function.</a> J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biol. 2, 368-376 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada tanımlanan koşullara kullanarak, bir UV-A veya üretici tarafından entegre veya son kullanıcı tarafından eklenen 405 nm lazer, confocal herhangi bir mikroskopla DNA hasar bir hücre çekirdeği içinde ikna etmek ve DNA onarım proteinler sitesine alımı izin verebilirsiniz izlenecek DNA hasarı indüklenen. Ancak, belirtilen iletişim kuralı ve temsilcisi sonuçları, dalga boyu seçimi, güç, uygulanan ve hasar karakterizasyonu, ilk kullanıcı tarafından belirli bir DNA çalışması için ele alınması gereken sorunlar yolu tamir tüm önemli. Ayrıca, aynı zamanda kullanıcıların dikkate alınmalıdır deneysel tasarım ile ilgili diğer konular bulunmaktadır.
Protein davranış canlı hücreleri sonrası izlemek için mikro-ışınlama, fluorescently etiketli bir protein oluşturulması gerekir. Geniş bir hayalice ayrılmış floresan proteinlerin kullanılabilirliğini hücresel yanıt DNA hasarı indüksiyon için karakterize için kullanılabilir protein füzyon oluşturmak için araçlar sunar. Stabil transfected hücreleri sunarken daha ifade seviyeleri üzerine kontrol ve diğer biyokimyasal izin ilgi floresan proteinlerin geçici transfection zararlı koşullar, mutasyonlar veya hatta inhibitörleri, hızlı tarama için sağlar karakterizasyonu gerçekleştirilecek, mikro-ışınlama sonuçları doğrulanıyor. Hayalice farklı floresan proteinler de aynı hücrede protein aynı yolu içinde veya farklı yolları arasındaki etkileşimleri izlemek için yararlı olabilir. Floresan proteinler de ilgi her protein için özel antikorlar ihtiyacını ortadan kaldırmak ve canlı hücre hasarı indüksiyon sonra uzun süreler için protein davranışını izleme sağlar.
Ancak, floresan proteinler kullanımı da sakıncaları vardır. Genetik arka plan eksik faiz protein(s) içinde endojen proteinler fluorescently tagged proteinler ile yarışacak. Konjugasyon floresan etiketinin protein N ve C terminus için protein katlanması değiştirme, anahtar protein-protein etkileşimleri engel veya translocation sinyalleri engellemek; işlevini değiştirme ve potansiyel olarak işe alım dynamics etkileyen. Bu etkiler nerede immünfloresan boyama önemli ölçüde farklı işe alma ve saklama defa endojen proteinleri hasar site28için gösterilen raporlar bir dizi gösterilmiştir. Geçici transfection veya istikrarlı klonlar da gözlenen, genellikle protein ifade düzeyleri değişimler aracılığıyla yanıt değiştirebilirsiniz. Ayrıca, birden çok floresan proteinler arasında tek bir deneme kullanımı da işe alım, dinamikleri protein düzeyleri de equilibrated değil mi yoksa daha büyük fluorescently öğesini protein alımı diğer protein alımı engeller değişebilir . Son olarak, floresan proteinler Reaktif oksijen türleri oluşumu artan ve potansiyel olarak DNA hasarı karışımları indüklenen46,47değiştiren zayıf Sensitizasyonu aracıları olarak hareket edebilir. Bu sakıncaları rağmen floresan proteinler bir dizi farklı avantajlar eğitim DNA mikro-ışınlama ile onarım ve kullanıcılar burada, açıklanan zarar nitelemesi gibi uygun denetimler dahil onlar-ebilmek sağlamak yeni bir bakış açısı sunmak içine yanıt ve protein-protein etkileşimleri3zarar.
Canlı hücre görüntüleme gerekli değilse, ayirt indüklenen zarar yanıtı izlemek için kullanılabilir. Hücreleri belirli zamanlarda sabitleme tarafından hasar indüksiyon ve ile antikor protein ve lezyonlar faiz, hasar indüksiyon statik anlık görüntüleri ve işe alma ve saklama proteinler inşa edilebilir onarım için özel boyama sonrası. Antikorlar, faiz ve/veya translasyonel modifikasyonlar DNA hasarı yanıt tarafından indüklenen birden fazla protein alımı izlemek için kullanılabilir. Ayirt kullanımı floresan protein gereksinimini ortadan kaldırır ve endojen protein davranış incelenmesine izin verir. Ancak, bu yöntem çok sakıncaları vardır. Çok özel antikorlar gereklidir ve permeabilization ve engelleme yordamlar işe alım tespiti için yeterli sinyal yoğunluğu ile izin için optimize edilmiş olması gerekir. Sabitleme yordamlar anlık değildir ve bu fiziksel sınırlama bu yaklaşımın zamansal çözünürlük sınırlar. Hücre boyama sonra yeniden bulunduğu böylece hasar indüksiyon site eşleme önemli sorunlar da mevcut. Hasarlı hücreleri yüksek hassasiyetle taşındı nedenle bu çalışmada kullanılan confocal mikroskop yansıma tabanlı kayıt için yukarıda açıklandığı gibi sağlar. Sahne kayıt veya kabartma coverglass yatırım dahil zaman, yoksa taşındıktan hücreleri hasar indüksiyon ve görüntülü işe alım arasındaki doğal gecikme ile birleştiğinde sahne kayıt olmadan ayirt yapabilir bazı kullanıcılar için itici. Ancak, en doğru ve eksiksiz mikro-ışınlama deneysel tasarımlar bu tür yaklaşımlar paralel floresan proteinler, kullanımı ile sunulan protokolünde açıklandığı gibi dahil edecektir.
Burada, canlı hücre görüntüleme ve ayirt lazer mikro-ile yardımcı programı göstermek için kullanılır. İmmünfloresan boyama doğru bir şekilde oluşturulan DNA hasarı karışımı incelemek için bize izin verir ve bize daha iyi izin her lazer güç tarafından indüklenen protein alımı yorumlamak işe alım ve muhafaza edilmesine XRCC1 GFP gözlenen değişiklikler. Bu sonuçlara dayanarak, 405 nm lazer kullanımı BER ve SSBR proteinlerinin incelenmesi için sınırlı olmalıdır. Ayrıca, en iyi deneysel tasarım amacı, tam hasar karışımı karakterizasyonu için kullanılan her hücre kültürünü ve işe alım doğrulanmasını sonra güç ölçümleri yer alacağını ve saklama fluorescently gözlenen proteinler ile etiketlendi ayirt. Belli ki, ekipman, zaman ve maliyet dikkat edilmesi gereken noktalar bu en iyi deneysel tasarımlar imkansız bazı kullanıcılar için yapabilir. Ancak, bu öğelerin her birini önemini aşağıda gösterildiği ve kullanıcılar bunu göz önünde mikro-ışınlama deneylerin başlangıcında tutmalı.

Floresan mikroskopi hücresel mimarisi görselleştirmek, protein yerelleştirme incelemek ve protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri izlemek için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan mikroskopi küresel DNA ajanlar, ultraviyole (UV) ışık gibi zarar uygulamadan sonra DNA hasarı yanıt çalışmaya iyonizan radyasyon, kimyasal oksitleyici veya etmen ajanlar, ve/veya chemotherapeutics sağlanan kullanarak yeni fikir başlatma, sinyal ve DNA alımı proteinler DNA hasar1,2sitelere onarabilirsiniz. Ancak, bu genel ve zaman uyumsuz olaylar zarar, işe alım emri, dernek veya ayrılma Kinetik hakkında ayrıntılı bilgi verirseniz sınırlı hale gelir ve anahtar DNA onarım proteinler arasındaki ilişkileri aranır. Neyse ki, lazer confocal mikroskoplar tarama gelişmeler, hasar inducing lazer dalga boyu ve floresan proteinler gelişmeler son 25 yılda daha geniş kullanılabilirlik olması koşuluyla araştırmacılar gelişmiş araçlar ile bunlar incelenmesi için DNA yönleri, hedeflenen DNA hasarı indüksiyon onarın.
Işınlama lazer microbeams hücresel ve hücre altı işlevleri çalışma için içeren hücrelerin hücre ve radyasyon Biyoloji3köklü bir araçtır. DNA onarım çalışması için bu teknik uygulama ortaya Cremer ve ortak çalışanlar son derece odaklanmış UV kullanıldığında (257 nm) 0.5 µm Çin hamster Over (CHO) nokta üzerinde DNA hasar ikna etmek için lazer microbeam sistemi hücreleri4 ve indüksiyon kurulan Bu sistem5DNA photolesions. Önemli gelişmeler UV microbeam yöntemleri üzerinde zaman, bu kabulü sisteme zarar sunan kendi özel kurulum ve oluşturmak için onun yetersizlik nedeniyle sınırlı iken (DSBs)6Kişilik strand tatili. Sonraki çeşitli UV-B (290 320 nm) ve UV incelenmesi-UV photoproducts, oksidatif lezyonlar, temel (320-400 nm) dalga boyu grup sayısı tarafından ortaya tek iplikçik keser (SSBs) ve DSBs indüklenen bağlı olarak lazer dalga boyu ve güç4,7,8,9,10 ( 3gözden geçirme) uygulanır. Ama güç için gereken daha fazla, bu UV-B ve UV-A dalga boylarında ajanlar, psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) ve Höchst boya, gibi duyarlılığı ile kombinasyonları da DNA hasar dalga boyu, güç ve maruz kalma süresi üzerinde bağımlı ikna etmek için bulunmuştur Neden hasar genellikle bu ajanlar11,12,13,14,15huzurunda indirdi. Bu yöntemlerin daha geniş kabulü için ele alınması gerekiyor hala teknik engel olmamasına rağmen bu gelişmeler mikro-ışınlama, kullanımı genişletilmiş.
Cremer ve iş önemli ölçüde tam olarak hücredeki son derece lokalize bir alana önemli zarar verici enerji uygulamak için UV microbeam odaklanarak mikro-radyoterapi alan gelişmiş. Gelişmiş confocal mikroskoplar ve lazer mikrodiseksiyon sistemleri gibi sıkıca odaklanmış ışık daha geniş erişilebilir; Ancak, UV kaynakları kapsamları için kaplin ve onlar hala indüklenen renk sapmalarını ile ilgili çoğu kullanıcılar3,6,16önemli zorluklar sundu. UV boya popülerlik 1990'larda, boyunca optik odaklanan yetenekli arttı ve yakalama UV-heyecanlı Floresans daha yaygın olarak kullanılan16oldu ve lazer tarama gelişmeler kullanıcılarına son derece oluşturma yeteneği UV odaklı hücreleri6,17uyarma noktalar. Ancak, bu kadar 2000'lerin DNA kırılmalara ve sensitizers içinde olmayan indüklenen gösteren çok sayıda rapor ortaya çıktı ne zaman gerçek etkisi ile daha yüksek yoğunluklu lazerler sıkıca odaklanmış ışınlar bu birleşimi, hissettim değil UV-A aralığı6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26ve artık görünür dalga boylarında 488 nm27gibi bile. Bu gelişmeler daha yaygın ticari sistemleri bir dizi mikro-ışınlama tekniğine kabulü için izin. Bu gelişmelere paralel olarak, İki fotonlu teknikleri de DNA hasarı kesin indüksiyon izin ortaya çıktı; Bu gelişmeler burada tartışılan değil rağmen bu metodolojileri9,28,29,30tartışırken inceleme makaleler vardır.
Confocal mikroskoplar çok odaklı UV ışık ve floresan proteinlerin DNA onarım proteinlerin gerçek zamanlı izleme izin vermek için yaygın kullanılabilirlik sunma yeteneğine sahip geçerli erişilebilirlik ile mikro-ışınlama teknikleri içine geliştiğini DNA hasarı yanıt ve onarım yolları incelenmesi için güçlü araçlar. Ancak, kullanıcılar DNA hasarı nesil lazer dalga boyu ve alt nükleer bölgesine uygulanan güç son derece bağımlı olduğunu unutmayın gerekir. UV-C kullanımı (~ 260 nm) dalga boyu doğrudan DNA uyarma ve yüksek seçicilik UV photoproducts7,8indüksiyon için izin verir. UV-B ve UV-A dalga boylarında DNA hasar (temel lezyon, SSBs ve DSBs) karışımları üretmek,7uygulamalı güç ve hücresel arka plan bağımlı için kullanılmaktadır. Endojen dezenfeksiyon ve anti-oksidan düzeyleri hedef hücrelerde bu boyları tarafından üretilen DNA hasarı karışımları etkisi altına alabiliyor. Ayrıca, eksojen dezenfeksiyon (BrdU, vb) kullanımı DNA hasarı indüksiyon için gerekli enerji düşürerek yardımcı olabilir. Ancak, bu ajanların kendileri tarafından DNA hasar neden olabilir ve bunların kullanımı kullanıcı tarafından dikkat edilmesi gereken istenmeyen etkiler üretmek onlar hücre döngüsü ve Kromatin yapısı, değiştirmek. Bu nedenle, mikro-ışınlama DNA hasarı yanıt ve onarım çalışması için kullanılmadan önce dikkatli bir değerlendirme DNA onarım yolun faiz, dalga boylarında kullanıma hazır ve oluşturulan DNA hasarı karışımı gereklidir.
Burada, iki yaygın olarak kullanılan dalgaboyu, 355 lazer mikro-ile gerçekleştirilir nm ve 405 nm, bu dalga boyu ve bu hasar karışımları var tamiri inceleyerek üzerinde etkileri tarafından indüklenen DNA hasarı karışımları göstermek için sensitizers olmadanSSBs ve DSBs. kullanıcılar bu dalga boylarında kırılmalara veya temel lezyonlar tek bir tür oluşturmak değil bilmeniz gerekir. DNA onarım yolları arasında ayırımcılık için kullanıcılar gerekir dikkatli bir şekilde uygulanan güç çekirdeği belirli bir bölge üzerinde kontrol ve birden çok strand sonu işaretçileri ve DNA lezyon antikorları kullanarak indüklenen zarar karakterize. Doğru uygulanmış ve karakterize lazer mikro-ile bazı türler DNA hasar onarım temel lezyonlar ve SSBs veya DSBs, bazı özgüllük ile değerlendirmek Vikimapya, zenginleştirebilirsiniz. Bu nedenle, biz bırakmak kullanıcı tekrarlanarak lazer mikro-ile gerçekleştirmek, tarafından uygulanan lazer doz indüklenen DNA hasarı karışımları karakterize ve veri analizi gerçekleştirmek bir yöntem sağladı.

<table><tbody><tr><td>Nikon A1rsi lazer tarama konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements yazılımı</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm lazer</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>Radyasyon kaynağı</td></tr><tr><td>Galvanometre fotoaktivasyon mini tarayıcı</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slayt fotodiyot güç sensörü</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>Fiber fotodiyot güç sensörü</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>Dijital el tipi optik güç ve enerji ölçer</td><td>THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS'den</td></tr><tr><td>Minimal esansiyel medya</td><td>Hyclone</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Atlanta biyolojikleri</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus transfeksiyon</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4 odacıklı kapak camı</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8 odacıklı kapak camı</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-histon H2AX&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>Anti siklobütan pirimidin dimer</td><td>Cosmo Bio klonu</td><td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti 8-okso-2 ve akut; -deoksiguanozin ve nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 keçi anti-fare</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 keçi anti-tavşan</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>Dikkat toksik!</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>%37 Formaldehit</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>Dikkat toksik!</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>Dikkat toksik!</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Dikkat toksik!</td></tr><tr><td>Tris Hidroklorür</td><td>Amresco</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift strand break onarım memeli hücrelerinde

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Son derece koordineli DNA onarım yolları tespit etmek, tüketim ve hasarlı DNA üsleri yerine ve DNA kırılmalara tamiri koordine adlı biri yok. Moleküler Biyoloji teknikleri yapısı, enzimatik işlevleri ve Kinetik onarım proteinlerin açıklık var iken, hala nasıl onarım çekirdeği içinde koordineli olduğunu anlamak için bir gerek yoktur. Lazer mikro-ile DNA hasar inducing ve onarım protein alımı izleme için güçlü bir araç sunar. İndüksiyon DNA hasar tarafından lazer mikro-ile dalga boylarında bir dizi ortaya çıkabilir ve kullanıcıların güvenilir tek kırılmalara, temel lezyonlar ve çift doz aralığı ile kırılmalara neden olabilir. Burada, lazer mikro-ile tek ve iki ortak confocal lazer dalgaboyu 355 tarafından indüklenen çift kırılmalara tamir incelemek için kullanılır nm ve 405 nm. Belirli hasar karışımları inducing için uygulanan lazer doz daha fazla, doğru karakterizasyonu açıklanan, kullanıcılar tekrarlanarak lazer mikro-ışınlama veri toplama ve analizi gerçekleştirebilirsiniz.

İndüklenen DNA hasarı karakterizasyonu Temel lezyonlar ve kırılmalara indüksiyon seçili nükleer bölgesine uygulanan lazer doz bağımlı ve hücre modeli hücresel microenvironment7kullanılır. Floresan proteinler erimiş gibi XRCC1, 53BP1, Ku70 veya Rad51 protein onarmak için sağlamak yararlı tek ve Çift Kişilik strand bir hasar ROI yukarıdaki içinde floresan bir protein birikimi görmek için gereken en az enerji oluşturmak için sonu işaretçileri arka plan Floresans9,19,31. Bir yanıt neden koşulları bulunca, o belirli dalga boyu ve doz tarafından indüklenen zarar karışımı ayırdetmek önemlidir. Zayıflama doz ve süre sonunda kullanılan dalga boyu karmaşık hasar karışımları oluşumunu en aza indirmek kullanıcı izin verebilirsiniz. UV-A aralığı düşük lazer dozlarda ağırlıklı olarak SSBs ve temel lezyonlar, SSBR ve BER yolları10,28eğitim için uygun küçük bir miktarda üretmek için gösterilmiştir. Dozu artan daha karmaşık temel lezyonlar, oksidatif oluşturur ve UV indüklenen ve daha fazla sayıda DSBs7,10neden olmaktadır. İndüksiyon DNA hasar tek bir türün belirli DNA onarım yolları incelenmesi için arzu edilir iken, kullanıcıların temel lezyonlar veya DSBs çok daha sık olmak SSBs gibi belirli bir lezyon ile DNA lezyonlar karışımı inducing daha yüksektir. Hidrojen peroksit (H2O2) ya da metil methanesulfonate (MMS)32gibi kimyasal maddeler tarafından indüklenen DNA hasarı karışımları benzer. Kullanıcılar karışımları zarar sonuçları ortaya çıkabilir ve doz ve lezyonlar indüklenen zarar sitesinde dikkatli karakterizasyonu tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir onların sonuçları sağlamak gerekli bildirdiğimde bilmeniz gerekir.
Mikro-ışınlama çalışmalarda XRCC1 GFP genellikle temel lezyonlar ve SSBs9,28indüksiyon bir marker kullanılır. XRCC1 SSB onarım (SSBR) önemli bir rol oynadığı bir iskele protein ve temel eksizyon (BER) onarmak ve nükleotid eksizyon tamir (NER)33,34,35 gibi diğer onarım yolları da katılmaktadır . DNA tamiri, anahtar protein poly(ADP-ribose) polimeraz 1 (PARP-1), DNA polimeraz β dahil olmak üzere, bir dizi ile etkileşim içinde önemli bir denetleyici rol oynar (Pol β) ve DNA ligaz III. Biz XRCC1-stabil CHO-K1 hücrelerde ifade SSBs ve DSBs oluşturmak için gerek duyulan lazer dozlarda belirlemek için GFP kullanılmaktadır. Biz ilk kez XRCC1 GFP gözlemlenebilir bir işe her dalga boyu (şekil 1) için ikna etmek için gerekli en düşük doz tespit. 355 nm dalga boyları için 2 s yaşamak zamanla tanımlanmış hasar ROI (şekil 1A) arka plan üzerinde tespit DNA hasarı indüksiyon gösteren ki ROI içinde artan bir floresan sinyal oluşturulan. İçin 405 nm, bir 8 fps tarama hızı gözlemlenebilir bir işe alım için yatırım Getirisi (şekil 1A) hasar oluşturmak için ihtiyaç vardı. Doz daha sonra arttı (10 s 355 nm ve 0.5 fps için 405 nm) daha yoğun oluşturmak için ROI (şekil 1A) zarar.
İşe Alım ve muhafaza edilmesine XRCC1-GFP indüklenen zarar yerinde sonra timelapse görüntüleme tarafından izlenen. Ayrılma indüklenen zarar sitesinden proteinin kez BER veya SSBR tamamlanması için bir işaret olarak kabul edilir iken bir protein DNA hasarı yerinde tutma devam DNA tamiri, gösterebilir. Ancak, lazer kaynaklı DNA hasarı sitelerden XRCC1 ayrılma onarım tamamlanması ile bağlama hiçbir açık delil oldu. Siteye zarar protein alımı üzerinde tüm çekirdek (şekil 1B) ölçülen ortalama floresan sinyal floresan sinyal bozuk ROI içinde ortalama yoğunluğu bildirerek ölçülür. Diğer normalleştirme teknikleri ilgi protein hücresel dağıtım bağlı olarak istihdam edilebilir olsa da bu tür normalleştirme adresi şiddeti dalgalanmalar nükleer sinyal içinde yardımcı olur. Burada, böylece zarar yatırım Getirisi için sinyal yeniden dağıtılması normalleştirme nükleer alanına ölçer XRCC1 nükleer kompartımanda yerelleştirilmiştir. Yatırım Getirisi ortalama floresan yoğunluğu sonra ön hasar görüntü de dahil olmak üzere ve zaman (şekil 1C) bir fonksiyonu grafiği çizilecek timelapse her resim için kaydedilir.
O zaman DNA baz lezyonlar oluşumunu incelemek için iki seçili lazer doz tarafından indüklenen zarar daha fazla karakterize. İlk olarak, CPD, UV kaynaklı bir hantal lezyon oluşumu NER türü lezyonlar (Şekil 2A) için bir işaretleyici olarak ayirt tarafından probed. Sonra oxidatively indüklenen temel lesion8 oxodG BER türü lezyonlar (Şekil 2B) için bir işaretleyici olarak probed. Her iki dalga boylarında düşük doz pozda CPD lezyonlar önemli hiçbir artış gözlendi (2 s 355 nm ve 405 için 8 fps için nm), yüksek doz ise her iki dalga boyu tedavi (10 s 355 nm ve 405 için 0.5 fps için nm) floresan içinde önemli bir artış gösterdi hasar ROI (Şekil 2A) içinde gözlenen sinyal. Bir dağılım çizim CPD Roi hasar oluşumu ve algılama dalga boylarında ve CPD lezyonlar düşük düzeyde düşük dozlarda mevcut olabilir, ama yük önemli ölçüde olmayabilir gösteren doz, her bozuk hücre gösterir heterojenite için yoğunluk demek daha yüksek bir doz uygulanana kadar algıladı. Scatterplot da hasar karışımları doğru miktar sınırlayabilir antikor saptama bu verimsizlik önerir.
Bu daha fazla işaret 8-oxodG tarafından oxidatively indüklenen DNA lezyonlar algılama içinde vurgulanır. Floresan sinyal zarar içinde hiçbir net artış yatırım Getirisi için 8-oxodG dalga boyunda veya kullanılan doz (Şekil 2B) gözlenmiştir. Bu iş için kullanılan antikor önceki yayınları9,10,36ile tutarlıdır; Ancak, bu sınırlamalar içinde 8-oxodG antikorlar37,38ile oluşumu gözlem olabilir unutulmamalıdır. Onay oxidatively indüklenen lezyonlar eksikliği aynı zamanda 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzim DNA10' dan sorumlu 8-oxodG kaldırılması için işe alım gibi ikinci bir işaret tarafından tavsiye edilmektedir. Biz DNA hasarı sitemize OGG1 işe alım gözlemleme; Ancak, oxidatively indüklenen DNA hasar seviyesinin düşük oluşumu tamamen kullanılabileceği belirlenmemiştir.
Son olarak, iki işaretleri, γH2AX ve 53BP-1, selecte kullanarak DSBs oluşumu muayened lazer dozlarda ayirt tarafından (şekil 3 &#38; 4). ΓH2AX yaygın bir iplikçik sonu işareti olarak kullanılır, ancak DSBs için onun özgüllüğü sayısı raporları39,40sorguladı. Ayrıca, bir iplikçik Break sinyal lokalizasyonu nedeniyle bu sinyal yayma sınırlı olabilir bu yüzden strand sonu sitesinden yayar bir fosforilasyon olaydır. Bu nedenle, γH2AX 53BP-1 ile birleştirerek DSB formasyonu içerisinde hasar yatırım Getirisi daha doğru değerlendirilmesi için sağlar.
ΓH2AX ve 53BP-1 mikro-ışınlama için dalga boyu ve doz bağımlı yanıttır. Düşük doz (2 s) uyarımı de 355 nm 5 ve 20 dk ve her iki işaretleyiciyi de bir zayıf ve değişken yanıt 10 dk sonrası radyoterapi (şekil 3A) yanıt aydınlığa çıkartıyor. Yüksek doz (10 s) 355 nm mikro-ışınlama zarar yatırım Getirisi 5, 10 ve 40 dk (şekil 3B) azalır 20 dk sonrası radyoterapi içinde artan bir floresan sinyal neden oluyor. Bu sonuçlar bu dikkatli 355 nm doz titrasyon gerekli çapraz-onarım yolları, uyarılması en aza indirmek için çift strand sonu işaretçisi γH2AX erken zaman noktalarda azaltılmış tespiti tarafından gösterildiği gibi gösterir (&#60; 20 dk), düşük doz uygulanan.
Yüksek doz (0.5 fps) 405 nm lazer stimülasyon (şekil 4) ve düşük (8 fps) kullanarak benzer deneyler yapıldı. Bu dalga boyu 53BP-1 ve bu doz neredeyse tek ve Çift Kişilik kırılmalara karmaşık bir karışımı oluşturmak gösteren uygulanan doz ne olursa olsun γH2AX için önemli hasar ROI içinde floresan yoğunluğu birikimi gözlenmiştir hemen sonra indüksiyon DNA hasar (şekil 4). Ayrıca, 405 nm Haritayı pan-nükleer γH2AX hasar indüksiyon (şekil 4B, alt) 10 dk içinde boyama bir artış yüksek dozda bu yatırım Getirisi hasar tespiti için rapor, 53BP-1 birikimi ise daha zorlaştırır hasar ROI içinde yer.
Bu sonuçlar açıkça 405 nm mikro-ışınlama SSBR veya BER izlenmesi için uygun değildir ve DNA'ın birden çok işaretleri adducts ve sonları strand indüklenen lezyonlar ve DNA onarım yanıt-e doğru tam olarak karakterize etmek için istihdam edilmelidir gösteriyor.
İşe Alım ve muhafaza edilmesine XRCC1 GFP doz bağımlı değişiklik Bir kez indüklenen DNA hasarı ile karakterize, lazer mikro-ile DNA onarım proteinler dinamikleri eğitim için ideal bir platform olabilir. XRCC1 GFP tutma ve ayrılma Kinetik tarafından her dalga boyu farklı hasar karışımları indüksiyon verilen beklenmedik değildir doz bağımlılık (şekil 1) gösterir. En yüksek ışınlama doz (10 s ve 0.5 fps) XRCC1-GFP daha düşük dozlarda göre daha yüksek bir yoğunluk alımı ve hasar yerinde XRCC1 GFP uzun tutma 20 dk zaman boyunca (şekil 1C) gösterir. Bu görünüm ve saklama DSB işaretleri, γH2AX ve 53BP-1 ile tutarlıdır deneme seyri sırasında çözülemeyen 355 ve 405 nm için yüksek dozda oluşturulan DNA hasarı olasılığı olduğunu gösterir (şekil 3 &#38; 4 ).
İlginçtir, daha düşük hasar dozlarda (2 s ve 8 fps) XRCC1-GFP hasar sitelere hızlı alımı ve XRCC1 GFP ayrılma öncesi ışınlama düzeyleri (şekil 1C) deneysel saat boyunca gösterir. Hasar karışımı tam karakterizasyonu, bu SSBs ve temel lezyonlar tamamen bu zararlı koşullar kullanarak çözülebilecek olan bu sonuca neden olabilir. Ancak, γH2AX ve 53BP-1 40 dk için 355 nm ve 5 min için 405 nm farklı yorumlara neden olabilir. 355 nm 2 s doz için 40 dk DSB işaretleri görünümünü Düzeltilmemiş bazı lezyonlar DSBs için lider veya bu enerji tarafından oluşturulan DSBs daha uzun bir zaman ölçeği üzerinde onarılır gösteriyor olabilir bu yüzden hasar karışımı SSBs, ağırlıklı olarak olabilir. Zaman ölçeği farklılıklar arasında SSBR ve DSB onarım daha önce raporlanmış28,41,42olmuştur. Benzer şekilde, 405 nm düşük doz (8 fps) ayrılma SSBs düşük düzeyde gösterebilir veya bir hızla DSBs için dönüştürülür SSBs, hangi kaydetti için yüksek kümeleme ajanlar zararlı mikro-ışınlama ve diğer DNA hasar daha önce43, 44 , 45.
Birlikte bu sonuçlar indüklenen zarar karışımları karakterize önemini vurgulamak ve kullanan birden çok DNA onarım proteinler ve işe alma ve saklama DNA'ın yorumlamak için işaretleri proteinler sitelerde indüklenen zarar onarım.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Resim 1 . Lazer mikro-ile XRCC1 GFP alımı neden olmaktadır.  (A) CHO-K1 hücreleri stabil XRCC1 GFP ifade ışınlanmış ve önce ve hemen sonra hasar indüksiyon görüntüsü. Oklar, mikro-ışınlama doz konumunu gösterir ve ölçek çubuğu var. 10 µm (B) işe alım ortalama floresan yoğunluğu içinde hasar ROI belirlenmesi ve tüm çekirdeği floresan ortalama yoğunluğu normalleştirme tarafından ölçülür. (C) işe alım dinamiklerini her timelapse görüntü için ölçülebilir. Grafikler ile SEM temsil eden hata çubukları iki bağımsız deneyler temsilcisi vardır (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Resim 2 . Lazer mikro-ile nükleotit hasar neden olmaktadır.  CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama lazer tabi ve hemen sonra hasar indüksiyon sabit. Ayirt CPD algılamak için gerçekleştirilmiş ve 8-oxodG adducts. (A) top, dağılım çizim yoğunluklarda gözlenen yatırım Getirisi ortalama Floresans in CPD boyama sonra hücreler zarar görmüş. Alt, CPD boyama temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek bar 10 µm (n = 12). (B) 8-oxodG boyama için temsilcisi görüntüler. Oklarmikro-ışınlama konumunu belirtmek ve ölçek çubuğu 10 µm. mı <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Şekil 3 . DNA Çift Kişilik strand sonu işaretçileri 355 nm mikro-ışınlama için bir doz bağımlı şekilde yanıt.  CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama için tabi ve zaman Puan belirtilen sonrası uyarımı de sabit. Ayirt DSB işaretleri γH2AX ve 53BP-1 için gerçekleştirildi. (A) YG demek ölçülen Floresans yoğunluklarda hasarsız ve hasarlı hücreleri için normalleştirilmiş hasar Çizim dağılım. Hata çubukları çoğu SEM temsilcisi (n = 12). (B) γH2AX ve 53BP-1 boyama için temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek çubuğu 10 µm. mı <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Şekil 4. DNA Çift Kişilik strand sonu işaretçileri sağlam 405 nm mikro-ışınlama için yanıt. CHO-K1 hücreleri mikro-ışınlama için tabi ve zaman Puan belirtilen yazı uyarımı de sabit. Ayirt DSB işaretleri γH2AX ve 53BP-1. (A) YG demek ölçülen Floresans yoğunluklarda hasarsız ve hasarlı hücreleri için normalleştirilmiş hasar Çizim dağılım. Hata çubukları çoğu SEM temsilcisi (n = 12). (B) γH2AX ve 53BP-1 boyama için temsilcisi görüntüler. Oklar, mikro-ışınlama konumunu gösterir ve ölçek çubuğu 10 µm. mı <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Bu prosedürün genel amacı, bir konfokal floresan mikroskobu lazeri kullanarak bir hücrenin çekirdek altı bölgesinde DNA hasarı oluşturmaktır. Bu yöntem, proteinlerin DNA hasarı bölgelerine nasıl toplandığı ve orada nasıl tutunduğu gibi DNA onarımına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen proteinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanımasıdır; böylece proteinlerin toplanma ve tutunma profili oluşturulabilir.Bu prosedüre, ilgilenilen hücreleri içeren bölmeli bir lamı, 37 °C ve %5 karbondioksit seviyesinde tutulan bir sahne üstü inkübatöre yerleştirerek başlayın. Kodlanmış otomatik bir mikroskop tablası kullanarak görüntü alanlarını kaydedin. Kuyucuklar arasındaki bariyer gibi kültür kabının tanınabilir bir özelliğini seçin.Bir görüntü alın ve X-Y konumunu kaydedin. Bu, numune hazırlığının ardından seçilen alanların X-Y konumlarının hizalanmasını ve kaydedilmesini sağlayacaktır. Görüntü kaydı tamamlandıktan sonra, mikro-ışınlama için bir alan seçin ve numuneyi odaklayın.Floresan işaretli proteinler eksprese eden hücreler için, ilgili floresan kanalında maksimum nükleer kesitin olduğu odak düzlemini seçin. Çekirdeğin maksimum kesitine odaklanmak kritik öneme sahiptir; çünkü bu, proteinin indüklenen hasar bölgesine yerleşimini izlemek için odak noktasının çekirdeğe merkezlenmesini sağlar. Çekirdekçik gibi çekirdek içindeki net bir özelliği seçin ve görünümdeki bu değişimi gözlemlerken odak düzlemini yukarı ve aşağı hareket ettirin.Gerçek odak düzlemi, aydınlıktan karanlığa geçiş aşamasında yer alacaktır. Örneği odaklamak için, seçilen özelliğin en keskin kontrasta sahip olduğu odak düzlemini seçin. Bir sonraki adım, ilgilenilen alanın konumunu kaydetmektir.Mikroskop yazılımı içerisinde üç çarpı üç piksellik kare bir ilgi alanı (ROI) oluşturun. Bu ROI'yi, hasar verilecek bir hücrenin çekirdeği üzerine yerleştirin ve bu ROI'yi hasarlı ROI olarak ayarlayın. Hasar ROI'sinin konumunu da içeren bir hasar öncesi görüntü toplayın.İlgilenilen protein için floresan kanalında aydınlık alan içeren bir görüntü elde edin. Hücreler artık lazer mikro-irradiyasyonu için hazırdır. Bu gösterim için 405 nanometre lazer %100 güçte kullanılacaktır.405 nanometre lazer dozu, tarama hızı modüle edilerek ve seçilen hasar ROI'sinin bir kez taranmasıyla kontrol edilir. Bu deneyde, 405 nanometrede mikro-irradiyasyon için saniyede sekiz ve 0,5 kare kullanın. Hücrelere hasar vermek için uygun lazer gücünün seçilmesi, farklı DNA onarım yolaklarını birbirinden ayırmak için kritiktir.Hasar sonrası parlak alan ve floresan kanallarının zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme işlemini gerçekleştirin. Veri toplamayı optimize etmek için zaman ayarlı görüntülemenin süresini ve sıklığını ayarlayarak, floresan proteinin hasarlı ROI bölgesinde birikimini ve deney süreci boyunca buradaki ayrışmasını ideal şekilde yakalayın. Zaman serisi tamamlandıktan sonra, hasar vermek için yeni bir hücre alanı seçin ve istenen hasarlı hücre sayısına ulaşana kadar mikro-ışınlama ve zaman ayarlı görüntüleme işlemlerine devam edin.Seçilen koşul başına 10 ila 25 hücre önerilir. İmmünofloresans analizi için toplam hücre sayısını artırmak amacıyla, hasar sonrası yanıtın çok alanlı bir zaman serisini oluşturmak için kültür kabı içindeki ek alanlara hasar verin. Her alanın X-Y konumunu ve hasarın meydana geldiği zamanı kaydedin.Hücreler, hasardan hemen sonra fikse edilebilir veya fiksasyondan önce seçilen zaman aralıklarında onarılmaları sağlanabilir. Bu analize başlamak için, elde edilen görüntüleri NIS-Elements gibi bir görüntü analiz uygulamasıyla açın. Ölçülecek her hücre için önce çekirdeği temsil eden bir referans ROI oluşturun.Çekirdeği oluşturan pikselleri içeren floresan sinyaline bir eşikleme algoritması uygulayın ve ardından bu alanı bir ROI'ye dönüştürün. Sonra, altı çarpı altı piksellik bir ROI oluşturun ve bunu hasar ROI'sinin üzerine yerleştirin. Bu daha büyük ROI, artık analiz için hasar ROI'sidir.Ölçülecek her hücre için referans ve hasar ROI'lerinin ortalama floresans yoğunluğunu kaydedin. Zaman serisinin her karesi için, nükleer alanın ROI tarafından doğru şekilde kapsandığından emin olmak üzere referans ROI'yi ayarlayın ve hasarlı bölgenin kapsandığından emin olmak için hasar ROI'yi ayarlayın. Zaman serisinin her karesi için her bir ROI içindeki floresan sinyalinin ortalama floresans yoğunluğunu kaydedin.Her bir hücre için, zaman atlamalı görüntünün her karesinde, hasarlı bölge (ROI) ortalama floresan yoğunluğunu karşılık gelen referans ROI'ye normalize edin. Burada, ortalama nükleer floresan yoğunluğu referans ROI olarak kullanılır ve normalizasyon, ortalama referans ROI floresan yoğunluğunun ortalama hasarlı ROI floresan yoğunluğundan çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Normalizasyon işlemini tüm hasarlı hücrelerin yanı sıra en az iki hasarsız kontrol hücresi için tekrarlayın.Son olarak, deneysel işlemin bir fonksiyonu olarak işe alım dinamiklerindeki değişiklikleri göstermek için normalize edilmiş yoğunluk değerlerini zamana karşı grafiğe dökün. XRCC1-GFP'yi stabil olarak eksprese eden hücreler, hasar indüksiyonundan önce ve sonra ışınlanmış ve görüntülenmiştir. XRCC1-GFP'nin hasar ROI'sine işe alımı gözlemlenmiş ve işe alım dinamikleri ölçülmüştür.Çift zincir kırılmalarının oluşumu iki belirteç kullanılarak incelenmiştir. Her iki belirteç için, 355 nanometredeki iki adet ikinci düşük dozlu stimülasyon, ışınlamadan sonraki beşinci ve 20. dakikalarda herhangi bir yanıt oluşturmamış; onuncu dakikada ise zayıf ve değişken bir yanıt oluşturmuştur. 355 nanometredeki 10 saniyelik yüksek dozlu mikro-ışınlama, hasarlı ROI içinde ışınlamadan sonraki beşinci, 10. ve 20. dakikalarda artmış bir floresan sinyal tetiklemiş ve bu sinyal 40. dakikada azalmıştır.Bu sonuçlar, DNA çift zincir kırılması belirteçlerinin 355 nanometre mikro-irradiasyona doz bağımlı bir şekilde yanıt verdiğini göstermektedir. Buna karşın, 405 nanometre lazer stimülasyonu, uygulanan dozdan bağımsız olarak, hasar ROI'si içerisinde her iki belirtecin de anlamlı düzeyde birikmesiyle sonuçlanmıştır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 10 hücre için yaklaşık dört saatte tamamlanabilir.Bu teknik uygulanırken, lazer dalga boyunun ve uygulanan gücün izlenen onarım sürecine göre ayarlanması önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek proteinlerin katılımı veya fosforilasyon durumundaki değişiklikler ya da diğer post-translasyonel modifikasyonlarla ilgili soruları yanıtlamak için immünofloresan uygulanabilir. Bu teknik, araştırmacıların DNA onarım proteinlerinin dinamik katılımını keşfetmelerine ve protein domenleri ile mutasyonların, DNA hasarının tanınmasını ve buna verilen yanıtı nasıl etkilediğini daha iyi belirlemelerine olanak tanır.Bu videoyu izledikten sonra, DNA hasarı oluşturmak ve DNA onarım proteinlerinin hücreye çekilmesini izlemek için lazer taramalı konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Lazerlerle ve formaldehit gibi kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

application-laser-micro-irradiation-for-examination-single-double

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Bu protokol, lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteini alımını ölçmek gibi aşağı akış mikroskopi çalışmaları için S faz hücrelerini verimli bir şekilde tanımlamak için invaziv olmayan bir yöntemi açıklar.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Endonezya 'da, radyoizotop Tracer ve izosulfan veya patent mavi boya (PBD) sağlamak için kısıtlama nedeniyle Sentinel düğüm biyopsisi (SNB) meme kanseri cerrahisi için rutin olarak yapılmaz. Bu engeli aşmak için Sentinel nodları (SNs) eşlemek için tek bir ajan olarak% 1 metilen mavi boya (MBD) uygulandımız.

Meme kanseri Sentinel düğüm biyopsi tek bir tekniği olarak 1% metilen mavi boya uygulaması

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Öğrenin lazer mikro-ışınlama ile DNA hasarı indüksiyonu ve onarım proteinlerinin gerçek zamanlı gözlemlenmesi yöntemini. Bu teknik memeli hücrelerinde çift sarmalık kırık onarım mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Daha fazla video keşfet