Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Bu prosedürün genel amacı, bir konfokal floresan mikroskobu lazeri kullanarak bir hücrenin çekirdek altı bölgesinde DNA hasarı oluşturmaktır. Bu yöntem, proteinlerin DNA hasarı bölgelerine nasıl toplandığı ve orada nasıl tutunduğu gibi DNA onarımına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen proteinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanımasıdır; böylece proteinlerin toplanma ve tutunma profili oluşturulabilir.

Bu prosedüre, ilgilenilen hücreleri içeren bölmeli bir lamı, 37 °C ve %5 karbondioksit seviyesinde tutulan bir sahne üstü inkübatöre yerleştirerek başlayın. Kodlanmış otomatik bir mikroskop tablası kullanarak görüntü alanlarını kaydedin. Kuyucuklar arasındaki bariyer gibi kültür kabının tanınabilir bir özelliğini seçin.

Bir görüntü alın ve X-Y konumunu kaydedin. Bu, numune hazırlığının ardından seçilen alanların X-Y konumlarının hizalanmasını ve kaydedilmesini sağlayacaktır. Görüntü kaydı tamamlandıktan sonra, mikro-ışınlama için bir alan seçin ve numuneyi odaklayın.

Floresan işaretli proteinler eksprese eden hücreler için, ilgili floresan kanalında maksimum nükleer kesitin olduğu odak düzlemini seçin. Çekirdeğin maksimum kesitine odaklanmak kritik öneme sahiptir; çünkü bu, proteinin indüklenen hasar bölgesine yerleşimini izlemek için odak noktasının çekirdeğe merkezlenmesini sağlar. Çekirdekçik gibi çekirdek içindeki net bir özelliği seçin ve görünümdeki bu değişimi gözlemlerken odak düzlemini yukarı ve aşağı hareket ettirin.

Gerçek odak düzlemi, aydınlıktan karanlığa geçiş aşamasında yer alacaktır. Örneği odaklamak için, seçilen özelliğin en keskin kontrasta sahip olduğu odak düzlemini seçin. Bir sonraki adım, ilgilenilen alanın konumunu kaydetmektir.

Mikroskop yazılımı içerisinde üç çarpı üç piksellik kare bir ilgi alanı (ROI) oluşturun. Bu ROI'yi, hasar verilecek bir hücrenin çekirdeği üzerine yerleştirin ve bu ROI'yi hasarlı ROI olarak ayarlayın. Hasar ROI'sinin konumunu da içeren bir hasar öncesi görüntü toplayın.

İlgilenilen protein için floresan kanalında aydınlık alan içeren bir görüntü elde edin. Hücreler artık lazer mikro-irradiyasyonu için hazırdır. Bu gösterim için 405 nanometre lazer %100 güçte kullanılacaktır.

405 nanometre lazer dozu, tarama hızı modüle edilerek ve seçilen hasar ROI'sinin bir kez taranmasıyla kontrol edilir. Bu deneyde, 405 nanometrede mikro-irradiyasyon için saniyede sekiz ve 0,5 kare kullanın. Hücrelere hasar vermek için uygun lazer gücünün seçilmesi, farklı DNA onarım yolaklarını birbirinden ayırmak için kritiktir.

Hasar sonrası parlak alan ve floresan kanallarının zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme işlemini gerçekleştirin. Veri toplamayı optimize etmek için zaman ayarlı görüntülemenin süresini ve sıklığını ayarlayarak, floresan proteinin hasarlı ROI bölgesinde birikimini ve deney süreci boyunca buradaki ayrışmasını ideal şekilde yakalayın. Zaman serisi tamamlandıktan sonra, hasar vermek için yeni bir hücre alanı seçin ve istenen hasarlı hücre sayısına ulaşana kadar mikro-ışınlama ve zaman ayarlı görüntüleme işlemlerine devam edin.

Seçilen koşul başına 10 ila 25 hücre önerilir. İmmünofloresans analizi için toplam hücre sayısını artırmak amacıyla, hasar sonrası yanıtın çok alanlı bir zaman serisini oluşturmak için kültür kabı içindeki ek alanlara hasar verin. Her alanın X-Y konumunu ve hasarın meydana geldiği zamanı kaydedin.

Hücreler, hasardan hemen sonra fikse edilebilir veya fiksasyondan önce seçilen zaman aralıklarında onarılmaları sağlanabilir. Bu analize başlamak için, elde edilen görüntüleri NIS-Elements gibi bir görüntü analiz uygulamasıyla açın. Ölçülecek her hücre için önce çekirdeği temsil eden bir referans ROI oluşturun.

Çekirdeği oluşturan pikselleri içeren floresan sinyaline bir eşikleme algoritması uygulayın ve ardından bu alanı bir ROI'ye dönüştürün. Sonra, altı çarpı altı piksellik bir ROI oluşturun ve bunu hasar ROI'sinin üzerine yerleştirin. Bu daha büyük ROI, artık analiz için hasar ROI'sidir.

Ölçülecek her hücre için referans ve hasar ROI'lerinin ortalama floresans yoğunluğunu kaydedin. Zaman serisinin her karesi için, nükleer alanın ROI tarafından doğru şekilde kapsandığından emin olmak üzere referans ROI'yi ayarlayın ve hasarlı bölgenin kapsandığından emin olmak için hasar ROI'yi ayarlayın. Zaman serisinin her karesi için her bir ROI içindeki floresan sinyalinin ortalama floresans yoğunluğunu kaydedin.

Her bir hücre için, zaman atlamalı görüntünün her karesinde, hasarlı bölge (ROI) ortalama floresan yoğunluğunu karşılık gelen referans ROI'ye normalize edin. Burada, ortalama nükleer floresan yoğunluğu referans ROI olarak kullanılır ve normalizasyon, ortalama referans ROI floresan yoğunluğunun ortalama hasarlı ROI floresan yoğunluğundan çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Normalizasyon işlemini tüm hasarlı hücrelerin yanı sıra en az iki hasarsız kontrol hücresi için tekrarlayın.

Son olarak, deneysel işlemin bir fonksiyonu olarak işe alım dinamiklerindeki değişiklikleri göstermek için normalize edilmiş yoğunluk değerlerini zamana karşı grafiğe dökün. XRCC1-GFP'yi stabil olarak eksprese eden hücreler, hasar indüksiyonundan önce ve sonra ışınlanmış ve görüntülenmiştir. XRCC1-GFP'nin hasar ROI'sine işe alımı gözlemlenmiş ve işe alım dinamikleri ölçülmüştür.

Çift zincir kırılmalarının oluşumu iki belirteç kullanılarak incelenmiştir. Her iki belirteç için, 355 nanometredeki iki adet ikinci düşük dozlu stimülasyon, ışınlamadan sonraki beşinci ve 20. dakikalarda herhangi bir yanıt oluşturmamış; onuncu dakikada ise zayıf ve değişken bir yanıt oluşturmuştur. 355 nanometredeki 10 saniyelik yüksek dozlu mikro-ışınlama, hasarlı ROI içinde ışınlamadan sonraki beşinci, 10. ve 20. dakikalarda artmış bir floresan sinyal tetiklemiş ve bu sinyal 40. dakikada azalmıştır.

Bu sonuçlar, DNA çift zincir kırılması belirteçlerinin 355 nanometre mikro-irradiasyona doz bağımlı bir şekilde yanıt verdiğini göstermektedir. Buna karşın, 405 nanometre lazer stimülasyonu, uygulanan dozdan bağımsız olarak, hasar ROI'si içerisinde her iki belirtecin de anlamlı düzeyde birikmesiyle sonuçlanmıştır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 10 hücre için yaklaşık dört saatte tamamlanabilir.

Bu teknik uygulanırken, lazer dalga boyunun ve uygulanan gücün izlenen onarım sürecine göre ayarlanması önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek proteinlerin katılımı veya fosforilasyon durumundaki değişiklikler ya da diğer post-translasyonel modifikasyonlarla ilgili soruları yanıtlamak için immünofloresan uygulanabilir. Bu teknik, araştırmacıların DNA onarım proteinlerinin dinamik katılımını keşfetmelerine ve protein domenleri ile mutasyonların, DNA hasarının tanınmasını ve buna verilen yanıtı nasıl etkilediğini daha iyi belirlemelerine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA hasarı oluşturmak ve DNA onarım proteinlerinin hücreye çekilmesini izlemek için lazer taramalı konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Lazerlerle ve formaldehit gibi kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.