Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde
5 Eylül 2017
DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.
Bu prosedürün genel amacı, konfokal bir floresan mikroskopi lazeri kullanarak bir hücrenin alt nükleer bölgesinde DNA hasarını indüklemektir. Bu yöntem, proteinlerin DNA hasarı bölgelerinde nasıl toplandığı ve tutulduğu gibi DNA onarımının temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen proteinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin vermesidir, böylece işe alım ve elde tutma profili oluşturulabilir.
Bu prosedüre, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulan bir sahne üstü inkübatöre ilgilenilen hücreleri içeren odacıklı bir slayt yerleştirerek başlayın. Kodlanmış bir otomatik mikroskop aşaması kullanarak görüntü alanlarını kaydedin. Kuyucuklar arasındaki bariyer gibi kültür kabının tanınabilir bir özelliğini seçin.
Bir görüntü toplayın ve XY konumunu kaydedin. Bu, numune hazırlamanın ardından seçilen alanların X-Y konumlarının hizalanmasına ve kaydedilmesine izin verecektir. Görüntü kaydı tamamlandıktan sonra, mikro ışınlama için bir alan seçin ve numuneyi odaklayın.
Floresan etiketli proteinleri ifade eden hücreler için, ilgilenilen floresan kanalında maksimum nükleer kesite sahip odak düzlemini seçin. Çekirdeğin maksimum kesitine odaklanmak çok önemlidir, çünkü ilgilenilen proteinin indüklenen hasar bölgesine alımını izlemek için odak noktasının çekirdek üzerinde merkezlenmesini sağlar. Çekirdek içinde çekirdekçik gibi net bir özellik seçin ve görünümdeki bu değişikliği gözlemlerken odak düzlemini yukarı ve aşağı hareket ettirin.
Gerçek odak düzlemi, aydınlıktan karanlığa geçişin içinde yer alacaktır. Örneğe odaklanmak için, seçilen unsurun en keskin kontrasta sahip olduğu odak düzlemini seçin. Bir sonraki adım, ilgilenilen alanın konumunu kaydetmektir.
Mikroskop yazılımında üçe üç piksel karelik bir ilgi alanı veya ROI oluşturun. Bu ROI'yi hasar görecek bir hücrenin çekirdeğinin üzerine yerleştirin ve bu ROI'yi hasarlı ROI olarak ayarlayın. Hasar ROI'sinin konumu da dahil olmak üzere bir hasar öncesi görüntü toplayın.
İlgilenilen protein için çiçeklenme kanalında parlak alan içeren bir görüntü elde edin. Hücreler artık lazer mikro ışınlaması için hazırdır. Bu gösteri için 405 nanometre lazer% 100 güçte kullanılacaktır.
405 nanometre lazer dozu, tarama hızının modüle edilmesi ve seçilen hasar ROI'sinin bir taramasının gerçekleştirilmesiyle kontrol edilir. Bu deneyde, 405 nanometrede mikro ışınlama için saniyede sekiz ve 0,5 kare kullanın. Hücrelere zarar vermek için uygun lazer gücünün seçilmesi, farklı DNA onarım yollarının ayrılması için kritik öneme sahiptir.
Hasardan sonra parlak alan ve floresan kanallarının hızlandırılmış görüntü alımını gerçekleştirin. Veri toplamayı optimize etmek için hızlandırılmış çekimin süresini ve sıklığını ayarlayın, ideal olarak floresan proteinin hasar ROI'sindeki birikimini ve deneyin zaman boyunca ayrışmasını yakalayın. Zaman seyri tamamlandıktan sonra, hasar için yeni bir hücre alanı seçin ve istenen hasarlı hücre sayısına ulaşılana kadar mikro ışınlama ve hızlandırılmış görüntülemeye devam edin.
Seçilen koşul başına 10 ila 25 hücre önerilir. İmmünofloresan analizi için toplam hücre sayısını artırmak için, hasar sonrası yanıtın çok alanlı bir zaman seyrini oluşturmak için kültür kabı içindeki ek alanlara zarar verin. Her alanın X-Y konumunu ve hasarın meydana geldiği zamanı kaydedin.
Hücreler hasardan hemen sonra sabitlenebilir veya sabitlemeden önce seçilen zaman aralıkları boyunca onarılmasına izin verilebilir. Bu analize başlamak için, alınan görüntüleri NIS-Elements gibi bir görüntü analizi uygulamasında açın. Ölçülecek her hücre için önce çekirdeği temsil eden bir referans ROI oluşturun.
Çekirdeği oluşturan pikselleri içeren çiçeklenme sinyali üzerinde bir eşik algoritması kullanın ve ardından bu alanı bir ROI'ye dönüştürün. Ardından, altıya altı piksellik bir yatırım getirisi oluşturun ve bunu hasar yatırım getirisinin üzerine yerleştirin. Bu daha büyük yatırım getirisi artık analiz için hasar yatırım getirisidir.
Ölçülecek her hücre için, referans ve hasar ROI'leri için ortalama çiçeklenme yoğunluğunu kaydedin. Zaman seyrinin her karesi için, nükleer alanın YG tarafından doğru bir şekilde kapsandığından emin olmak için referans yatırım getirisini ayarlayın ve hasarlı noktanın kapatıldığından emin olmak için hasar yatırım getirisini ayarlayın. Zaman seyrinin her karesi için her bir ROI içinde floresan sinyalinin ortalama floresan yoğunluğunu kaydedin.
Her hücre için, ortalama hasar ROI floresan yoğunluğunu, zaman atlamalı çekimin her karesinde karşılık gelen referans ROI'nin yoğunluğuna normalleştirin. Burada, referans ROI olarak ortalama nükleer floresan yoğunluğu kullanılır ve normalizasyon, ortalama referans ROI floresan yoğunluğunun ortalama hasar ROI floresan yoğunluğundan çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Normalleştirmeyi tüm hasarlı hücrelerin yanı sıra en az iki hasarsız kontrol hücresi için tekrarlayın.
Son olarak, deneysel tedavinin bir fonksiyonu olarak işe alım dinamiklerindeki değişiklikleri göstermek için zaman içinde normalleştirilmiş yoğunluk değerlerinin grafiğini çıkarın. XRCC1-GFP'yi stabil bir şekilde eksprese eden hücreler ışınlandı ve hasar indüksiyonundan önce ve sonra görüntülendi. XRCC1-GFP'nin hasar ROI'sine dahil edilmesi gözlemlendi ve işe alım dinamikleri ölçüldü.
Çift iplikçik kopmalarının oluşumu iki belirteç kullanılarak incelendi. Her iki belirteç için, 355 nanometrede iki saniyelik düşük doz stimülasyonu, beş dakika ve 20 dakikada yanıt vermez ve ışınlamadan 10 dakika sonra zayıf ve değişken bir yanıt verir. 355 nanometrede 10 saniyelik yüksek doz mikro ışınlama, ışınlamadan beş, 10 ve 20 dakika sonra hasar ROI'si içinde artan bir floresan sinyaline neden olur ve bu 40 dakikada azalır.
Bu sonuçlar, DNA çift sarmallı kırılma belirteçlerinin doza bağlı bir şekilde 355 nanometre mikro ışınlamada yanıt verdiğini göstermektedir. Buna karşılık, 405 nanometre lazer stimülasyonu, uygulanan dozdan bağımsız olarak hasar ROI'si içinde her iki belirteçin de önemli ölçüde birikmesine neden oldu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 10 hücre için yaklaşık dört saat içinde gerçekleştirilebilir.
Bu tekniği uygularken, lazer dalga boyunu ve uygulanan gücü izlenen onarım sürecine göre uyarlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek proteinlerin işe alınması veya fosforilasyon durumundaki değişiklikler veya diğer translasyon sonrası modifikasyonlar hakkındaki soruları yanıtlamak için immünofloresan yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların DNA onarım proteinlerinin dinamik alımını keşfetmelerine ve protein alanlarının ve mutasyonlarının DNA hasarının tanınmasını ve buna verilen yanıtı nasıl etkilediğini daha iyi belirlemelerine olanak tanır.
Bu videoyu izledikten sonra, DNA hasarını indüklemek ve DNA onarım proteinlerinin alımını izlemek için lazer taramalı konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Lazerler ve formaldehit gibi kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu çalışma, DNA hasarını indüklemek ve DNA onarım proteinlerinin gerçek zamanlı olarak toplanmasını gözlemlemek için konfokal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlamayı kullanır. Teknikler, DNA hasarı tespit ve onarım mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- DNA Onarım Mekanizmaları
Arka Plan
- DNA hasarı, hücresel fonksiyon ve bütünlük için kritik bir faktördür.
- DNA onarım proteinlerinin dinamiklerini anlamak, genom istikrarı hakkında anlayış sağlamak için gereklidir.
- Konfokal mikroskopi, hücresel süreçlerin hassas görüntülemesine izin verir.
- Lazer mikro-ışınlaması, lokalize DNA hasarı indüklemek için bir yöntem sağlar.
Çalışmanın Amacı
- İndüklenen DNA hasarının yerlerinde DNA onarım proteinlerinin toplanması ve kalıcılığını araştırmak.
- DNA hasarının ardından zaman içinde protein tepkisini analiz etmek.
- Farklı lazer dalga boylarının DNA onarım yolları üzerindeki etkilerini karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücreler, odalı slaytlarda kültür edilir ve kontrollü bir ortamda muhafaza edilir.
- Konfokal mikroskopi, görüntü alanlarını kaydetmek ve çekirdeklere odaklanmak için kullanılır.
- DNA hasarı indüklemek için 405-nanometer lazer kullanılarak lazer mikro-ışınlaması yapılır.
- Zaman aralıklı görüntüleme, hasar sonrası floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin toplanmasını yakalar.
Ana Sonuçlar
- XRCC1-GFP'nin hasar bölgelerine toplanması gözlendi ve nicellendi.
- Farklı lazer dozları, DNA onarım belirtilerinde değişen tepkiler ortaya çıkardı.
- Zaman aralıklı görüntüleme, protein birikim ve ayrışma dinamiklerini ortaya çıkardı.
- Sonuçlar, mikro-ışınlamaya DNA onarım belirteçlerinin doza bağlı bir tepki gösterdiğini belirtti.
Sonuçlar
- Çalışma, konfokal mikroskopi ve lazer mikro-ışınlamanın DNA onarım araştırmalarında kullanımını başarılı bir şekilde gösterir.
- Gerçek zamanlı görselleştirme, onarım proteinlerinin toplanma dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar.
- Bu teknikler, çeşitli bağlamlarda DNA onarım mekanizmalarını daha fazla araştırmak için uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Laser micro-irradiation combined with confocal microscopy enables precise induction and quantification of DNA strand breaks in mammalian cells, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides real-time, quantitative insights into DNA repair protein recruitment and retention, informing target validation and pathway interrogation. The method enhances predictive confidence for DNA repair targets and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment dynamics.
- Supports functional validation of DNA repair targets by quantifying recruitment and retention at damage sites.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing single- and double-strand break responses.
- Provides quantitative data for triaging DNA repair targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, dose-controlled DNA damage induction for assay standardization.
- Generates quantitative, time-resolved readouts of protein recruitment for screening readiness.
- Supports development of scalable assays for compound evaluation targeting DNA repair pathways.
- Enables platform reuse across different repair proteins and cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA repair dynamics with disease-relevant cellular contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in mammalian systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying repair kinetics and pathway engagement.
- Facilitates evaluation of protein domain mutations and post-translational modifications in repair processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics for DNA repair targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of DNA repair mechanisms and protein function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers time-resolved, normalized fluorescence measurements for comparative analysis of repair dynamics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling mechanistic evaluation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse DNA repair research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DNA repair target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of DNA damage and repair assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of DNA repair targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to laser-equipped confocal microscopes and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of laser dose, ROI selection, and normalization protocols.
- Adaptable to various cell models and repair proteins with appropriate optimization.
- Safety precautions are essential due to laser use and chemical fixation steps.
