Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Bu yakınlık ligasyon tahlil deneyinin genel amacı, süspansiyon hücre kültürlerinde DNA hasarının indüksiyonunu takiben DNA hasar tepkisinin oluşumunu görselleştirmek ve ölçmek ve protein komplekslerini onarmaktır. Bu yöntem, mekansal zamansal organizasyon ve düzenleme ve çeşitli onarım yollarının farklı DNA hasarı türlerine nasıl tepki verdiği gibi DNA hasar onarımındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, nispeten basit olması, düşük hücre sayısı gerektirmesi ve protein-protein etkileşimlerini bozabilecek veya değiştirebilecek kapsamlı bir işlem gerektirmemesidir.

Bu yöntem, kültür süspansiyon hücrelerinde DNA onarımı, protein kompleksi oluşumu hakkında bilgi sağlayabilse de, kültürlenmiş yapışık hücrelerde, donmuş veya parafine gömülü dokularda ve hatta bütün hayvanlarda da uygulanabilir. İnsan BCR pozitif, b hücreli akut lenfoblastik hücre hattı, BV-173, bu çalışmada kullanılmış ve %5 CO2'lik bir atmosferde 37 santigrat derecede takviyelerle IMDM'de kültürlenmiştir. Hücreleri, kuyucuk başına beş mililitrelik altı oyuklu bir plakada mililitre başına 10 ila altıncı kez iki kez kaplayın.

Hücre döngüsünün G1 fazındaki hücreleri tutuklamak için, her bir oyuğa beş mikromolar amonyum metansülfonat ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede %5 CO2'lik bir atmosferde inkübe edin. Ertesi gün, iki kuyucuğun her birine beş mikromolar bir ATM inhibitörü ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Daha sonra, ATM inhibitörü ile ön işleme tabi tutulmuş kuyucuklardan birine ve ön işleme tabi tutulmamış başka bir kuyucuğa mililitre NCS başına 50 nanogram ekleyerek DNA hasarını indükleyin.

İki saat kuluçkaya yatırın. Bir beherde 50 mililitre 1XPBS'nin üzerine beş gram fraksiyon-5 BSA katmanlayarak 1XPBS artı %10 BSA'yı hazırlayın ve BSA eriyene kadar çalkalamadan veya karıştırmadan oda sıcaklığında bekletin. PBS artı %10 BSA çözeltisini 0.22 mikrometre filtreden yavaşça süzün ve buz üzerinde tutun.

Hücreleri hasat edin, her bir oluğun içeriğini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri buz gibi soğuk 1XBPS ile iki kez yıkayın. Hücreleri saydıktan sonra, 1XBPS artı% 10 BSA'da mililitre başına 10 ila altıncı hücreye iki kez yeniden süspanse edin.

Hücreleri buz üzerinde tutun. Mikroskopi slaytlarını bu prosedür için tüy bırakmayan doku ile dikkatlice parlatarak ve beş dakika boyunca bir Coplin kavanozuna %96 etanol koyarak yağdan arındırarak hazırlayın. Slaytları 10 dakika kurumaya bırakın.

Mikroskopi slaytlarını altı mililitrelik bir alana sahip sitospin sitoloji hunilerine monte edin. Her bir huniye 50 mikrolitre 1XPBS artı %10 BSA pipetleyerek slaytları önceden kaplayın ve 500 RPM'de bir dakika santrifüjleyin. Her huniye 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve beş dakika boyunca 500 RPM'de santrifüjleyin.

Hunileri dikkatlice sökün ve slaytlardaki noktalara dokunmadığınızdan emin olun. Her noktanın etrafına bir daire çizmek için beş milimetre uçlu bir Pap kalem sıvı engelleyici kullanın. Daha sonra her noktaya 50 mikrolitre% 4 PFA fiksasyon çözeltisi ekleyin.

Ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, hücreleri 1XPBS ile bir Coplin kavanozunda oda sıcaklığında hafif çalkalayarak yıkayın. Her seferinde beş dakika boyunca bu şekilde üç kez yıkayın.

Lekelerin etrafındaki slaytları tüy bırakmayan bir doku ile kurutun ve slaytı eğerek ve tüy bırakmayan doku ile kurulayarak lekelerden mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın. Her noktaya 1XPBS'de 50 mikrolitre %0,25 Triton X ekleyin ve çalkalamadan oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Slaytları 50 ila 60 mililitre TBS-T'de bir Coplin kavanozunda oda sıcaklığında hafif çalkalayarak yıkayın.

Her seferinde beş dakika boyunca üç kez. Engellemeden önce, TBS-T'ye dokunun ve lekelerin etrafındaki slaytları tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Noktadan mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın.

Blokaj çözeltisini kısaca girdap haline getirin ve ardından her noktaya yaklaşık 40 mikrolitrelik bir damla ekleyin. Slaytları önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Antikor kokteyllerini hazırlayın.

Girdap ve ardından ticari antikor seyrelticiyi her bir mikrofüj tüpüne pipetleyin. Keçi anti ATM antikorunu 1:1000'de ekleyin. Ve tavşan anti-fosfoserin-15 p53 antikoru 1:100'de.

Tek antikor kontrol deneyleri için, sadece keçi anti-ATM antikoru ve sadece tavşan anti-fosfoserin-15 p53 antikoru içeren antikor dilüsyonları hazırlayın. Bir saatlik inkübasyonun sonunda, bloke edici solüsyonu hafifçe vurun, ancak hücrelerin kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Her bir antikor kokteyli seyreltmesinden 30 mikrolitre ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.

Ertesi gün, slaytları 1X NC2 yıkama tamponu A ile bir Coplin kavanozunda oda sıcaklığında iki kez beş dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın. Slaytlar yıkama tamponu ile iki kez yıkandıktan sonra, slaytlardan yıkama tamponunu bir kez kapatın ve her noktaya 30 mikrolitre yakınlık ligasyonu tahlil probu karışımı ekleyin. Önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Slaytları 50 ila 60 mililitre yıkama tamponu A ile bir Coplin kavanozunda oda sıcaklığında hafif çalkalayarak yıkayın. Daha sonra, her nokta için 39 mikrolitre ligasyon solüsyonuna bir mikrolitre ligaz ekleyerek ligasyon ligaz solüsyonunu buz üzerinde hazırlayın. Her noktaya 40 mikrolitre ligasyon ligaz çözeltisi ekleyin.

Önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Slaytları yıkama tamponu A ile bir Coplin kavanozunda oda sıcaklığında hafif çalkalayarak yıkayın. Amplifikasyon polimeraz karışımını buz üzerinde hazırlayın.

İlk olarak, amplifikasyon stok çözeltisini bir ila beş su ile seyreltin. Ve her nokta için 39,5 mikrolitre 1X amplifikasyon çözeltisine 0,5 mikrolitre polimeraz ekleyin. Yıkama tamponunu hafifçe vurun ve nokta başına 40 mikrolitre amplifikasyon polimeraz karışımı ekleyin.

Önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 100 dakika inkübe edin. 100 dakikalık inkübasyonun tamamlanmasının ardından, amplifikasyon polimeraz karışımını hafifçe vurun ve slaytları bir Coplin kavanozunda 1X NC2 yıkama tamponu B ile yıkayın. Oda sıcaklığında, her biri 10 dakika boyunca iki kez hafif çalkalama ile.

Bundan sonra, slaytları 0.01x yıkama tamponu B'de bir dakika yıkayın. Fazla yıkama tamponunu B hafifçe vurun ve lekelerin etrafındaki slaytları tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Noktadan mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın.

DAPI içeren montaj ortamını DAPI'yi DAPI içermeyen montaj ortamında 1:5 oranında seyrelterek çekirdekleri fazla lekelemeyecek montaj ortamı içeren DAPI hazırlayın. 25 ila 30 mikrolitre seyreltilmiş DAPI içeren montaj ortamını 24 milimetreye 24 milimetrelik bir kapak kızağına ekleyin. Kapak kızağını sürgü ile alın ve sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olmak için hafif bir baskı uygulayın.

Kapak fişini oje ile kapatın ve görüntülemeden önce en az 15 dakika bekleyin. Son olarak, konfokal bir floresan mikroskobu kullanarak slaytları görüntüleyin ve analiz edin. Yakınlık ligasyon testi, G1 fazında tutuklanan BV 173 insan BCR özellikli pozitif hücrelerde ATM ve fosfoserin 15 p53 arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanıldı.

DNA hasarını indüklemek için NCS ile tedavi edilmeyen hücrelerin aksine, NCS ile tedavi edilen hücrelerin çoğu, hücre başına ortalama yedi sinyal ile yalnızca çekirdekte noktasal sinyallere sahipti. Bu, DNA hasarının indüksiyonunun ATM ve fosfoserin 15 p53 arasındaki etkileşime yol açtığını gösterir. DNA hasarının indüksiyonundan önce hücrelerin spesifik bir ATM kinaz inhibitörü ile ön muamelesi, sinyal sayısını hücre başına ortalama iki sinyale düşürür ve kalıntı serin 15'te p53'ün fosforilasyonunun ATM kinaz aktivitesine bağlı olduğunu doğrular.

Anti ATM veya anti fosfoserin 15 p53 antikorunun yayıldığı tek antikor kontrol deneyleri, beklendiği gibi herhangi bir sinyal vermedi. Bu şekil, süspansiyon hücre kültürlerinin sitospin preparatları üzerindeki yakınlık ligasyon testi tekniğinin özgüllüğünü gösteren ve doğrulayan sonuçların nicelleştirilmesini ve istatistiksel analizini sunmaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, bir primer antikor ile bir gece inkübasyondan yaklaşık beş saat sonra yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, yakınlık ligasyon testi gerçekleştirmeden önce ilgilendiğiniz hücrelerin immünofloresan boyaması ile antikoru dikkatli bir şekilde titre etmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre biyolojisindeki araştırmacıların, immünopresipitasyonlar ve genellikle teknik artefaktlarla sonuçlanan FRET tabanlı görüntüleme gibi standart yöntemler kullanılarak değerlendirilmesi zor olan geçici protein protein etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, protein protein etkileşimini yerinde görselleştirmek ve ölçmek için süspansiyon hücre kültürlerinde yakınlık ligasyon testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.