Name: Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Öğrenin, akım sitometri ile fare timusunda T hücre gelişimini incelemeyi. Bu yöntem, genetik olarak manipüle edilmiş modellerde lenfosit popülasyonlarını değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar kendi teknik yardım için Bing Zhang teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (MOP-86595) için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. SEKME CIHR Yeni Araştırmacı ve AHFMR Scholar olduğunu. Doktora ve AIHS Tam zamanlı Bursu - HY bir CIHR Kanada Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. SAN Kraliçe Elizabeth II Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. Doktora - AYWS bir NSERC Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir.

Deneysel protokol genel bir şema için Şekil 1 &#39;e bakınız. 1. Teşrih <ol><li> 60 x 15 mm Petri kabı içine yerleştirin steril çelik örgü ekran. Bir birim doku örneği başına gereklidir. </li><li> Her bir tabak için Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 5 ml ilave edilir. Buz üzerinde yemekleri tutun. </li><li> CO 2 ile farelerin Euthanize. </li><li> Diseksiyon yüzey Güvenli fare yukarı bakacak ventral tarafta. Sterilizasyon için% 70 etanol ve kürk aşağı keçeleşmiş sağlamak için Sprey fare. </li><li> Cerrahi makas kullanarak, sadece genital Yukarıdaki karın derisinde bir ventral kesi yaparak diseksiyon başlar. Çene insizyon yukarı uzatın. </li><li> Midline itibaren, tüm uzuvları boyunca kesi uzanması. Gevşek cilt geri çekin ve diseksiyon yüzeye aşağı pin. </li><li> Timus Harvest: <ol><li> Bir kesi yapmak için sternumun alt ucu kaldırın.</li><li> Karaciğer kaçınmak, göğüs kafesi ayırmak ve sonra her tarafa göğüs kafesi kesmek için diyafram kesti. Akciğer ve kalp önlemek için dikkat çekici, her iki tarafta göğüs kafesi yukarı kesin. </li><li> Göğüs kafesi arkasında forseps ile yavaşça çekin. Timus kalp üzerinde bulunan bir beyaz, bilobe organdır. Lobların alt kavramak için forseps düz kenar kullanarak yavaşça timus çekin ve ekran örgü üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> Dalak Harvest: <ol><li> Dalak karaciğer aşağıda farenin karın boşluğunda, sol tarafında yer alan kırmızı, sörf tahtası şeklinde bir organdır. </li><li> Karın boşluğuna bir kesi olun. Yavaşça bağ dokusu uzakta tease ikinci çifti kullanılarak, forseps bir çift ile dalak dışarı çekin. Ayrı bir boy gözenekli elek üzerinde dalak yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> 3 ml şırınga bir pistonu kullanarak, eziyetsadece bağ dokusu ve yağ kalıntıları kadar ekran örgü içine organları. Çanak HBSS üç kez örgü durulayın. Her doku örneği için yeni bir dalgıç kullanın. <ol><li> Doku homojenleştirici için diğer seçenekler bu yöntem yerine kullanılabilir. </li></ol></li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 335 santrifüje edilerek pellet hücreler 4 ° C &#39;de 5 dakika xg </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için ACK lizis tamponu 500 ul (0.15 M NH4CI, 10 mM KHC0 3, 0.1 mM Na 2 EDTA, pH 7.2) içinde süspanse splenositlerin. 20 süspanse timositleri x 10 6 hücre / ml FACS tampon (PBS,% 1 FCS,% 0.02 sodyum azid) ve buz üzerinde bir kenara koyun. </li><li> HBSS 5 ml ekleyerek izotoniklik için splenositlerin dönün. Pelet 20 santrifüj ve tekrar süspansiyon tarafından splenositlerin x 10 6 hücre / FACS tampon ml. Hücrelerinin steril kalması gerekiyorsa, steril RPMI +% 10 FCS kullanabilirsiniz. </li></ol> 3.Akış sitometrisi için Boyama Hücreleri Bu protokolün amacı, yabani-tip (WT) ve HY cd4 fareler kullanarak pozitif ve negatif seçim analizi için stratejilerin altını çizmektir. Flow sitometri deneysel tasarım, satın alma, ve analizi ile ilgili genel değerlendirmeler için, biz Tung ark mükemmel bir inceleme okuyucuları bakın. 11. <ol><li> Alikot 4 x 10 96-kuyulu plakanın her bir kuyucuğa akış sitometrisi numune başına 6 timositlerde yanı sıra, telafi kontrol başına 1 x 10 6 WT splenositlerin. Transgenik fareler kullanarak, size deneyde bir denetim olarak WT fare içermelidir. </li><li> Buz üzerinde 10 dakika için anti-CD16/32 (klon 2.4G2) ile hücreler inkübe ederek Fc reseptörleri bloke ederler. </li><li> 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta 335 x g&#39;de plaka Spin. Kapağını kaldırın ve bir kez plaka iterek kuyulardan sıvı dağıtmak, bir lavabo içine doğru bakmalıdır. FACS tamponu içinde 200 ul her bir kuyu yeniden süspanse edin. Yıkama tekrarlayın. </li><li> Aşağıda listelenen de FACS tampon başına 200 ul içinde seyreltme göre her bir antikor için optimum konsantrasyonu kullanılarak, antikor kokteyller hazırlayın. Her bir antikorun en uygun konsantrasyon pozitif ve negatif nüfusun büyük ayırma vermek için gereken en düşük konsantrasyon olarak tanımlanmıştır. , Belirli bir antikor için negatif bir nüfus var ise, bir antikor izotip dahil edilmelidir. İstenirse kuyu başına toplam hacmi (kuyu başına 100 ul) örneğin küçültülmüş olabilir. <ol><li> WT timüs: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ya da anti-CD5, anti-CD24 </li><li> Timus HY CD4: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ya da anti-CD5, anti-CD24 CD69 lo ve timositleri yılında CD69 yüksek nüfus daha iyi ayrılması elde etmek için, onun tarafından izlenen bir biotinlenmiş anti-CD69 primer antikor kullanılması tavsiye edilir ikincil bir florokrom-konjuge streptavidin içeren leke. Biz uCD5 boyama için se aynı stratejiyi. </li></ol></li><li> Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süre ile FACS tamponu içinde antikor kokteyli 200 ul hücre ile inkübe edin. </li><li> Antikor kokteyli boyama ile eş zamanlı olarak, tek bir florokrom-konjuge antikor ile her kompanzasyon kontrolü leke. İdeal olarak, dengeleme boyama antikor kokteyli içinde kullanılan aynı antikorları içerir. Birçok antijen test ediliyor Ancak, her bir antijen için boyama büyük deneyler için uygun olmayabilir. Bu nedenle, anti-CD4, anti-CD8 ya da ya da için yüksek renklendirme, bu antijenlerin ifadesi ya da telafi boncuk kullanımına bağlı olarak tavsiye edilir. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika süre ile FACS tamponu içinde Leke. Bir telafi kontrolü boyanmadan bırakın. </li><li> FACS tamponu ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> FACS tampon ve FACS tüplerine transfer süspanse edin hücreleri. </li><li> Akış sitometresinde örnekleri edinin. FSC-A edinimi ve FSC-W dahilçiftli ayrımcılık llow. </li></ol> 4. Akım Sitometri Veri Analizi - Sigara TCR Transgenik Fare Biz flow sitometri veri analizi için FlowJo kullanın. Non-TCR transgenik fareler için yolluk strateji 2A Şekil bakın. <ol><li> SSC, &quot;lenfosit&quot; nüfus üzerindeki elektronik kapıdan FSC-A kullanma. </li><li> &quot;Lenfosit&quot; nüfus içinde, hücre çiftler ve aggregrates dışlamak için elektronik kapı FSC-W lo nüfus FSC-W tarafından FSC-A kullanın. Bu &quot;singlet&quot; kapısıdır. </li><li> &quot;Singlet&quot; kapısı, CD4 arsa CD8 olayları kullanma. DN, DP donuk, DP aydınlık için geçitler çizin, CD4 Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi + CD8 lo, CD4SP ve CD8SP nüfus. </li><li> CD4SP ve CD8SP kapılar altında, CD24 araziler tarafından TCRβ oluşturun. Şekil 2C tasvir gibi kapıları çizmek için kadranda gating aracını kullanın. </li><li> A ne oluşturmaCD69 ile TCRβ: &quot;tekli&quot; kapısı w arsa. Kapıları A, B, C, D, Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir. Çizme </li><li> CD5 tarafından TCRβ: &quot;tekli&quot; kapıdan başka bir arsa oluşturun. Şekil 2E tasvir gibi kapıları i, ii, iii, iv çizin. Bu pozitif seleksiyon incelenmesi için başka bir stratejidir. </li><li> Kapıları i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Şekil 2B, E) &quot;singlet&quot; altından DN, DP donuk, DP parlak, CD4 int, CD4SP ve CD8SP kapıları uygulayın. </li><li> Eğer hedef nüfus ulaşana kadar sonraki her kapının frekansını organ selülarite çarparak belirli bir alt kümesi hücrelerin sayısını hesaplayın. Örneğin, TCRβ hi CD69-CD8SP timositlerin sayı timüs sellüler x% TCR BHI tarafından belirlenecektir CD69-(D fraksiyonu) x% CD8SP. <ol><li> Sayma zaten canlı ve ölü hücreleri böylece &quot;lymphoc içermez dikkate alırhesaplamalarda YTE &quot;kapısı. </li></ol></li></ol> 5. Akım Sitometri Veri Analizi - TCR Transgenik Fareler TCR transgenik fareler için yolluk strateji 3A Şekil bakın. <ol><li> Adımlarda, önceki bölümlerde olduğu gibi 4.1 ve 4.2 izleyin. </li><li> &quot;Singlet&quot; kapı altında T3.70 üzerine SSC arsa ve kapı bir T3.70 oluşturmak + hücre popülasyonu antijen-spesifik T hücreleri (Şekil 3B) analiz etmek. Bazı durumlarda, bu non-spesifik antijen (T3.70-) T hücre popülasyonu bu nüfusu karşılaştırmak için ilgi çekici olabilir. </li><li> Içinde T3.70 + nüfus, beraberlik DN, DP, CD4SP ve CD8SP kapıları (Şekil 3C). <ol><li> Çok az T3.70 + hücreleri olacak gibi WT kontrol örnekleri için, &quot;tekli&quot; kapısının altına bu kapılardan çizmek veya bir T3.70 kapısı oluşturun. </li></ol></li><li> CD8SP kapısı altında, oluşturmakCD24 arsa T3.70. Dört nüfus (Şekil 3F) içine hücre bölmek için kadranda gating aracını kullanın. </li><li> WT fareler ve HY cd4 farelerin T3.70 + DP bölmesi (Şekil 4A) DP bölmesinde CD69 ekspresyonu gösteren Kalıplı bir histogram oluşturun. CD5 ekspresyonu (Şekil 4B) incelemek için tekrarlayın. </li><li> 4.8 gibi ilgi her alt hücrelerin mutlak sayısını hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire+regulates+negative+selection+of+organ-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire regulates negative selection of organ-specific T cells.</a> Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).</li>
<li>Liston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage--limiting+role+of+Aire+in+thymic+expression%2C+clonal+deletion%2C+and+organ-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).</li>
<li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+learning+self-control+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).</li>
<li>Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+association+of+partial+T-cell+immunodeficiency+and+immune+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+what+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: what have we learned from mice.</a> Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).</li>
<li>Zhan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Without+peripheral+interference%2C+thymic+deletion+is+mediated+in+a+cohort+of+double-positive+cells+without+classical+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).</li>
<li>Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+apoptosis+induced+by+T+cell+activation+is+mediated+by+glucocorticoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo.</a> J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).</li>
<li>Martin, S., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+and+nonspecific+deletion+of+immature+cortical+thymocytes+caused+by+antigen+injection%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection.</a> European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).</li>
<li>Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+TCR+alpha+expression+critically+influences+T+cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection.</a> J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).</li>
<li>Tung, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+laboratory+medicine%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).</li>
<li>Aliahmad, P., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+all+CD4+T+lineages+requires+nuclear+factor+TOX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX.</a> J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).</li>
<li>Kastner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11b+represses+a+mature+T-cell+gene+expression+program+in+immature+CD4%28%2B%29CD8%28%2B%29+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes.</a> Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).</li>
<li>Albu, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL11B+is+required+for+positive+selection+and+survival+of+double-positive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes.</a> J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).</li>
<li>Van De Wiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytes+between+the+beta-selection+and+positive+selection+checkpoints+are+nonresponsive+to+IL-7+as+assessed+by+STAT-5+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation.</a> J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).</li>
<li>Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+signals+are+essential+for+cortex-medulla+migration+of+developing+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes.</a> J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).</li>
<li>Saini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science signaling. 3, ra23(2010).</li>
<li>Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bim-mediated+apoptosis+is+not+necessary+for+thymic+negative+selection+to+ubiquitous+self-antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens.</a> J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).</li>
<li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4%2B8%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).</li>
<li>Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7-mediated+migration+of+developing+thymocytes+to+the+medulla+is+essential+for+negative+selection+to+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).</li>
<li>Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+negative+selection+on+the+T+cell+repertoire+reactive+to+a+self-peptide%3A+a+large+fraction+of+T+cell+clones+escapes+clonal+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion.</a> Immunity. 13, 829-840 (2000).</li>
<li>Gallegos, A. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance+to+tissue-specific+antigens+mediated+by+direct+and+indirect+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation.</a> J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Bouillet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+Bcl-2+family+member+Bim+is+required+for+apoptosis+of+autoreactive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes.</a> Nature. 415, 922-926 (2002).</li>
<li>Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+protein+Bim+is+differentially+required+during+thymic+clonal+deletion+to+ubiquitous+versus+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+orphan+steroid+receptor+Nur77+in+apoptosis+accompanying+antigen-induced+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection.</a> Immunity. 3, 273-282 (1995).</li>
<li>Zhou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Nur77%2FNurr1+leads+to+inefficient+clonal+deletion+of+self-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells.</a> J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).</li>
<li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan protokol olmayan TCR transjenik ve TCR transgenic farelerde pozitif ve negatif seçim incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, yüzey antijenlerinin boyama açıklanmaktadır. Moleküler mekanizmalarının daha fazla analiz için, genellikle hücre içi boyama yapmak için gereklidir. Biz transkripsiyon faktörleri için en intraselüler proteinler ve BD Biosciences Foxp3 Boyama Seti BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kiti kullanın. Biz genellikle hemen boyama sonra örnekleri kazanır. Bununla birlikte, örnekler 4 az% ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> HyClone Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Metal örgü ekranlar </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> Petri kapları (60 x 15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> Enjektörler (3 ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> Konik boru (15 ml) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Zeiss - Primo Yıldız </td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> HausserBilimsel </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> 96-kuyulu plakalı </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> Kanallı pipet </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> Fetüs buzağı serumu </td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum azid </td><td> BT Baker Chemical Co </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FCR engelleme reaktif </td><td></td><td></td><td> Klon 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-fare HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-YY * </td><td> Klon T3.70 </td></tr><tr><td> Anti-fare CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-YY * </td><td> Klon RM4-5 </td></tr><tr><td> AYüzgeç-fare CD8α </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-YY * </td><td> Klon 53-6,7 </td></tr><tr><td> Anti-fare CD24 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-YY * </td><td> Klon M1/69 </td></tr><tr><td> Anti-fare TCRβ </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-YY * </td><td> Klon H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-fare CD69 biotinlenmiş </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-YY * </td><td> Klon H1.2F3 </td></tr><tr><td> Anti-fare CD5 biotinlenmiş </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-YY * </td><td> Klon 53-7,3 </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-YY * </td><td></td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> BD Biosciences - FACS Canto </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tüpler </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> Flow sitometri analiz yazılımı </td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 orta </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Florokrom ve YY Şişe boyutuna göre değişir tarafından * XX değişir. </td></tr></tbody></table>

akım sitometri tarafından timik pozitif ve negatif seçim incelenmesi

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Sağlıklı bir bağışıklık sistemi kendi antijenlerine tolerans kalırken T hücrelerinin yabancı antijenleri yanıt gerektirir. T hücre reseptör (TCR) α ve β lokusların Rastgele düzenlenmesi öz ve yabancı hem antijen özgüllüğü engin çeşitliliği ile T hücre repertuarı oluşturur. Timusta gelişimi sırasında repertuar seçimi güvenli ve kullanışlı T hücreleri üretmek için önemlidir. Timik seçiminde Kusur otoimmün ve immün bozuklukları 1-4 gelişmesine katkıda bulunur. T hücre progenitörler CD4 veya CD8 co-reseptörleri ifade etmezler çift negatif (DN) timositleri olarak timus girin. ΑβTCR hem eş-reseptör ekspresyonu çift pozitif (DP) aşamada gerçekleşir. Öz-peptid-MHC (pMHC) timus hücreleri tarafından sunulan ile αβTCR Etkileşimi DP timosit kaderini belirler. Yüksek afinite etkileşimleri olumsuz seçimi ve ortadan kalk yolkendinden reaktif timositlerin tion. CD4 veya kendinden MHC 5 tarafından sunulan yabancı antijenleri tanıma yeteneğine CD8 tek pozitif (SP) T hücrelerinin pozitif seçimi ve gelişimi Düşük afinite etkileşimleri sonucu. Pozitif Seçimi olgun T hücrelerinin üretimi gözlemleyerek bir poliklonal (yabani-tip) TCR repertuarı ile farelerde incelenebilir. Bununla birlikte, küçük antijen-spesifik popülasyonlarının silme içerir negatif seçim çalışma için ideal değildir. Birçok model sistemler negatif seçim çalışma ama fizyolojik olaylar 6 özetlemek için yeteneklerini değiştirmek için kullanılan edilmiştir. Eksojen antijen uygulamasından timositlerde 7-9 non-spesifik silme yol açabilir Örneğin, timositlerde in vitro uyarımı olarak, iç içe işlemine dahil olan timik ortam yoksundur. Şu anda, in vivo negatif seleksiyon eğitim için en iyi araçları bir transgresyon ifade fareler vardırself-antijen endojen için ENIC TCR özgü. Bununla birlikte, birçok klasik TCR transjenik modelleri prematüre negatif seçim ile sonuçlanan, DN aşamada transgenik TCRα zincirinin erken ifade ile karakterize edilir. Bizim laboratuvar olarak 10 yabani-tip farelerden oluşan negatif seleksiyon SP geçiş DP sırasında meydana sağlayan, transgenik HY TCRα şartlı DP aşamada ifade edildiği HY cd4 model geliştirdi. Burada, HY cd4 fare modelinde timik pozitif ve negatif seçim incelemek için bir akış sitometri tabanlı protokol açıklar. HY CD4 farelerde, negatif seleksiyon çok fizyolojik olmakla birlikte, bu yöntemlerin diğer TCR transjenik modelleri ile de uygulanabilir. Biz de herhangi bir genetik manipüle fare için geçerli bir poliklonal repertuar olumlu seçimi analiz için genel stratejiler sunacak.

Fizyolojik TCR transgenik modeller ve WT farelerde, pozitif seleksiyon antijen karşılaşma sonrasında DP donuk aşamaya geçmeden önce DP parlak aşamada başlar. DP donuk timositleri ardından CD4SP veya CD8SP timositleri (Şekil 2B) olmadan önce bir geçiş CD4 + CD8 lo sahne girin. Olgun SP timositleri yüksek TCR ekspresyonu ve CD24 (Şekil 2C) kaybı ile karakterize edilir. Profil CD69 veya CD5 tarafından TCRβ inceleyerek, pozitif seleksiy...

Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem sunmak<em&gt; In vivo</em&gt; Bir yabani-tip veya T hücre reseptörü transgenik arka plan üzerinde genetik manipüle fare kullanarak.

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Sağlıklı bir bağışıklık sistemi, T hücrelerinin kendi antijenlerine karşı toleranslı kalırken yabancı antijenlere yanıt vermesini gerektirir. T hücresi ...'nın rastgele yeniden düzenlenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerdeki timus gelişimini akış sitometrisi ile incelemektir. Bu işlem, farenin timus ve dalağından tek hücre süspansiyonları hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, spesifik timik popülasyonların tanımlanması için timositler ve splenositler bir antikor kokteyli ile boyanır.Nihayetinde, çeşitli lenfosit popülasyonlarının frekansı ve sayısı akış sitometrik analizi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem, fonksiyonel ancak hücre toleranslı bir T hücresi repertuvarının oluşturulması için hangi genlerin ve yolakların önemli olduğu gibi, T hücresi gelişimiyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem timustaki T hücresi gelişimine dair içgörü sağlayabilmenin yanı sıra, diğer bağışıklık hücrelerinin gelişiminin incelenmesinde de uygulanabilir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, akış sitometrisi için antikor kokteyllerini tasarlarken zorlanırlar. Diseksiyona başlamadan önce, 60 by 15 milimetrelik bir Petri kabına steril bir çelik ağ yerleştirin. Ardından, timusu toplamak için kaba beş mililitre HBSS ekleyin ve kabı buz üzerinde saklayın.Öncelikle, sternumun alt ucunu kaldırmak ve diyaframı açığa çıkarmak için bir pens kulla

examination-thymic-positive-negative-selection-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) CD4+ ve CD8+ T hücrelerini, γδ T hücrelerini, B hücrelerini, doğal öldürücü (NK) hücreleri ve monositleri tanımlamak için iki florokrom kullanan akış sitometrisi tabanlı bir teknik gösterilmektedir. Hücrelerin yüzey belirteçlerine karşı florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilmesinin ardından, hücre alt kümeleri optimal bir akış sitometrik geçit stratejisi kullanılarak tanımlanır.

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde İmmün Hücre Alt Kümelerini Tanımlamak için Bir Akış Sitometrisi Testi

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.

Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

Bu makalede, sitometrisi spektral, fluorochromes ayırt emisyon spektrumları şekilleri kullanan akış sitometrisi yeni bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bir algoritma, tazminat değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi edebilir. Bu yeni yaklaşım, katı organ izole edilmiş hücre uygun analizi sağlar.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol+ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4+ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Burada, CD4 tanımlamak için bir akış sitometrik protokol mevcut+ ve CD8+ T hücreleri, γδ T hücreleri, B hücreler, NK hücreleri ve monosit yedi yerine sadece iki fluorochromes kullanarak insan periferik kan içinde. Bu yaklaşım ile beş ek işaretleri çoğu akışı cytometers üzerinde kaydedilir.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Bu protokol, çift negatif timositlerin fare timumundan izolasyonunu, ardından daha fazla fonksiyonel analiz için delta benzeri 4 eksprese eden kemik iliği stromal hücre hattı ko-kültür sisteminde (OP9-DL4) retroviral transdüksiyon ve ko-kültürü tanımlar.

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için protokolleri açıklıyoruz.

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması

Öğrenin, akım sitometri ile fare timusunda T hücre gelişimini incelemeyi. Bu yöntem, genetik olarak manipüle edilmiş modellerde lenfosit popülasyonlarını değerlendirmeyi sağlar.

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Daha fazla video keşfet