Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerdeki timus gelişimini akış sitometrisi ile incelemektir. Bu işlem, farenin timus ve dalağından tek hücre süspansiyonları hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, spesifik timik popülasyonların tanımlanması için timositler ve splenositler bir antikor kokteyli ile boyanır.

Nihayetinde, çeşitli lenfosit popülasyonlarının frekansı ve sayısı akış sitometrik analizi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem, fonksiyonel ancak hücre toleranslı bir T hücresi repertuvarının oluşturulması için hangi genlerin ve yolakların önemli olduğu gibi, T hücresi gelişimiyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem timustaki T hücresi gelişimine dair içgörü sağlayabilmenin yanı sıra, diğer bağışıklık hücrelerinin gelişiminin incelenmesinde de uygulanabilir.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, akış sitometrisi için antikor kokteyllerini tasarlarken zorlanırlar. Diseksiyona başlamadan önce, 60 by 15 milimetrelik bir Petri kabına steril bir çelik ağ yerleştirin. Ardından, timusu toplamak için kaba beş mililitre HBSS ekleyin ve kabı buz üzerinde saklayın.

Öncelikle, sternumun alt ucunu kaldırmak ve diyaframı açığa çıkarmak için bir pens kullanın. Ardından, karaciğere dikkat ederek diyaframı kesin ve göğüs kafesini ayırın, daha sonra göğüs kafesini her iki tarafta yukarıya doğru kesin. Akciğerlere ve kalbe zarar vermemeye özen gösterin.

Şimdi pens yardımıyla göğüs kafesini nazikçe geriye doğru çekin. Timus, kalbin üzerinde yer alan beyaz, iki loblu bir organdır. Lobların alt kısmını kavramak için pensin düz kenarını kullanın.

Ardından timusu nazikçe dışarı çekin ve önceden hazırlanmış ağ süzgeçlerden birinin üzerine yerleştirin. Dalak hasadı için, karın boşluğunu açığa çıkarmak amacıyla peritona bir insizyon yapın. Dalak, farenin karın boşluğunun sol tarafında, karaciğerin altında yer alan kırmızı, sörf tahtası şeklinde bir organdır.

Ardından, dalağı çıkarmak için bir çift pens, bağ dokusunu ayırmak için ise başka bir çift pens kullanın. Sonra, diseke edilen dalağı ayrı bir ağ süzgecin üzerine yerleştirin. Şimdi, her bir organı, geriye sadece bağ dokusu ve yağ kalana kadar üç mililitrelik bir şırınganın pistonuyla ağ süzgeç üzerinde ezin; hücreleri ve HBSS'yi 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin.

Ardından her bir filtreyi taze HBS ile 3 kez durulayın. Sonrasında hücreleri 335 ×g kuvvetinde ve 4 °C'de beş dakika boyunca pelletleyin. Süpernatant aspire edildikten sonra, splenik eritrositler lize edilirken hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 µL CK lizis tamponu içinde süspanse edin.

Timositleri fax tamponu içerisinde 20 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda süspanse edin ve buz üzerinde bekletin. Hücreleri tekrar santrifüjle çöktürdükten sonra, hücrelerin izotonisitesini sağlamak için beş mililitre HBSS ekleyin; ardından RBC'den arındırılmış peleti fax tamponu içerisinde 20 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Bu adıma alikotlar hazırlayarak başlayın.

96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, akış sitometrisi örneği başına 4 × 10⁶ ayrılmış TİMOSİT ekleyin. Ardından, kompanzasyon kontrolleri için 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarına sitositler ekleyin. Daha sonra, her bir hücre örneğindeki FC reseptörlerini, anti CD 1632 ile buz üzerinde 10 dakika inkübe ederek bloke edin.

Şimdi plakayı santrifüjleyin ve ardından plağı bir kez ters çevirip lavaboya vurarak kuyucuklardaki sıvıyı uzaklaştırın, ardından her kuyucuğu 200 µL fax tamponu ile yeniden süspanse edin ve yıkama işlemini tekrarlayın. Sonrasında, deneysel örnekleri 200 µL antikor kokteyli ile; kompanzasyon kontrollerini ise tekli florokrom konjuge antikorlar ile inkübe edin. Tüm işlemler buz üzerinde, karanlıkta ve fax tamponu içerisinde gerçekleştirilmelidir.

30 dakika sonra, hücreleri iki kez FACS tamponu ile yıkayın ve ardından hücreleri FACS tamponu içinde yeniden süspanse ederek örnekleri, fizyolojik TCR transgenik modellerinde ve yabanıl tip farelerde FACS tüplerine aktarın. Pozitif seleksiyon, çift pozitif sönük evreye geçmeden önce çift pozitif parlak evrede başlar. Antijenle karşılaşmanın ardından çift pozitif sönük timositler, CD4 pozitif CD8 düşük bir geçiş evresine girer ve sonrasında CD4 olur.

Tek pozitif veya CD8 tek pozitif timositler; yüksek TCR ekspresyonları ve CD24 kaybı ile karakterize olgun tek pozitif timositlerdir. CD8/CD4 profili pozitif seleksiyondaki defektleri ortaya çıkarabilirken, TCR beta/CD69 veya CD5 incelemesi defektin nerede olduğu konusunda daha fazla bilgi sağlayabilir. Hem CD69 hem de CD5, TCR stimülasyonundan sonra yukarı regüle edilir ve daha güçlü etkileşimler bu belirteçlerin daha yüksek ekspresyonunu tetikler.

Yabanıl tip bir faredeki bu TCR beta ve CD 69 grafiğinde, TCR beta düşük CD 69 negatif kapısı, seçim öncesi çift pozitif timosit popülasyonunu temsil eder. Buna karşın, TCR beta orta CD 69 pozitif kapısı, TCR etkileşiminden hemen sonraki geçiş popülasyonunu temsil eder ve bazı çift pozitif donuk ile CD 4 pozitif CD 8 düşük hücrelerin yanı sıra çift pozitif parlak hücrelerden oluşur. Burada, TCR beta yüksek CD 69 pozitif kapısı, pozitif seçimden hemen sonraki hücre popülasyonunu örneklendirir; bu popülasyon çift pozitif donuk CD 4 pozitif, CD 8 düşük ve CD 4 tek pozitif hücrelerden oluşur.

Son olarak, bu TCR beta yüksek CD 69 negatif kapısı, öncelikle CD dört ve CD sekiz tek pozitif hücrelerden oluşan daha olgun bir hücre popülasyonunu göstermektedir. TCR R beta orta CD 69 pozitif ve TCR R beta yüksek CD 69 pozitif popülasyonların yokluğu, bozulmuş pozitif seçime işaret edebilir; TCR beta yüksek CD 69 negatif popülasyonu içindeki CD dört tek pozitif hücrelerin CD sekize oranındaki değişiklikler ise soy hattı belirlenmesindeki farklılaşmaları düşündürebilir.

TCR beta yüksek CD 69 pozitif ve TCR beta yüksek CD 69 negatif popülasyonların kaybı, pozitif seleksiyon sonrası hayatta kalma sorunlarını yansıtıyor olabilir. Pozitif seleksiyon öncesi ve sonrası popülasyonları tanımlamak için TCR beta'nın CD 5 ile birlikte incelenmesi bir başka stratejidir. Bu ilk iki popülasyon temel olarak çift pozitif parlak timositlerden oluşur.

TCR beta düşük CD beş düşük popülasyonu, seleksiyon öncesi çift pozitif timositleri temsil eder ve TCR beta orta CD beş orta popülasyonu, pozitif seleksiyonu başlatan hücrelerden oluşur. Bu popülasyonun veya bir önceki popülasyonun oluşumundaki bozulma, kusurlu pozitif seleksiyona işaret eder. Bununla birlikte, TCR beta orta CD beş yüksek popülasyonu, pozitif seleksiyona girme sürecindeki timositleri temsil eder ve öncelikle çift pozitif dull ve CD dört pozitif hücrelerden oluşur.

CD8 düşük timositler. TCR beta yüksek CD5 yüksek popülasyonu öncelikle pozitif seçilim sonrası tek pozitif timositlerden oluşur. CD4 tek pozitiflerin CD8'e oranındaki değişiklikler.

Önceki popülasyonlar normal olmasına rağmen, bu popülasyon içindeki tek pozitif hücreler soy belirleme süreçlerinde değişiklikler olabileceğini düşündürebilir. Ayrıca, bu popülasyonun yokluğu, negatif seçilimin küçük antijen spesifik popülasyonların silinmesini içermesi nedeniyle, pozitif seçilimi takiben timositlerin sağkalımının azaldığını gösterebilir. Bu süreçteki kusurlar, TCR transgenik fareler kullanılarak en iyi şekilde gözlemlenebilir; transgenik H-Y-T-C-R eksprese eden HY CD four fare timositleri, T 3.7 monoklonal antikoru ile tespit edilebilir.

H-Y-T-C-R, MHC Sınıfı bir db içerisinde sunulan erkeğe özgü HY antijenini tanır. Bu nedenle, HY CD dört erkek farelerde, T 3.70 pozitif çift pozitif timosit sayılarındaki azalma ve T 3.7 pozitif CD sekiz tek pozitif timosit sayılarındaki daha belirgin düşüşle belirtildiği üzere, H-Y-T-C-R pozitif timositlerin negatif seçilimi gerçekleşir. Buna karşılık, HY CD dört dişi farelerde T 3.7 pozitif CD sekiz tek pozitif T hücreleri üretmek için pozitif seçim gerçekleşir.

Çift pozitif timosit sayısındaki azalma negatif seçilime işaret etse de, antijene özgü tek pozitif timositlerin yokluğu en doğru ölçüttür. HY CD4 erkek farelerdeki az sayıdaki T3.70 pozitif CD8 tek pozitif timositlerin daha ayrıntılı incelenmesi, çoğunun CD24 yüksek olgunlaşmamış hücreler olduğunu ortaya koymaktadır. HY CD4 dişilerdeki T3.70 pozitif CD8 tek pozitif timositlerin çoğunun olgunluğa ulaştığı ve CD24 düşük olduğu görülürken; bu durum, HY CD4 erkek farelerde negatif seçilimin gerçekleştiğine dair ek destek sağlamaktadır.

TCR transgenik modellerinin bir kısıtlaması, timosit gelişimi boyunca yüksek TCR ekspresyonu nedeniyle TCR ve CD69 veya CD5 ekspresyonuna dayalı popülasyonların belirlenerek pozitif seçilimin daha ayrıntılı karakterize edilmesinin zor olmasıdır; HY CD4 dişi fareler, pozitif seçilime uğrayan geniş bir T3.70 pozitif çift pozitif timosit popülasyonuna sahiptir. Yaban tipine kıyasla CD69 pozitif popülasyondaki artışın gösterdiği üzere, negatif seçilim pozitif seçilime göre daha yüksek afiniteli bir TCR stimülasyonu gerektirir. Bu durum, HY CD4 erkek farelerde T3.70 pozitif çift pozitif timositlerde CD69'un daha yüksek düzeyde eksprese olmasıyla ve bunun sonucunda histogram zirvesinin sağa kaymasıyla kendini gösterir.

Genetik olarak manipüle edilmiş farelerde timik seleksiyon analiz edildiğinde, CD 5 ekspresyonunda da benzer eğilimler görülür. CD 69 veya CD 5 ekspresyonunun incelenmesi, defektin TCR sinyalizasyonunda mı yoksa TCR stimülasyonunun aşağı akış etkilerinde mi olduğunu belirleyebilir. Teknikte uzmanlaşıldığında, hücre hazırlama ve boyama için iki buçuk saat, akış sitometresinde veri toplama için ise ek bir saat yeterli olacaktır.

Doğru şekilde uygulandığında, eklenen her fare yaklaşık 30 dakika ek süre gerektirecektir. Bu prosedürü uygularken, timositlere nazik davranmayı ve boyama stratejinizi önceden planladığınızdan emin olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından.

Dışarı aktarılan timositlerin düzgün çalışıp çalışmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için öldürme analizleri veya sitokin üretim analizleri gibi diğer analizler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi kullanarak timik bölge gelişiminin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.