Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerdeki THY gelişimini akış sitometrisi ile incelemektir. Bu, fare, timus ve dalaktan tek hücreli süspansiyonlar hazırlanarak elde edilir. İkinci bir adım olarak, timositler ve sitler, belirli THY popülasyonlarının tanımlanması için bir antikor kokteyli ile boyanır.

Sonuç olarak, çeşitli lenfosit popülasyonlarının sıklığı ve sayısı akış sitometrik analizi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem, işlevsel ancak hücre toleranslı bir T hücresi repertuarı oluşturmak için hangi genlerin ve yolların önemli olduğu gibi T hücresi gelişimindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem timusta T hücresi gelişimi hakkında bilgi verebilse de, diğer bağışıklık hücrelerinin gelişiminin incelenmesinde de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, akış sitometrisi için antikor kokteyllerinin tasarımında mücadele edeceklerdir. Diseksiyona başlamadan önce, 60 x 15 milimetrelik bir Petri kabına steril bir çelik örgü elek yerleştirin. Daha sonra tabağa beş mililitre HBSS ekleyin ve timusu hasat etmek için tabağı buz üzerinde saklayın.

İlk olarak, sternumun alt ucunu kaldırmak ve diyaframı ortaya çıkarmak için bir çift forseps kullanın. Daha sonra, karaciğerden kaçınarak, göğüs kafesini çıkarmak için diyaframı kesin ve ardından göğüs kafesini her iki taraftan yukarı yönde kesin. Akciğerlerden ve kalpten kaçınmaya özen göstermek.

Şimdi göğüs kafesini nazikçe geri çekmek için forsepsleri kullanın. Timus, kalbin üzerinde bulunan beyaz iki loblu bir organdır. Lobların altını kavramak için forsepsin düz kenarını kullanın.

Ardından timusu yavaşça dışarı çekin ve önceden hazırlanmış örgü eleklerden birine yerleştirin. Dalağı toplamak için, karın boşluğunu ortaya çıkarmak için peritondan bir kesi yapın. Dalak, farenin karın boşluğunun sol tarafında, karaciğerin altında bulunan kırmızı sörf tahtası şeklinde bir organdır.

Daha sonra dalağı çıkarmak için bir çift forseps ve bağ dokusunu uzaklaştırmak için başka bir forseps kullanın. Ardından disseke dalağı ayrı bir ağ ekranına yerleştirin. Şimdi, her bir organı yalnızca bağ dokusu ve yağ kalana kadar ağ süzgecine öğütmek için üç mililitrelik bir şırıngadan pistonu kullanın, hücreleri ve HBSS'yi 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin.

Ardından her bir ağı taze HBS S3 ile durulayın. Daha sonra, hücreleri 335 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca peletleyin. Süpernatan resüsü aspire ettikten sonra, splenik kırmızı kan hücreleri Resus'a yatırılırken sitleri 500 mikrolitrelik bir CK lizis tamponunda oda sıcaklığında 10 dakika süreyle askıya alın.

Timositleri faks tamponunda mililitrede 20 kez 10 ila altı hücrede askıya alın ve buz üzerinde bir kenara koyun. Şimdi, hücreleri tekrar döndürdükten sonra sitleri izotonisiteye döndürmek için beş mililitre HBSS ekleyin, RBC içermeyen peleti faks tamponunda mililitre başına 20 kez 10 ila altıncı hücrede tekrar askıya alın. Bu adıma Ali Watting ile başlayın.

96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna akış sitometrisi numunesi başına ayrılmış THYMOSITTES'in dört kez 10 ila altısı. Daha sonra, kompanzasyon kontrolleri için 96 oyuklu bir plakanın kuyularına sitler ekleyin. Daha sonra, hücre örneklerinin her birindeki FC reseptörlerini, buz üzerinde 10 dakika boyunca anti CD 1632 ile inkübe ederek bloke edin.

Şimdi plakayı aşağı doğru döndürün ve ardından plakayı bir kez yüzü aşağı bakacak şekilde bir lavaboya iterek sıvıyı kuyulardan boşaltın, ardından her bir kuyucuğu 200 mikrolitre faks tamponunda tekrar askıya alın ve yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, kompanzasyon kontrolleri için deneysel numuneleri 200 mikrolitre antikor kokteyli veya tek florokrom konjuge antikorlarla inkübe edin. Hepsi karanlıkta buz üzerinde faks arabelleğinde.

30 dakika sonra, hücreleri faks tamponu ile iki kez yıkayın ve daha sonra hücreleri faks tamponunda tekrar askıya aldıktan sonra, örnekleri fizyolojik TCR transgenik modellerinde ve vahşi tip farelerde faks tüplerine aktarın. Pozitif seçim, çift pozitif donuk aşamaya geçmeden önce çift pozitif parlak aşamada başlar. Antijen çift pozitif donuk timositlerle karşılaştıktan sonra, CD dört olmadan önce bir geçiş CD dört pozitif CD sekiz düşük aşamaya girin.

Tek pozitif veya CD sekiz tek pozitif timositler, matür tek pozitif timositler, yüksek TCR ekspresyonu ve CD 24 kaybı ile karakterizedir. CD sekizli CD dört profili pozitif seçimdeki kusurları ortaya çıkarabilirken, TCR beta'yı CD 69 veya CD beş ile incelemek, kusurun nerede olduğu konusunda daha fazla bilgi sağlayabilir. Hem CD 69 hem de CD beş, TCR stimülasyonundan sonra daha güçlü etkileşimlerle bu belirteçlerin daha yüksek ekspresyonunu sağlayan yukarı regüle edilir.

Yabani tip bir farede CD 69'a göre bu TCR beta grafiğinde, TCR R beta düşük CD 69 negatif yürüyüş, ön seçim çift pozitif timosit popülasyonunu temsil eder. Oysa bu TCR beta ara CD 69 pozitif yürüyüş, TCR katılımından hemen sonra bir geçiş popülasyonunu temsil eder ve bazı çift pozitif donuk ve CD dört pozitif CD sekiz düşük hücreli çift pozitif parlaktan oluşur. Burada TCR R beta yüksek CD 69 pozitif yürüyüşü, çift pozitif donuk CD dört pozitif, CD sekiz düşük ve CD dört tek pozitif hücreden oluşan pozitif seçimden hemen sonra hücre popülasyonunu gösterir.

Son olarak, bu TCR beta yüksek CD 69 negatif yürüyüş, esas olarak CD dört ve CD sekiz tek pozitif hücrelerden oluşan daha olgun bir hücre popülasyonu gösterir. TCR R beta orta CD 69 pozitif ve TCR R beta yüksek CD 69 pozitif popülasyonlarının yokluğu, CD dört tek pozitifin CD sekize oranındaki bozulmuş pozitif seçim değişikliklerinin göstergesi olabilir. TCR beta yüksek CD 69 negatif popülasyonundaki tek pozitif hücreler, soy bağlılığında değişiklikler önerebilir.

TCR beta yüksek CD 69 pozitif ve TCR beta yüksek CD 69 negatif popülasyonlarının kaybı, pozitif seçimi takiben sağkalım sorunlarını yansıtabilir. TCR beta'yı beşinci CD'ye göre incelemek, pozitif seçim öncesi ve sonrası popülasyonları belirlemek için başka bir stratejidir. Bu ilk iki popülasyon esas olarak çift pozitif parlak timositlerden oluşur.

TCR beta düşük CD beş düşük popülasyonu, ön seçim çift pozitif timositleri temsil eder ve TCR beta ara CD beş ara popülasyonu, pozitif seçimi başlatan hücrelerden oluşur. Bu veya önceki popülasyonun bozulmuş nesli, kusurlu pozitif seçilimi düşündürür. Bununla birlikte, TCR R beta ara CD beş yüksek popülasyonu, pozitif seçilim sürecinde timositleri temsil eder ve esas olarak çift pozitif donuk ve CD dört pozitiften oluşur.

CD sekiz düşük timosit. TCR beta yüksek CD beş yüksek popülasyonu esas olarak post pozitif seçilimden oluşur. Tek pozitif timositlerin CD dört, tek pozitif ile CD sekiz oranında değişiklikler olur.

Bu popülasyondaki tek pozitif hücreler, normal önceki popülasyonlara rağmen, soy bağlılığında değişiklikler önerebilir. Ayrıca, bu popülasyonun yokluğu, negatif seçilimi takiben timositlerin sağkalımının azaldığını gösterebilir, çünkü negatif seçilim, küçük antijene özgü popülasyonların silinmesini içerir. Bu süreçteki kusurlar en iyi HY CD'de TCR transgenik fareler kullanılarak gözlenir: transgenik H-Y-T-C-R'yi eksprese eden dört fare timositi, monoklonal antikor T 3.7 ile tespit edilebilir.

H-Y-T-C-R, MHC Sınıf bir db içinde sunulan erkek spesifik HY antijenini tanır. Bu nedenle, HY CD dört erkek fare, T üç nokta 70 pozitif çift pozitif THYMOSIT sayısında bir azalma ve T 3.7 pozitif CD sekiz, tek pozitif thy sit sayılarında daha dramatik bir azalma ile gösterildiği gibi H-Y-T-C-R pozitif timositlerin negatif seçimine tabi tutulur. Buna karşılık, HY CD dört dişi fare, T 3.7 pozitif CD sekiz tek pozitif T hücresi oluşturmak için pozitif seçime tabi tutulur.

Çift pozitif thy sayılarındaki azalma negatif seçilimin göstergesi iken, antijene özgü tek pozitif timositlerin yokluğu en doğru ölçümdür. HY CD dört erkek farede birkaç T üç nokta 70 pozitif CD sekiz tek pozitif timositin daha fazla incelenmesi, çoğunun CD 24 yüksek olgunlaşmamış hücreler olduğunu ortaya koymaktadır. HY CD dört dişide çoğu T üç nokta 70 pozitif CD sekiz tek pozitif timosit olgunluğa ulaşmış ve CD 24 düşük iken, negatif seçilim HY CD dört erkek farede meydana gelir.

TCR transgenik modellerinin bir uyarısı, CYTE gelişimi boyunca yüksek TCR ekspresyonu nedeniyle TCR ve CD 69 veya CD beş ekspresyonuna dayalı popülasyonları tanımlayarak pozitif seçilimi daha fazla karakterize etmenin zor olmasıdır, HY CD dört dişi fare, pozitif seçime uğrayan büyük bir T üç nokta 70 pozitif çift pozitif timosit popülasyonuna sahiptir. Vahşi tip negatif seçilime kıyasla CD 69 pozitif popülasyonundaki bir artışla gösterildiği gibi, pozitif seçilimden daha yüksek bir afinite TCR uyaranı içerir. Bu, HY CD dört erkek farede T üç nokta 70 pozitif çift pozitif timositlerde CD 69'un daha yüksek ekspresyonu ile gösterilir ve bu da histogram zirvesinin sağa kaymasına neden olur.

Genetik olarak manipüle edilmiş farelerde timik seçilimi analiz ederken CD beş ekspresyonu ile benzer eğilimler görülür. CD 69 veya CD beş ekspresyonunun incelenmesi, kusurun TCR sinyalizasyonundan mı yoksa TCR stimülasyonunun aşağı akış sonucundan mı kaynaklandığını belirleyebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik hücre hazırlığı ve boyama için iki buçuk saat içinde ve ayrıca akış sitometresinde veri toplama için ek bir saat içinde gerçekleştirilebilir.

Doğru yapılırsa, her ek fare yaklaşık 30 dakika ekleyecektir. Bu prosedürü denerken, timositleri nazikçe tutmayı unutmamak ve boyama stratejisini önceden planladığınızdan emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben.

İhraç edilen timositlerin düzgün çalışıp çalışmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için öldürme tahlilleri veya sitokin üretim tahlilleri gibi diğer tahliller yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi kullanarak timik bölge gelişiminin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.