Name: 1 F O ATPaz veziküllü Hazırlık ve Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, sıçan beyninden F1FO ATPaz içeren submikondriyal veziküller izole etmeyi ve patch clamp kaydı ile aktivite modülasyonunu incelemeyi. Bu yöntem mitokondriyal fonksiyon ve ATP sentezi mekanizmalarını detaylı analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Beyin Mitokondriyal İzolasyon (Kahverengi MR ve ark uyarlanmıştır. 9) <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmış yöntemler kullanarak sıçan Kurban. </li><li> Dekapitasyon hayvanın baş kesme, deri kesme ve kafatası maruz kalmaktadır. </li><li> Bir makas veya rongeur ile keserek hafifçe kafatası açın. Beyin çıkarın. </li><li> İzolasyon Tampon beyincik (bkz. Tablo 1) olmadan ince beyin kıyma ve 5 ml cam / teflon homojenizatör (donanım listesini görmek) aktarın. </li><li> Doku hafifçe 10 kez (hava kabarcığı), yaklaşık 5 dakika homojenize. </li><li> 4 10 dakika ° C bir tezgah üstü santrifüj için 1500 × g örnek santrifüj. </li><li> Süpernatant kaydedin (mitokondriyal ve sinaptozomlarda) ve pelet (nükleer malzeme ve hücre artıkları) atın. Bir tezgah üstü santrifüj 4 ° C&#39;de 10 dakika 16.000 × g santrifüj. </li><li> Iskartasüpernatan ve yeniden askıya İzolasyon Tampon 500 ul pelet. Bir hücre parçalama gemi (donanım listesini görmek) ile sinaptozomlarda bozabilir. Hızlı bir dekompresyon takiben 10 dakika boyunca 1,200 psi&#39;lik bir basınç uygulanır. </li><li> 126.500 de Katman Ficoll geçişlerini üzerine karışımı (bkz. Tablo 2), GB-50.1 rotor ve santrifüj yer × g 4 az 20 dakika ° bir ultrasantrifüjdeki C (donanım listesine bakınız). Topak, saflaştırılmış mitokondri olan, Ficoll farklı yoğunlukları arasındaki katman undisrupted sinaptozomlarda olup. </li><li> 16.000 de İzolasyon Tampon santrifüj × g 4 10 dakika ° C için bir tezgah üstü santrifüj pelet yıkayın. </li></ol> 2. Submitochondrial Veziküller (SMV) İzolasyon (Chan ve ark. 10 uyarlanmıştır) <ol><li> % 1 digitonin bir eşit hacmi ile birleştirilmiş 200 ul izolasyon Tamponu içinde yeniden askıya mitokondri ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. </li><li> Daha İzolasyon Buff ekle16.000 de er ve santrifüj × 4 10 dakika g ° bir tezgah üstü santrifüj C. Iki kez yapın. </li><li> 200 ul İzolasyon Tampon pelet yeniden askıya ve 10% Lubrol PX (C12E9) 2 ul ekleyin. Karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. </li><li> 182.000 de İzolasyon Tampon, GB-50.1 rotor yer ve santrifüj üzerine Katman karışım × 4 de g ° 1 saat C. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika 16.000 de izolasyonu Tampon bir masa üstü santrifüj × g santrifüj son pelet yıkayın </li></ol> 3. Elektrofizyolojik Kayıt <ol><li> Tipik bir elektrofizyoloji teçhizat bir amplifikatör, pClamp10.0 yazılım, manipülatörler, bir mikroskop, bir titreşim izolasyonu tablo, Faraday Kafesi ile birlikte bir Digidata 1440A analog-dijital dönüştürücü arayüzü ile donatılmış bir PC bilgisayar içerir. </li><li> Borosilikat cam kapiller tüplerin bir Flaming / Brown Mikropipet Çektirme Model P-87 eklenir. Bir pipet-çektirmenin programı için optimize edilmiştirMQ 80 ila 100 arasında dirençleri ile pipetler oluşturmak. </li><li> SMVS fizyolojik bir hücre içi çözelti (ATP kayıt sırasında uygun bir zamanda ilave edilir) (Tablo 3) yerleştirilir. Yama kelepçe pipetler aynı çözeltisi (ATP yok) ile doldurulur. Kayıtlar, oda sıcaklığında SMVS üzerine bir Giga-ohm mühür oluşturarak yapılır. Veziküller bir Nikon veya Zeiss ters mikroskop ile faz-kontrast mikroskobu ile görüntülenmiştir. </li><li> Membran potansiyeli -100 mV ile yaklaşık 10 saniye süre + 100 mV arasında değişen voltaj &#39;de muhafaza edilmektedir. Kayıtlar amplifikatör devresi kullanarak 5 kHz filtrelenir. Az 1 pA bir sokak elektrikli veya spesifik olmayan gürültü seviyesi Başarılı kayıt için arzu edilir. </li><li> Veriler tek bir kanal frekansı ve amplitüdü belirlemek etkinlikleri örneğin Clampfit 10.0 yazılımı ile analiz edilmiştir. Voltaj bağımlı bir akım voltaj ilişkisi çizilmesi ile belirlenir. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yöntemler de gösterildiği gibi, burada bu yöntem ile phenotypes.SMVspurified hücre ayrımı olmaksızın bütün beyin 2 adımından sonra, adım 1 ve submitochondrial veziküller (SMVS) sonunda, diğer hücre organelleri kirlenme, esasen saf mitokondri izolasyonu sağlamak tarif edilmektedir Şekil 1 ve daha önceki çalışmaları (Alavian KN ve ark. 8) ve önceki donma kendi yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünü korumak. Dondurma ve çözme sonra, mitokondri izole veya SMVS kayıtları ve biyokimyasal deney...

<table><tbody><tr><td>PTFE Tokmaklı Potter-Elvehjem Doku Öğütücü</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>4639 Hücre Parçalama Kabı</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>SW-50.1 rotor </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-70M Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipülatör</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kapiler</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Mikropipet Çekici Model P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</subsubmitochondrial veziküllü membranların patch kelepçe kayıtlar sahne&gt; atpaz veziküllü hazırlık ve tekniği

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitokondri metabolizma, hayatta kalma 1, geliştirme ve, kalsiyum 2 sinyalizasyon dahil olmak üzere birçok önemli hücresel fonksiyonları olarak katılıyor. En önemli mitokondriyal fonksiyon iki ATP, oksidatif fosforilasyon ile hücrenin enerji birimi, ve programlanmış hücre ölümü 3 için sinyallerin arabuluculuk verimli üretimi ile ilgilidir. ATP üretimi için öncelikle sorumlu enzim aynı zamanda ATP sentetaz 4-5 adı F1FO-ATP sentetaz vardır. Son yıllarda, apoptotik ve nekrotik hücre ölümü mitokondri rolünü oldukça dikkat çekmiştir. Apoptotik hücre ölümü, böyle Bax gibi BCL-2 ailesi proteinleri, mitokondriyal dış membran girin oligomerleşip ve sitoplazmada 6 içine pro-apoptotik faktör serbest, dış membran geçirgenliği. Klasik nekrotik hücre ölümü, böyle nöronlarda iskemi veya eksitotoksisite, bir larg tarafından üretilen bu kadarmatris kalsiyum e, kötü düzenlenmiş artış bir iç membran gözenek, mitokondriyal geçirgenlik gözenek veya mPTP açılmasına katkıda bulunur. Bu iç zarı depolarize ve dış membran rüptürü, pro-apoptotik faktörlerin serbest bırakılması ve metabolik fonksiyon bozukluğu katkıda, ozmotik vardiya neden olur. Bcl-xL 7 de dahil olmak üzere birçok protein F1FO ATP sentaz, modüle işlevi ile etkileşim. Bcl-xL F1FO ATP sentaz beta alt birimi ile doğrudan etkileşim ve bu etkileşimin F1FO ATPaz aktivitesi 8 sırasında F1FO tarafından H + net taşıma ve böylece artan mitokondriyal verimliliğin artırılması, F1FOATPasecomplex içinde sızıntı iletkenlik azalır. ATP sintaz aktivitesi ve modülasyon incelemek için, F1FO ATPaz içeren kemirgen beynindeki submitochondrial veziküller (SMVS) izole edilmiştir. Alavian ark gösterildiği gibi SMVS F1FO ATPaz&#39;ın yapısal ve işlevsel bütünlüğünü korumak. Burada, bir yöntem tarifsıçan beyin SMVS en izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanmış ve biz SMVS bir (iyon kaçak iletkenlik) kanal aktivitesini analiz etmek için yama kelepçe tekniği tasvir olduğunu.

Bizim protokol ilk adım, Şekil 1&#39;de Western Blot ile gösterildiği gibi, mitokondri, saflaştırılmış izolasyonu sağlar. Şekil 2&#39;de, bir beyin türevli submitochondrial vezikül yama kayıt bir örneği gösterilmektedir. Iç-dış yama yapılandırma kullanarak biz ATP tarafından modüle kanalı faaliyet göstermektedir. Kontrol (CTL) kayıt (sol) ortalama 600 pS bir tepe iletkenlik özelliğine sahip çok-kanallı iletkenliği aktivite göstermektedir. derhal banyosuna 1 mM ATP ilavesiyle azaltıldı. ...

Fare beyninden alınan F1FO ATP sentetaz kompleksleri zenginleştirilmiş submitochondrial veziküller izole etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu veziküller F1FO ATPaz karmaşık yama kelepçe kayıt tekniği kullanarak modülasyon aktivitesi çalışma sağlar.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial veziküllü Membranların Patch Kelepçe Kayıtlar Sahne&gt; ATPaz veziküllü Hazırlık ve Tekniği

Mitokondriler; metabolizma, sağkalım1, gelişim ve kalsiyum sinyallemesi2 dahil olmak üzere birçok önemli hücresel fonksiyonda rol oynar. En önemli iki...

Bu prosedürün genel amacı, patch clamp kayıtları gerçekleştirmek için sıçan beyninden F1 F sıfır APA veziküllerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle beynin sıçandan çıkarılması ve homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, basınç uygulayarak sinaptik bölgelerin parçalanmasıdır.Ardından, sinaptozomlar flakon gradyanları üzerine katmanlanır. Son adım, patch clamp kaydı için nihai vezikülleri elde etmek amacıyla digitonin ve L ile inkübe etmektir. Mitokondrilerin önemli bir işlevi, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimidir.ATP üretiminden sorumlu olan enzim, mitokondri iç membranında yer alan ATP sentazdır. ATP sentaz fonksiyonunu ayrıntılı olarak incelemek için, SMV'ler olarak adlandırdığımız özel submikondriyal veziküller izole ederiz. Bunlar, ATP sentaz enzimini ters yüz edilmiş bir konfigürasyonda içerir.Ardından bu SMV'leri bir patch clamp elektrodu ile kaydeder ve membranlarının sızıntılılık düzeyini belirleriz. Bu durum, mitokondriler tarafından gerçekleştirilen TP üretiminin verimliliği hakkında bize bilgi verir. Bu prosedürü bugün, Yale Üniversitesi'ndeki laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Sylvia ti gösterecektir.Bu prosedürde, bir sıçanın başı dekapi̇tasyon yoluyla alındıktan sonra, kafatası açığa çıkarılacak şekilde deri kesilir ve ardından kafatası bir makas veya Rons ile nazikçe kesilerek açılır. Sonrasında beyin çıkarılır, cerebellum hariç beyin dokusu küçük parçalara ayrılır, nihayetinde izolasyon tamponuna alınır ve ardından beş mililitrelik cam Teflon homojenizatöre aktarılarak doku 10 kez, toplamda yaklaşık beş dakika boyunca nazikçe homojenize edilir. Bundan sonra örnek, bir masaüstü santrifüjde dört derece Celsius'ta 1.500 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjlenir.Mitokondri ve sinaptozom içeren süpernatantı saklayın ve peleti atın. Ardından, örneği bir masaüstü santrifüjde 4 °C'de, 10 dakika boyunca 16.000 ×g hızında tekrar santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantı atın ve peleti 500 µL izolasyon tamponunda yeniden süspande edin; bir hücre parçalama kabı kullanarak 1.200 PSI basınç uygulayarak 10 dakika boyunca sinaptozomları parçalayın ve ardından hızlıca basıncı düşürün. Parçalanmış sinaptozomları, iki katman oluşturacak iki farklı Ficoll konsantrasyonu içeren santrifüj tüplerinin üzerine katmanlar halinde ekleyin.Ardından tüpleri bir SW 50.1 rotoruna yerleştirin ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 126.500 ×g'de santrifüjleyin. Ultra santrifüjde, pelet saflaştırılmış mitokondrileri temsil eder. Flakonun farklı yoğunlukları arasındaki tabaka ise bozulmamış sinaptozomdur.Ardından, pellet'i ayrı bir santrifüj işlemine tabi tutarak izolasyon tamponu ile yıkayın. Bir masaüstü santrifüj kullanarak 4 °C'de 10 dakika boyunca 16,000 ×g değerinde santrifüjleyin. Şimdi, mitokondrileri 200 µL izolasyon tamponu ve buna eş değer hacimde %1 digitonin karışımında resüspande edin.15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından, daha fazla izolasyon tamponu ekleyin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g'de santrifüjleyin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın, ardından pellet'i 200 µL izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin, 2 µL %10'luk Lu bra, PX karışımı ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Ardından, karışımı santrifüj tüplerindeki izolasyon tamponu üzerine katmanlar halinde ekleyin. Tüpleri bir SSW 50.1 rotoruna yerleştirin ve dört derece santigrat sıcaklıkta, bir saat boyunca 182.000 ×g hızında santrifüjleyin. Bir saatin ardından.Final peleti, izolasyon tamponu içerisinde 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g kuvvetinde santrifüj ederek yıkayın. Tipik bir elektrofizyoloji düzeneği; bir amplifikatör, DigiData 1440 ile donatılmış bir PC bilgisayar, pClamp 10.0 yazılımı ile birlikte kullanılan bir analog-dijital dönüştürücü arayüzü, manipülatörler, bir mikroskop, bir titreşim izolasyon masası ve bir Faraday kafesi içerir. İlk olarak, bir flaming brown mikro pipet çekici kullanarak borosilikat cam kılcal tüpten bir pipet çekin.Pipetin optimal direnci 80 ile 100 mega ohm arasında olmalıdır. Submitokondriyal vezikülleri fizyolojik bir hücre içi çözeltiye ekleyin. Ardından, bir patch clamp pipetini aynı çözelti ile doldurun.Faz kontrast mikroskopisi altında vezikülleri görüntüleyin. SMV'ler oda sıcaklığında patch edildikten sonra mikroskopi işlemini gerçekleştirin. Membran potansiyeli, her periyot için 10 saniye boyunca -100 mV ile +100 mV aralığındaki voltajlarda tutulurken aktiviteyi kaydedin.Kaydedilen veriler, amplifikatör devresi kullanılarak beş kilohertz'de filtrelenmiş ve Clamp Fit 10.0 yazılımı ile analiz edilmiştir. Bu şekil, sitozol ve mitokondriden hazırlanan lizatın blotunu göstermektedir. Üst panel, sitozolik protein GA dh'ye karşı bir antikor kullanılarak yapılan immünoblot'u göstermektedir.Alt panel, mitokondriyal iç membran proteini Cox dört karşıtı bir antikor kullanılarak yapılan blotu göstermektedir. Burada, 1 mM ATP eklenmesi öncesi ve sonrası kaydedilmiş iki temsili patch clamp kaydı yer almaktadır. Tutma potansiyeli +70 mV'dur. Kesikli çizgi 0 pA değerini temsil etmektedir.Her bir iz 10 saniye boyunca kaydedilir ve izler arasında 10 saniye bulunur. Burada, SMV'lerin varlığında ve bir TP'nin yokluğunda ve varlığında A CMA indikatörünün floresan yoğunluk değişimlerinin zamana bağlı örnek izleri gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, mitokondrilerin ve F1 FO 80 TP Sentetaz içeren alt mitokondriyal veziküllerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, ATP Sentetaz Kompleksinin kanal aktivitesini analiz etmek için vezikül membranında bir elektrot ile form I dirençli mühürlemenin nasıl yapılacağını anlamalısınız.

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

TRPV4 en incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler tamamlamak için, iki yöntem tarif edilmiştir: Onun mechanosensitivity hipo-ozmotik tehdidi üzerine transgenik maya Ca 2 +-akorinden luminometri ele alınabilir. Ayrıca TRPV4-RNA incelenebilir on-hücre ya da kesilmiş modunda kelepçe bütün hücre iki elektrotlu voltaj kelepçe veya yama ile Xenopus oosit enjekte edilir.

Maya lüminometrik ve Xenopus Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Bu yöntem makalesi, mitokondrinin termojenik kapasitesini incelemek için yeni bir yaklaşım olan yama-kelepçe tekniği ile iç mitokondriyal membran boyunca H + sızıntısını ölçmedeki ana adımları detaylandırmaktadır.

Mitokondrinin Termojenik Kapasitesini İncelemek için Yama-Kelepçe Tekniğinin Kullanımı

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Bu yöntem, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlikli proton sızıntısına katkısından, vahşi tip kontrolüne kıyasla artmış kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğine sahip yenidoğan kırılgan X sendromlu farelerde gözenek açılması için voltaj eşiğini belirlemek için kullanır.

Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Bu protokol, manuel bir endolizozomal yama-kelepçe sistemi kullanarak hücre içi veziküller üzerindeki iyon kanalı aktivitesini doğrudan ölçmek için bir yöntemi detaylandırır. Endolizozomların büyütülmesini ve bu veziküllerin manuel olarak izole edilmesini içeren yöntemi gösteriyoruz. Bu yaklaşım, araştırmacıların prosedürü doğru bir şekilde tekrarlayabilmelerini ve uygulayabilmelerini sağlar.

Tek Endolisozomal Vezikül Analizi için Yama-Klemp Teknikleri

Öğrenin, sıçan beyninden F1FO ATPaz içeren submikondriyal veziküller izole etmeyi ve patch clamp kaydı ile aktivite modülasyonunu incelemeyi. Bu yöntem mitokondriyal fonksiyon ve ATP sentezi mekanizmalarını detaylı analiz etmeyi sağlar.

Daha fazla video keşfet