1 F O ATPaz veziküllü Hazırlık ve Tekniği

Bu prosedürün genel amacı, yama kelepçe kayıtlarını gerçekleştirmek için F1 F sıfır APA veziküllerini sıçan beyninden izole etmektir. Bu, önce beyni bir fareden çıkararak ve onu homojenleştirerek gerçekleştirilir. İkinci adım, basınç uygulayarak sinaptik bölgeleri bozmaktır.

Daha sonra, sinaptozom fial gradyanlar üzerine katmanlanır. Son adım, yama kelepçesi kaydı için son vezikülleri elde etmek için rakam toin ve L ile inkübe etmektir. Mitokondrinin önemli bir işlevi, oksidatif fosforilasyon yoluyla bir TP üretimidir.

Bir TP üretiminden sorumlu enzim, mitokondriyal iç zarda bulunan A TP sentazdır. A TP sentaz fonksiyonunu ayrıntılı olarak incelemek için, SMV dediğimiz özel alt mitokondriyal vezikülleri izole ediyoruz. İçten dışa bir konfigürasyonda A TP sentaz enzimi içerirler.

Daha sonra bu SMV'leri bir yama kelepçe elektrodu ile kaydediyoruz ve zarlarının sızıntılığını belirliyoruz. Bu bize mitokondri tarafından bir TP üretiminin verimliliği hakkında bilgi verir. Bugün bu prosedürü gösteren, Yale Üniversitesi'ndeki laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Sylvia ti olacak.

Bu prosedürde, bir farenin kafasını keserek elde ettikten sonra, kafatasını ortaya çıkarmak için cildi kesin, ardından kafatasını bir makas veya Ron ile keserek nazikçe açın. Daha sonra beyni çıkarın, beyincik son olarak izole edilmeden beyni kıyın, tamponlayın, ardından dokuyu 10 kez, toplamda yaklaşık beş dakika nazikçe homojenize edin, ardından beş mililitrelik bir cam Teflon homojenizatöre aktarın. Bundan sonra, numuneyi bir tezgah üstü santrifüjde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı mitokondri ve sinaptozom ile kurtarın ve peleti atın. Daha sonra 16.000 kez tekrar santrifüjleyin, G'de 10 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüjde dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve damağı yeniden süspanse edin 500 mikrolitre izolasyon tamponunda, 10 dakika boyunca 1.200 PSI'lik bir basınç uygulayarak sinaptozomu bir hücre bozulma kabı ile bozun, ardından hızlı dekompresyon katmanı, bozulmuş sinap bölgelerini santrifüj tüplerine iki farklı konsantrasyonda olacak iki farklı fial konsantrasyonu ile katmanlayın.

Daha sonra tüpleri bir SW 50.1 rotoruna yerleştirin ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 126.500 kez G'de santrifüjleyin. Ultra santrifüjde damak, saflaştırılmış mitokondridir. Fial'in farklı yoğunlukları arasındaki katman, bozulmamış sinaptozomdur.

Daha sonra, peleti izolasyonda santrifüj ederek yıkayın. Bir tezgah üstü santrifüjde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de tamponlayın. Şimdi Resus, mitokondriyi 200 mikrolitre izolasyon tamponunda askıya alın, eşit hacimde% 1 basamaklı toin ile birleştirildi.

15 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Daha sonra, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de daha fazla izolasyon, tampon ve santrifüj ekleyin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın, ardından damağı 200 mikrolitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve iki mikrolitre %10 Lu sütyen, PX ekleyin, karıştırın ve 15 dakika buzun üzerine koyun.

Bundan sonra, karışımı izole bir şekilde katmanlayın, santrifüj tüplerinde tamponlayın. Tüpleri bir SSW 50.1 rotoruna yerleştirin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede 182.000 kez G'de santrifüjleyin. Bir saat sonra.

Son paleti, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de izolasyon tamponunda santrifüjleyerek yıkayın. Tipik bir elektrofizyoloji teçhizatı, bir amplifikatör, bir digi veri 1, 440 ile donatılmış bir PC bilgisayarı, P kelepçesi ile birlikte bir analogdan dijitale dönüştürücü arayüzü, 10.0 yazılım manipülatörleri, bir mikroskop, bir titreşim izolasyon masası ve bir faraday kafesi içerir. İlk olarak, yanan kahverengi bir mikro pipet çektirmede bir Boros silikat cam kılcal tüpten bir pipet çekin.

Pipetin optimum direnci 80 ila 100 mega ohm arasında olmalıdır. Alt mitokondriyal vezikülleri fizyolojik bir hücre içi çözelti içinde ekleyin. Ardından bir yama kelepçesi pipetini aynı solüsyonla doldurun.

Vezikülleri faz kontrastı altında görselleştirin. SMV'ler oda sıcaklığında yamalandıktan sonra mikroskopi. Membran potansiyeli, her periyotta 10 saniye boyunca negatif 100 milivolt ile pozitif 100 milivolt arasında değişen voltajda tutulduğunda aktiviteyi kaydedin.

Kaydedilen veriler, amplifikatör devresi kullanılarak beş kilohertz'de filtrelenir ve clamp fit 10.0 yazılımı ile analiz edilir. Bu şekil, sitozol ve mitokondriden hazırlanan lizat lekesini göstermektedir. Üst panel, sitozolik protein GA dh'ye karşı bir antikor kullanan bir immün leke gösterir.

Alt panel, mitokondriyal iç zar proteinine karşı bir antikor kullanan bir leke gösterir. Cox dört: İşte bir milimolar bir TP eklenmesinden önce ve sonra iki temsili yama kelepçesi kaydı. Tutma potansiyeli pozitif 70 milivolttur. Kesikli çizgi sıfır pikoamperi temsil eder.

Her iz 10 saniye boyunca kaydedilir ve izler arasında 10 saniye vardır ve gösterilir. Burada, SMV'lerin varlığında ve bir TP'nin yokluğunda ve varlığında A CMA göstergesinin zaman içindeki floresan yoğunluğu değişikliklerinin örnek izleri verilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, F1 FO 80 TP Sentezleri içeren bir alt mitokondri vezikülü olan mitokondriyi nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, A TP Syntase Kompleksinin kanal aktivitesini analiz etmek için vezikül zarı üzerinde bir elektrot ile form I dirençli sızdırmazlığı anlamalısınız.