Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik zebra balıklarının sinaptik ve uyarılabilirlik özelliklerini kaydetmektir. Bu, önce arka beynin ventral yüzeyini ortaya çıkarmak için zebra balığı embriyosunun diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, diseke edilen preparatörü bir yama kelepçe mikroskobunun aşamasına yerleştirmek ve hücrelerindeki ağzı tanımlamaktır.

Sonraki yama. Uygun kayıt modunu kullanarak M hücrelerine kenetleyin ve sinaptik aktivite ve uyarılabilirlik özelliklerini kaydedin. Son adım, sinaptik veya uyarılabilirlik özelliklerini belirlemek için kaydedilen verileri analiz etmektir.

Sonuç olarak, bu hücrelerden yama klemplenmesi, gelişmekte olan bir organizmada sinaptik reseptörlerin özelliklerini göstermek için kullanılır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireylerin iki ana zorluk alanı olacaktır. Birincisi diseksiyondur.

Konser sahnesinin ikinci oluşumu zorlu olabilir. Bu yöntem için ilk olarak, arka beynin omuriliğe bağlı olduğu bir zebra balığı preparatı üzerinde çalışmaya karar verdiğimde aklıma geldi, bu da prosedürün laboratuvarımda doktora yüksek lisans öğrencisi olan burram Roy olacağını gösteriyor, Bu prosedüre Sard ile kaplı diseksiyon kabını hazırlayarak başlayın. İlk olarak, rondelaları slayda gres ile sabitleyin.

Ardından yıkayıcının ortasına sıvı sard ekleyin. Sard genellikle gece boyunca sertleşir ve cam slayt üzerinde küçük dairesel bir yatak oluşturur, bu da diseksiyon kabının tabanı haline gelir. Lam üzerine bir kapak fişi yerleştirdikten sonra, diseksiyon için temel görevi görmesi için slaydı kayıt odasına yerleştirin.

Daha sonra gerekli çözümleri hazırlayın. Hücre dışı solüsyonlar oda sıcaklığında bırakılmalı, hücre içi solüsyonlar ise steril tutulmalıdır. Hücre içi çözeltiye sarı için% 0.1 gevşek eklenebilir, böylece hücre kimliğini doğrulamak için deneyin sonunda M hücresi morfolojisinin görselleştirilmesi gerçekleştirilebilir.

Daha sonra, yabani tip zebra balığı embriyolarını 28.5 santigrat derecede yumurta suyunda büyütün ve önceki yayına göre toplayın ve sahneleyin. Diseksiyon için, embriyoları aynı zamanda kayıt odası olarak da hizmet veren diseksiyon kabına aktarın. Sonra onları yedi ila 10 dakika uyuşturun.

Fizyolojik saline çok yakın olan bir anestezi tuzu çözeltisinde, hafif bir kuyruk tutamına verilen yanıtı inceleyerek yeterince uyuşturulup uyuşturulmadıkları belirlenebilir. Daha sonra, embriyoları hiçbir uyum olmadan ve 25 x büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altında 0.001 inç tungsten tel ile SIL koruma hattı çanağına sabitleyin. Diseksiyonu gerçekleştirmek için diseksiyon dürbünündeki büyütmeyi 40 ila 50 x arasında ayarlayın.

Şimdi, ince bir çift forseps kullanarak çeneyi, gözleri ve ön beyni çıkarın. Düğüm kordonu ile beyin arasındaki forsepsleri dikkatlice çalıştırarak arka beyni alttaki düğüm kordonundan nazikçe soyun. Ardından, ventral yüzey yukarı bakacak şekilde arka beyni nazikçe ters çevirin.

Bu konumlandırma, genellikle genç embriyolarda ventral yüzeyin beş ila 10 mikrometre yakınında ve yaşlı larvalarda 20 ila 50 mikrometre içinde bulunan M hücrelerine iyi erişim sağlar. Ardından, hazırlığı, yama kelepçesi deneyinin gerçekleştirilebileceği kayıt kurulumuna dikkatlice taşıyın. M hücreleri, diferansiyel girişim kontrastı ile görselleştirilir, ancak yama klemplemesine hazırlanmak için diğer görüntüleme modları da kullanılabilir.

İnce duvarlı bo silikat camlı bazı yama CLA pipetlerini çekerek başlayın. Yatay bir çekmede pipet ucu çapları, yangınla parlatmadan sonra pürüzsüz bir kenara kadar yaklaşık 0,2 ila 0,4 mikrometredir ve sap konikliği yaklaşık dört milimetre uzunluğundadır. Pipet ucunu hücre içi sıvıya batırarak hücre içi solüsyonla doldurun.

Daha sonra pipete bir şırınga iğnesi yerleştirin ve hücre içi çözeltiyi şırıngadan yavaşça çıkarın. Pipeti doldurmayı bitirmek için, pipeti amplifikatör kafası aşamasına takın Elektrofizyoloji kurulumunda, baş aşamasını yatay eksene kabaca 45 derecelik bir açıda tutmak önemlidir, çünkü bu, pipet banyo solüsyonuna inmeden hemen önce ağızları hücrelerinde olacak şekilde yüksek dirençli contaların oluşumu için uygun pipet için uygun bir giriş açısı sağlar, Ucun tıkanma olasılığını azaltmak için pipete az miktarda pozitif basınç uygulayın. Pipette az miktarda pozitif basınçla M hücresine yaklaşmaya devam edin.

Pozitif basınç, hücreyi nazikçe bir yandan diğer yana iter ve hemen hücrenin üzerine yerleştirildiğinde hücre zarı üzerinde küçük bir çukur oluşturur. Şimdi, pipet ile zar arasında güçlü bir sızdırmazlık oluşabilmesi için hücre yüzeyini nazikçe temizlemek için pipeti birkaç saniye yerinde bırakın. Ardından, sızdırmazlığı başlatmak için pipetteki pozitif basıncı boşaltın.

Negatif pipet potansiyeli ile birleşen az miktarda negatif basınç, birkaç saniye içinde giga contaların oluşmasına neden olur. Daha sonra, amplifikatördeki tutma potansiyelini eksi 60 milivolt olarak değiştirin. Hücre zarını bir dizi kısa emme darbesi ile yırtın.

Ardından hemen membran potansiyellerini kaydedin ve kapasitans artefaktlarını en aza indirin. Hücre kapasitansını ve erişim direncini% 70 ila% 85 oranında telafi edinErişim direnci her 30 saniyede bir ila bir dakika arasında izlenmelidir ve% 20 veya daha fazla bir değişiklik varsa, deneyi iptal edin. Deney sona erdikten ve yeterli veri elde edildikten sonra, arka beyni bir çift forseps ile çıkararak embriyoyu feda edin.

Bu şekil, 48 HPF embriyosundan elde edilen uyarıcı A MPA ve NMDA reseptör akımlarının temsili kayıtlarını göstermektedir. İşte eksi 60 milivolt tutma potansiyelinde bir M hücresinden kaydedilen spontan A MPA ME PSC'leri. Ve bu ortalama ME PSC'leridir.

İşte 40 milivoltluk bir tutma potansiyelinde bir M hücresinden kaydedilen spontan A MPA ve NMDA me PSC'ler. Ve bu ortalama ME, PSC'ler, glutamat, ben, PSC'ler, aksiyon potansiyellerini bloke etmek için bir mikromolar TTX, glisin ve G oluşumunu bloke etmek için beş mikromolar katı dokuz ve 100 mikromolar ritoksin varlığında kaydedildi. İşte eksi 60 milivoltluk bir tutma potansiyelinde bir M hücresinden kaydedilen spontan MI PSC'ler.

Ve ortalama MI PSC'ler, MI PSC'ler, aksiyon potansiyellerini bloke etmek için bir mikromolar TTX varlığında kaydedildi. Glutamat reseptör aktivitesini bloke etmek için bir milimolar kimerik asit ve GABA oluşumunu engellemek için Qing ile 10 mikromolar. Bunlar, bu belirli hücredeki bir M hücresinden kaydedilen aksiyon potansiyelleridir.

0.48 nano amperlik bir SRA eşik uyarıcısı, birkaç aksiyon potansiyeli ortaya çıkardı, ancak eşiğe yönelik bir uyaran, yalnızca tek bir aksiyon potansiyelinin üretilmesiyle sonuçlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ila dört saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyolarında M hücrelerinden ve diğer retiküler spinal nöronlardan kelepçe kaydının nasıl yamalanacağını iyi anlamış olmalısınız.