Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Bu prosedürün genel amacı, 100 kilodaltondan daha büyük bozulmamış proteinleri maldi kütle spektrometresi ile hassas bir şekilde analiz etmektir. Bu, önce matris çözeltilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, ince tabaka çözeltisini hedef üzerine bırakmaktır.

Daha sonra, numune ve matrislerin karışımı hedef üzerinde biriktirilir. Son adım, numune noktalarını mikroskop altında gözlemlemektir. Sonuç olarak, bozulmamış proteinleri analiz etmek ve kütle spektrumlarını kaydetmek için çoklu kütle spektrometresi kullanılır.

Maldi kütle spektrometresinin elektro sprey iyonizasyonu gibi diğer analitik yaklaşımlara göre ana avantajı, tuz, kirletici ve deterjanlara karşı daha toleranslı olmasıdır. Maldi'nin bir diğer avantajı da elektro spreye kıyasla daha az yük taşıyan iyon üretmesidir. Bu nedenle, MDI verilerinin elde edilmesi ve yorumlanması oldukça basittir.

Rech kristalizasyonuna başlamak için, bir Pyrex kuyruğuna 10 mililitre% 40 etanol dökün. Daha sonra bir su banyosu ve bir direnç ısıtıcısı kullanarak 600 miligramlık bir matriste. Matris çözeltisini ısıtın ve matris tamamen eriyene kadar karıştırın.

Çözelti doygun hale gelene kadar önceki adımları tekrarlayın. Çözeltinin oda sıcaklığında birkaç saat yavaşça soğumasına izin verin ve ardından gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Kristaller oluşmazsa, kristalleşmeyi indüklemek için bir cam çubuk kullanarak beherin içini çözelti yüzeyinin hemen altına çizin.

Son olarak, matris kristallerini süzülerek toplayın. Şişedeki artık kristalleri minimum miktarda buz gibi soğuk çözücü ile durulayın ve süzün. Filtrasyon tamamlandıktan sonra, maldi hedef plakasını temizlemek için kristallerin kurumasını bekleyin.

Metanol ile durulayın ve bir ıslak mendille nazikçe silin. Ardından suyla durulayın ve kim'lik bir mendille silin. Maldi hedefini 600 mililitrelik bir behere yerleştirin ve üzerini %50 etanol ile kaplayın.

Daha sonra, hedefi etanol çözeltisi içinde ultrasonik bir banyoda 10 dakika boyunca sonikleştirin. Plakada kalan kalıntılar varsa, önceki adımları tekrarlayın. Hedefi metanol ile durulayın veya kullanılan çözücüyü sulayın, numunenin ne kadar yayıldığını belirler.

Ardından hedefi, tüm sıvının bir Kim mendilinde toplanması için eğin. Nitrojen gazı akışı kullanarak hedefi kurutun. Bir sonraki adımda, alfa CHCA'yı aseton içinde çözün.

Doymuş bir çözelti yapmak için, 10 mikrolitrelik bir pipet ucunu alfa CHCA doymuş çözeltiye batırın, böylece çözeltinin küçük bir miktarı uçta akar. 1,5 mililitrelik bir plastik tüp kullanarak alfa CHCA çözeltisini maldi hedefine bırakmak için pipet ucuyla maldi hedefine hızlı bir şekilde dokunun. Alfa CHCA'yı yedi ila üç hacim Asetonitril ila% 5 formik asit oranında çözerek mililitre alfa CHCA çözeltisi başına 20 miligramlık bir çözelti hazırlayın, çözeltiyi alfa CHCA çözeltisi olarak etiketleyin.

Bunu takiben, DHB'yi yedi ila üç hacim asetil nitril ila %0.1 Tri floro asetik asit oranında çözerek mililitre başına 20 miligramlık bir DHB çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi DHB çözeltisi olarak etiketleyin. Alfa CHCA çözeltisini ve DHB çözeltisini bire bir hacim oranında karıştırın. Bu prosedüre başlamadan önce C-H-C-A-D-H-B çözeltisini elde etmek için isteğe bağlı bir adım, protein örneklerini listelenen referansta gösterilen tampon değişimi ile saflaştırmaktır.

Aksi takdirde, saflaştırılmamış bir protein numunesini MALDI hedefine bırakın. Daha sonra, hazırlanan alfa CHCA ince tabakası üzerine 0.5 mikrolitre protein numunesi bırakın. Bundan hemen sonra, 0.5 mikrolitre C-H-C-A-D-H-B çözeltisi ekleyin.

MALDI plakasına 0,5 mikrolitre Cain standardını yatırın ve ardından 0,5 mikrolitre matris çözeltisi ekleyin. Numuneler ve kain kuruduktan sonra, mikroskop altında lekeleri gözlemleyebilir, hedefi cihaza yerleştirebilir ve uygun cihaz kurulumunu seçebilirsiniz. Ardından uygun kütle / şarj oranı aralığını seçin.

Ca'nın spektrumlarını elde edin ve uygun lazer yoğunluğunu kullanarak cihazı kalibre edin. Protein örneklerinin spektrumlarını elde edin. Sağlam kromozom bölgesinin MALDI toff analizi Bakım bir proteini burada gösterilmiştir.

C-H-C-A-D-H-B karışımı, sinyal-gürültü oranı ve hassasiyet açısından daha yüksek kalitede kütle spektrumları verdi. Özellikle, MALDI hedefi üzerinde biriken 0.5 pikomol protein tespit edilebilirken, aynı miktarda protein zar zor tespit edilebilirken, C-H-C-A-D-H-B karışımını kullanan SINO NIC asidi kullanılarak, proteinin çoklu yüklü iyonları gözlendi, bu da kütle belirlemesine daha yüksek doğrulukla izin verir, çünkü eksenel çok toff aleti durumunda tepe çözünürlüğü ana yük oranıyla ters orantılıdır. Ayrıca, C-H-C-A-D-H-B karışımını kullanarak, matris biriktirme için tercih ettiğimiz yöntem ince tabaka yaklaşımıydı.

Kurutulmuş damlacık yöntemi kullanılarak, kütlesi 100 kilodaltondan daha yüksek olan proteinler tespit edilmedi. Monomerik beta toplama aase proteini de çoklu TOF ile analiz edildi. C-H-C-A-D-H-B spektrumları, hassasiyet ve çözünürlük açısından SINO NIC asit spektrumlarından daha iyiydi.

Ayrıca, çok yüklü iyonların varlığı, proteinin kütlesinin daha yüksek doğrulukla doğrulanmasını sağladı. Sağlam bir immünoglobulinin analizi için MALDI burada gösterilmiştir. C-H-C-A-D-H-B karışımı kullanılarak elde edilen spektrumlar, SA ve alfa CHCA spektrumlarından çok daha yoğundu.

Daha spesifik olarak, protein sinyalleri daha yüksekti ve C-H-C-A-D-H-B spektrumlarında daha iyi çözünürlüğe sahipti. C-H-C-A-D-H-B karışımının ve ince tabaka biriktirme yönteminin kullanılması, büyük bozulmamış proteinin kalitesinde önemli gelişmeler göstermiştir. Mass Spectra, enstrüman için bir MALDI kullanılarak elde edildi.

Sunulan protokol, çoklu bir alet kullanılarak yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin yüksek kaliteli kütle spektrumlarının nasıl elde edileceğini göstermektedir. Bu tür bir analiz yaparken üç şey önemlidir. İlk olarak, yeni hazırlanmış bir ölçüm çözümü kullanmak.

İkincisi, numunenizi Mali hedefine düzgün bir şekilde yatırmak için. Üçüncüsü, lazer yoğunluğu gibi uygun enstrümantal ayarı kullanmak.