Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Bu prosedür, matriks destekli lazer DESORPSİYON iyonizasyonu kütle spektrometrik görüntüleme tekniğini kullanarak sığır lensi içindeki çoklu endojen lipidleri mekânsal olarak lokalize eder. İlk olarak, ince bir sığır lensi doku kesiti hazırlayıp çoklu matriks uygulayın, ardından bir MALDI kütle spektral veri seti elde edin.

Veri setini, lens doku kesitinde saptanan lipidlerin görsel bir temsiline dönüştürün. Bu sonuçlar birlikte, sığır lensi içindeki lipidlerin konumunu ve bağıl bolluğunu belirleyebilir ve bu dağılımın görsel bir temsilini oluşturabilir. Lipid ekstraksiyonunun ardından uygulanan LCMS analizi gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, MALDI kütle spektrometrisi görüntüleme, lipidlerin uzaysal lokalizasyonları kaybolmadan birden fazla lipidin eş zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır. Şok dondurulmuş doku örneklerini -80 °C depolama alanından çıkarın.

Tüm bir sığır buzağısı lens kesitini sabitlemek için kapsülü lens yüzeyinden çıkarın. Bir kriyostatın doku kesme tablasına bir veya iki damla su damlatın. Kriyostat optimal sıcaklığa ulaştığında, lens donmadan önce hızlıca suyun içine yerleştirin.

Dokuyu ekvatoral olarak 20 mikron kalınlığında kesitlere ayırın. İlk doku kesitlerini atın ve oküler lens dokusunun görüntülenmesi için yalnızca ekvatoral düzleme yakın olan veya ekvatoral düzlemi içeren dilimleri kullanın. ITO kaplı bir cam lamın yüzeyini önceden ıslatmak için 1.5 mikrolitre formik asit ekleyin.

Ardından doku kesitlerini kriyostat içerisindeki lamın üzerine dikkatlice aktarın. Daha sonra, MALDI matris uygulaması öncesinde lamları 15 dakika boyunca liyofilize edin. Bir daksil kalemi kullanarak, ITO kaplı cam lamın iletken olmayan yüzeyine üç adet işaretleme yapın.

Şimdi, düz yataklı bir tarayıcı kullanarak doku lamının optik görüntüsünü alın ve bunu TIFF veya jpeg gibi uygun bir formatta kaydedin. İlk olarak, matrisin lam kenarlarına kaplanmaması için ITO kaplı cam lamların ön yüzeyindeki kenarları bantla kapatın. Kullanılacak matrisi uygun bir çözücü içinde hazırlayın.

Ardından, doku kesitlerinin yüzeylerine matriks çözeltilerini uygulayın. Cam lamı 20 matriks kaplama döngüsü kullanarak kaplayın. Eğer bir çözücü elektronik matriks püskürtücü ile uyumlu değilse, matrikslerin uygulanması için pnömatik destekli bir airbrush püskürtücü kullanılabilir.

Kütle kalibrasyon çözeltisi için, ES tuning mix standart çözeltisini %60 Isopropanol içerisinde 1:200 oranında seyreltin; seyreltilmiş ES tuning mix çözeltisinden dakikada iki µL'yi, bir Fourier transform iyon siklotron rezonans ms cihazındaki çift modlu elektrospray iyonizasyon iyon kaynağına aktarın. F-T-I-C-R cihazını, geniş bantlı deteksiyon ve saniyede 1024 kilobytes veri toplama boyutu ile pozitif iyon ESI modunda çalıştırın. ESI parametrelerini tipik olarak 3.900 V kapiler elektrospray voltajına ayarlayın.

Sprey kalkanı voltajı 3.600 volt, nebulizör nitrojen gaz akışı dakikada iki litre olarak ayarlanır. Kuru nitrojen gaz akışı dakikada dört litre ve sıcaklık 200 °C olarak belirlenir. Ayrıca, skimmer 1 voltajı 15 volt olarak ayarlanır.

Uçuş süresi 0,01 saniye, çarpışma argon gazı akışı 0,4 litre/saniye, kaynak iyon biriktirme süresi 0,1 saniye ve çarpışma hücresi iyon biriktirme süresi 0,2 saniye olarak ayarlanır. Şimdi, iyi zaman alanı serbest indüksiyon sönümleme sinyallerini korurken, kütle/yük oranı 200 ile 1400 arasındaki kütle aralığında analitik hassasiyeti maksimize etmek için F-T-I-C-R çalışma parametrelerini optimize edin. Ardından ESI kütle spektrumlarını elde edin ve cihazı E es tuning mix çözeltisindeki standart bileşiklerin referans kütlelerini kullanarak kalibre edin.

Enstrümanı MALDI çalışması için ayarlamak amacıyla, her biri 1 µM konsantrasyonda olan karışık turin ve INE standart çözeltisinden birkaç 1 µL'lik alikotu matris çözeltisi içinde çözün ve bu çözeltileri doğrudan örnek doku kesitlerinden birinin üzerine damlatın. Lamı bir doku lamı adaptörüne yerleştirin ve adaptörü MALDI tarafı olacak şekilde çift ESI MALDI iyon kaynağına yükleyin. Ardından, her kütle taraması için MALDI sinyal birikimi sağlayacak lazer gücü ve lazer atış sayısı için uygun MALDI çalışma parametrelerini optimize edin.

Enstrüman, MALDI MSI deneyleri için ayarlandıktan, kalibre edildikten ve optimize edildikten sonra, görüntülenecek doku kesitinin fiziksel konumu ile görüntüleme yazılımı içindeki kaydedilmiş optik görüntüsünü hizalayın. Üç nokta triangülasyon yöntemini kullanarak üç düzeltme sıvısı işaretini hizalayın. Ardından, veri toplama sonrası dahili kütle kalibrasyonu için her kütle spektrumunun E ES tuning mix çözeltisinin referans kütle piklerini içermesini sağlayacak şekilde eş zamanlı bir ESI MALDI işlemi başlatın.

İlk olarak, ESI kalibre sinyalleri dahili kütle kalibrasyonu için yeterince yüksek kalacak şekilde, MALDI sinyalleri spektrumlara baskın gelene kadar kapiler voltajı düşürerek ESI sinyalini zayıflatın. Ardından, radyasyon lazeri için otomatik bir tarama yöntemi kurun. Rastgele nokta analizi kullanın.

Görüntülenecek doku bölgelerini tanımlayın ve uygun lazer RA adım boyutunu ayarlayın. İlk karşılaştırma için MALDI kütle spektrumlarını dahili kalibrasyon kullanarak kalibre edin; MSMS için izotopları ayıklamak ve monoizotopik pikleri seçmek için özelleştirilmiş bir VBA betiği kullanın ve elde edilen monoizotopik pik listelerini dışa aktarın. Kütüphane girişleriyle kütle eşleştirmesi yapmak için ölçülen kütle/yük oranı değerlerini Melin nine ve/veya HMDB metabolom veri tabanlarına girin.

Ardından, pik tepesindeki kütle filtresi genişliği bir milyonda bir olacak şekilde görüntüleme yazılımı kullanarak, tüm doku kesitinde tespit edilen tüm lipid varlıkları için maldi görüntüleri oluşturun. Veritabanı girişleriyle eşleşen tüm kütle/yük oranı değerleri için görüntüler oluşturulduktan sonra, sığır lensi gibi bazı spesifik dokular için daha sonra incelenebilecek benzersiz dağılım modellerini araştırmak amacıyla diğer tüm pikler için de görüntüler oluşturun. Doğrudan çözdirme ile montajlama kullanıldığında dokuda sıklıkla yaygın yırtılmalar gözlemlenir.

IT OAS lamının etanol veya formik asit ile ön işlemi, doku montajı sırasında doku kesitlerinin bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Hem matris seçimi hem de solvent seçimi, MALDI spektrumlarının kalitesini etkileyen önemli faktörlerdir. Bu örnekler, diol için etkili bir matris solventi ile kötü bir matris solventi seçimiyle üretilen bir spektrumu karşılaştırmaktadır.

Bir MALDI MSI deneyinden elde edilen kütle spektrumları seti alındıktan sonra, saptanan iyonların her biri için görüntü oluşturulabilir. Her bir piksel, bir doku kesitinin yüzeyindeki bir lazer ışınlama noktasını temsil eder. Analitlerin göreceli konsantrasyonları, doku kesitinin farklı bölgelerinde detaylandırılabilir.

Çoğu deneyde veriler, her bir spektrumdaki toplam iyon akımına göre normalize edilir. Bu normalizasyon yapılmadığında, analit matrisinin daha iyi olduğu bölgeler veya COC kristallenmesi analitler için daha güçlü sinyallere neden olabilir ve bu durum verileri saptırabilir. Doku hazırlama işlemi de oluşturulan görüntüyü önemli ölçüde değiştirebilir.

Örnek çok ıslak olursa, analitler doku üzerinde yer değiştirir ve uzamsal bilgilerin çoğu kaybolur. Oküler lens üzerindeki bir doku görüntüleme deneyinin bu gösteriminde, lipidlerin uzamsal dağılımını F-T-I-C-R-M-S ile belirlemek için çoklu Matrixx olarak diol kullanılmıştır. Farklı doku türlerindeki lipidlerin görüntülemesi, benzer bir şekilde diol veya başka bir matriks kullanılarak gerçekleştirilebilir.