Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Bu prosedür, bir sığır lensi içinde çoklu endojen lipidleri mekansal olarak lokalize eder. Matris destekli lazer DESORPSIYON iyonizasyonu tekniğini kullanarak, kütle spektrometrik görüntüleme. İlk olarak, ince bir sığır lens dokusu kesiti hazırlayın ve bir çoklu matris uygulayın, ardından bir maldi kütle spektral veri seti elde edin.

Veri setini, lens dokusu bölümünde tespit edilen lipitlerin görsel bir temsiline dönüştürün. Bu sonuçlar birlikte, bir sığır merceği içindeki lipitlerin konumunu ve nispi bolluğunu belirleyebilir ve bu dağılımın görsel bir temsilini üretebilir Lipid ekstraksiyonu ve ardından LCMS analizi gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, maldi kütle spektrometresi görüntüleme, uzamsal lokalizasyonlarını kaybetmeden aynı anda birden fazla lipitin görselleştirilmesine izin verir. Flaş donmuş doku örneklerini eksi 80 santigrat derece saklama alanından çıkarın.

Bütün bir sığır buzağı lens bölümünü sabitlemek için kapsülü lensin yüzeyinden çıkarın. Bir kriyostatın doku kesme aşamasına bir veya iki damla su koyun. Kriyostat optimum sıcaklığa dengelendiğinde lensi katılaşmadan önce hızlı bir şekilde suya yerleştirin.

Dokuyu ekvatoral olarak 20 mikron kalınlığında bölümler halinde kesin. İlk doku kesitlerini atın ve oküler lens dokusunu görüntülemek için yalnızca ekvator düzlemine yakın veya ekvator düzlemine ek dilimler kullanın. ITO kaplı bir cam slaytın yüzeyini önceden ıslatmak için 1,5 mikrolitre formik asit ekleyin.

Daha sonra doku bölümlerini dikkatlice kriyostatın içindeki slayta aktarın. Ardından, maldi matris uygulamasından önce slaytları 15 dakika liyofilize edin. Bir düzeltme sıvısı kalemi kullanarak, ITO kaplı cam sürgünün iletken olmayan yüzeyine üç öğretme işareti ekleyin.

Şimdi düz yataklı bir tarayıcı kullanarak doku slaytının optik bir görüntüsünü alın ve TIFF veya jpeg gibi uygun bir formatta kaydedin. İlk olarak, ITO kaplı cam slaytların ön yüzeyindeki kenarları, matrisin sürgünün kenarlarını kaplamaması için bantla örtün. Kullanılacak matrisi uygun bir çözücü içinde hazırlayın.

Daha sonra doku bölümlerinin yüzeylerine matris çözeltileri uygulayın. 20 döngü matris kaplama kullanarak cam sürgüyü kaplayın. Alternatif olarak, bir çözücünün elektronik matris püskürtücü ile uyumlu olmaması durumunda matrisleri uygulamak için pnömatik destekli bir airbrush püskürtücü kullanılabilir.

Kütle kalibrasyon çözeltisi için, ES ayar karışımı standart çözeltisini %60'ta bir ila 200 kat oranında seyreltin İzopropanol, seyreltilmiş ES ayar karışımı çözeltisinin dakikada iki mikrolitresini, dört A dönüşüm iyon siklotron rezonansı MS için cihaz üzerindeki çift modlu elektro sprey iyonizasyon iyon kaynağına sokun. F-T-I-C-R cihazını, geniş bant algılama ve 1024 kilobaytlık bir veri toplama boyutu ile pozitif iyon ESI modunda çalıştırın Saniye. Tipik olarak 3.900 volt kılcal elektro püskürtme voltajının ESI parametrelerini ayarlayın.

3.600 voltluk bir sprey kalkanı voltajı nebulizatör azot gazı dakikada iki litre akar. Kuru nitrojen gazı dakikada dört litre ve 200 santigrat derece sıcaklıkta akar. Ayrıca skimmer bir voltajı 15 volta ayarlayın.

Uçuş süresi 0.01 saniye, çarpışma argon gazı akışı saniyede 0.4 litre, kaynak iyon biriktirme süresi 0.1 saniye ve çarpışma hücresi iyon biriktirme süresi 0.2 saniye. Şimdi, kütle ile yük oranı 200 ila 1400 arasındaki kütle aralığında analitik hassasiyeti en üst düzeye çıkarmak için F-T-I-C-R çalışma parametrelerini ayarlayın ve aynı zamanda iyi zaman alanı içermeyen indüksiyon bozunma sinyallerini koruyun. Ardından ESI kütle spektrumlarını edinin ve E es tuning mix solüsyonundaki standart bileşiklerin referans kütlelerini kullanarak cihazı kalibre edin.

Cihazı MALDI işlemi için ayarlamak için, karışık bir turin ve INE standart çözeltisinin birkaç mikrolitrelik alikotunu matris çözeltisi içinde her biri bir Mikromolar konsantrasyonda çözün ve bu çözeltileri doğrudan numune dokusu bölümlerinden birine yerleştirin. Sürgüyü bir doku sürgü adaptörüne yerleştirin ve adaptörü MALDI tarafından çift ESI maldi iyon kaynağına yükleyin. Ardından, lazer gücü için uygun MALDI çalışma parametrelerini ve her toplu tarama için MALDI sinyal birikimi için lazer atışlarının sayısını optimize edin.

Cihazı maldi MSI deneyleri için ayarladıktan, kalibre ettikten ve optimize ettikten sonra, görüntülenecek bir doku bölümünün fiziksel konumunu, görüntüleme yazılımında kaydedilen optik görüntüsüyle hizalayın. Üç noktalı üçgenleme yöntemi kullanarak üç düzeltme sıvısı işaretini hizalayın. Ardından, her bir kütle spektrumunun, edinim sonrası dahili kütle kalibrasyonu için E ES ayar karışımı çözeltisinin referans kütle tepe noktalarını içermesi için eşzamanlı bir ESI MALDI işlemine başlayın.

İlk olarak, MALDI sinyalleri spektrumlara hakim olana kadar kılcal voltajı azaltarak ESI sinyalini zayıflatın, ESI kalibre sinyalleri dahili kütle kalibrasyonu için hala yeterince yüksekken. Ardından, radyasyon lazeri için otomatik bir rasing yöntemi ayarlayın. Rastgele nokta analizi kullanma.

Görüntülenecek doku bölgelerini tanımlayın ve uygun lazer RA adım boyutunu ayarlayın. İlk karşılaştırma için dahili kalibrasyonu kullanarak MALDI kütle spektrumlarını kalibre edin ve MSMS de izotopu için tepe noktalarını seçin ve özelleştirilmiş bir VBA komut dosyası kullanarak mono izotopik tepe noktalarını seçin ve elde edilen mono izotopik tepe listelerini dışa aktarın. Kütüphane girişleriyle kütle eşleştirmesi için ölçülen kütle / yük oranı değerlerini Melin nine ve/veya HMDB metabolom veritabanlarına girin.

Daha sonra, tepe tepesinde milyonda bir parça kütle filtresi genişliğine sahip bir görüntüleme yazılımı kullanarak tüm doku bölümü boyunca tespit edilen tüm lipid varlıkları için maldi görüntüleri oluşturun. Veritabanı girişleriyle eşleşen tüm kütle / yük oranı değerleri için görüntüler oluşturulduktan sonra, sığır lensi gibi bazı belirli dokular için daha sonra araştırılabilecek benzersiz dağılım modellerini aramak için diğer tüm tepe noktaları için de görüntüler oluşturur. Doğrudan çözülme montajı kullanıldığında dokunun geniş yırtılması sıklıkla gözlenir.

IT OAS slaytının etanol veya formik asit içeren preco'su, doku montajı sırasında doku bölümlerinin bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Hem matris seçimi hem de çözücü seçimi, MALDI spektrumlarının kalitesini etkileyen önemli faktörlerdir. Bu örnekler, verimli bir matris çözücü ile üretilen bir spektrumu, diol için zayıf bir matris çözücü seçimi ile karşılaştırır.

Bir Maldi MSI deneyinden elde edilen kütle spektrumları seti elde edildikten sonra, tespit edilen iyonların her biri için görüntü oluşturulabilir. Her piksel, bir doku bölümünün yüzeyinden bir lazer ışınlama noktasını temsil eder. Analitlerin nispi konsantrasyonları, doku bölümünün farklı bölümlerinde detaylandırılabilir.

Çoğu deneyde, veriler her spektrumdaki toplam iyon akımını normalleştirir. Daha iyi analit matrisine sahip bu normalleşme alanları olmadan, COC kristalleşmesi analitler için daha güçlü sinyallere neden olabilir ve bu da verileri çarpıtabilir. Doku hazırlığı, oluşturulan görüntüyü de önemli ölçüde değiştirebilir.

Numune çok ıslaksa, analitler doku üzerinde delokalize olacak ve uzamsal bilgilerin çoğu kaybolacaktır. Oküler lens üzerinde bir doku görüntüleme deneyinin bu gösterimi, lipitlerin F-T-I-C-R-M-S ile uzamsal dağılımını belirlemek için çoklu Matrixx olarak diol kullandı. Farklı doku tiplerindeki lipitlerin görüntülenmesi, benzer şekilde diol veya başka bir matris kullanılarak gerçekleştirilebilir.