Name: Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T19:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Keşfedin, MALDI görüntüleme ile sığır lens dokusunda endojen lipitlerin uzamsal dağılımını nasıl analiz edebilirsiniz. Ditranol matrisi kullanılan bu yöntem, lipitlerin konumunu ve göreceli bolluğunu koruyarak görselleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar platformu finansman ve destek için Genom Kanada ve Genom British Columbia kabul etmek istiyorum. Biz de el yazması ve düzenleme yardım eleştiri Dr Carol E. Parker teşekkür ederim. CHL de destek için teşekkür British Columbia Proteomiks Ağı.

1.. Doku Bölünmesi <ol><li> , Sıvı azot kullanılarak, bir kez hasat sorunu örnekleri, flaş dondurma (nakliye gerekiyorsa) kuru buz üzerinde gemi ve doku kesit kadar -80 ° C&#39;de saklayın. (Ticari numuneler kullanıldığında, numuneler Bu şekilde hazırlanan olduğundan emin olun.) </li><li> MALDI hedef sığdırmak için yönetilebilir bir boyutta organları kesilmiş. Organın istenmeyen kısımlarını keserek. Burada tarif edilen bu çalışma için, buzağı lensler doku kesit önce, daha önce tarif edilen prosedür kullanılarak 35 decapsulated edilmiştir. </li><li> -80 ° C dondurucu bütün organları çıkarın ve bir kriyojenik doku kesme sahneye onları düzeltmek. Bir buzağı lens düzeltmek için, bir kriyostat doku kesme aşamasında su, bir ya da iki damla yerleştirin. Katılaşana önce hızlı bir şekilde suda lens yerleştirin. Seçenek olarak ise, en iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşikleri, aynı zamanda kesme aşamasında üzerine bir doku düzeltmek için kullanılabilir. Ekim bileşiklerin kullanılması halinde, miniOCT mal miktarı uygulanmalı ve bakım kesim doku bölümleri iyonizasyon ve Analitlerin 5,36,37 tespiti engelleyebilir Ekim bileşikler ile kontamine olmayacak sağlamak için alınmalıdır. </li><li> Kriyostat içindeki sıcaklık -18 ° C&#39;ye denge sağlaması için izin Daha soğuk ya da sıcak sıcaklıkları sırasıyla daha yumuşak veya daha sert dokular için kullanılabilir. Sonra ekvatorial 20 mikron kalınlığında dilimler halinde doku kesti. Çoğu dokular için 10-15 mikron kalınlığında dilimler kullanın, çünkü sığır lens dokusunun kırılgan yapısı nedeniyle, bununla birlikte, 20 um kalınlığında kesitler kullanılmıştır. Sığır lens dokusu, ilk doku bölümleri atmak ve sadece ekvator düzlemine yakın ya da dilim kullanın. </li><li> Oküler bir lens doku görüntülü ise, bir indiyum kalay oksit (İTO) kaplı cam slayt, yüzey ön ıslatılmış formik asit (% 98 saflıkta, LC-MS dereceli), 1.5 ul kullanın. </li><li> Dikkatlice İTO-co yüzeyine doku bölümleri aktarmakkriostada içinde oluşturulacağı cam mikroskopik slayt. Doku bölümü hızla çözülme ve slayt yüzeye sıkıca tutturulmuş olacaktır. Genellikle, çok sayıda doku bölümleri, bu şekilde aynı İTO kaplı slayt üzerine monte edilebilir. </li><li> MALDI matris uygulama öncesi 15 dakika için slayt liyofilize edilir. </li><li> Matris testi için, uygun çözücüler içerisinde bireysel matrisler çözülür. El doku bölümü üzerine, her matris solüsyon içerisinde 1 ul nokta. Buna ek olarak, MALDI duyarlılık doğrulanması için doku üzerine küçük moleküllü kalibrasyon standardı nokta. </li><li> Bir düzeltme-sıvı kalem ile ITO kaplı cam slayt yalıtkan yüzeyinde yazarak ITO kaplı cam slayt üç öğretim işaretleri ekleyin. Masaüstü bir tarayıcı kullanarak doku slayt bir optik görüntü almak ve bu tür TIFF veya jpg gibi uygun bir formatta kaydedebilirsiniz. </li></ol> 2. Matrix Kaplama 2.1. Otomatik Matrix Kaplama <ol><li> Apotomatik olarak bir Bruker ImagePrep veya benzer bir elektronik matris spreyleyicisi kullanarak doku bölümlerinin yüzeylerine çözücü olarak asetonitril veya karışık asetonitril / su içeren katlı matris çözümleri,. </li><li> Matris kat sürgünün kenarları kalmaması bant ile İTO kaplı bir cam slayt ön yüzeyinin kenarlarını örtün. Bu karşı yüzeyi üzerinde öğretim işaretleri dokusu lamı hizalama için kullanılabileceğini garanti eder. Onlar ITO kaplı slayt elektrik iletkenliğini korumak için temas noktaları olarak kullanılır gibi matris ile slayt kenarlarını örtmeyin. </li><li> Coat kaplama matris (2-sek sprey, 30-sek inkübasyon ve her devir için 60 saniye, kuruma süresi) yirmi döngüleri kullanılarak cam slayt. </li></ol> 2.2. Manuel Matrix Kaplama <ol><li> Elektronik matris püskürtücünün üretim malzemeleri ile uyumlu olmayan organik çözücüler (örneğin kloroform ve etil asetat) ise requikırmızı, matrisi uygulamak için bir pnömatik destekli airbrush püskürtücü kullanabilirsiniz. Airbrush tabancasının çözücü haznesine hazırlanan matris solüsyonu eklenir ve asal gazı için basınçlı azot gazı hafif bir akış uygulanır. </li><li> Matris kat sürgünün kenarları kalmaması bant ile İTO kaplı cam lam ön yüzeyinin kenarlarını örtün. Bu karşı yüzeyi üzerinde öğretim işaretleri dokusu lamı hizalama için kullanılabileceğini garanti eder. Onlar ITO kaplı slayt elektrik iletkenliğini korumak için temas noktaları olarak kullanılır gibi matris ile slayt kenarlarını örtmeyin. </li><li> Kararlı ve iyi spreyler gözlenmiştir sonra el matris sprey tamamen kaplar ve böylece doku bölümü. Ancak mümkün analit delokalizasyonu önlemek için her devir süresince yüzeyi ıslatmak için gereken matris solüsyon en az miktarda uygulanır. Genel olarak, kaplamak için matris sprey, yaklaşık 10 döngü, bir doku bölümü kullanmak, döngü sayısıdoku tipi ve matris bileşimine bağlıdır. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> Su (son karışım içerisinde% 0.1 formik asit ihtiva eder): 60:40 izopropanol 1:200 bir faktör ile &quot;ES ayarlama Mix&quot; standart çözelti seyreltilerek bir kütle kalibrasyon çözelti hazırlayın. </li><li> 2 ul / çift modlu elektrosprey iyonizasyon (ESI) ESI taraftan FTICR kütle spektrometresinde / MALDI iyon kaynağı, seyreltilmiş &quot;ES ayarlama Mix&quot; çözeltisi min tanıtılması. </li><li> Geniş bant algılama ve 1.024 kb / sn &#39;lik bir veri toplama boyutu ile, pozitif iyon ESI modunda FTICR alet çalıştırılır. Tipik ESI parametreler kılcal elektrospray gerilim, 3,900 V vardır, kalkan gerilimi, 3.600 V sprey; nebulizatör gazı (N2) akış, 2 L / dk; kuru gaz (N2) akış ve sıcaklık, 4 L / dk ve 200 ° C; 1 gerilimini, 15 V skimmer, uçuş (TOF) süresi, 0.009 saniye; çarpışma gaz (Ar) akış, 0,4 L / s; kaynak iyon birikimi zaman, 0,1 sn;ve çarpışma hücre iyon birikimi zaman, 0,2 sn. Iyi bir zaman-domain serbest indüksiyon çürüme (FID) sinyalleri muhafaza ederken, m / z 200 1400, kütle aralığı üzerinde analitik hassasiyet en üst düzeye çıkarmak amacıyla Ayarlama FTICR işlem parametreleri. Tipik olarak, ICR operasyon parametreleri sidekick gerilimi, 8 V olan, ofset gerilimi, 8 V sidekick; 10 uyarım güçlendirilmesi; uyarım darbe zamanı, 0,01-,015 sn; ön tuzak plaka gerilimi 1,5 V; geri tuzak plaka gerilimi, 1.6 V ve analiz giriş gerilimi, -4 FTICR işlem parametreleri bir dizi belirlenmiştir sonra V., ESI kütle spektrumu elde etmek ve &quot;ES ayarlama Mix&quot; çözelti içinde standart bileşiklerin referans kitleleri kullanarak aleti kalibre edin. </li><li> Ayarlamak için MALDI çalışması için, gösterge, 1 uM, her bir konsantrasyonda çözelti içinde matris karma terfenadin ve reserpin standart solüsyon birkaç 1 ul alikotları çözülür ve doğrudan Tissu&#39;nun birinin üzerine bu çözümleri noktaE kesitler ITO kaplı slayt üzerine monte edilmiş (yani bir test doku bölüm). Bir doku slayt adaptörü (yani özel bir MALDI hedef) içine ITO kaplı slayt yerleştirin ve çift ESI / MALDI iyon kaynağına MALDI taraftan adaptörünü yükleyin. Her kitle tarama için MALDI sinyal birikimi, vb için lazer gücü ve lazer çekim sayısı için uygun MALDI işletim parametrelerini optimize Tipik MALDI operasyon parametreler şunlardır: lazer çekim, 50 ve 300 V bir MALDI anot gerilimi </li><li> Ayarlamadan sonra, kalibre ve MALDI-MSI deneyler için aracı optimize görüntüleme yazılımı dahilinde kaydedilen optik görüntü ile görüntülü bir doku bölümün fiziksel konumunu hizalamak. Üç nokta nirengi yöntemini kullanarak bu uyum için önceden ITO kaplı slayt yüzeyinin ters tarafına (adım 1.9) koymak olmuştu üç &quot;düzeltme-sıvı&quot; işaretleri, kullanın. </li><li> Eşzamanlı ESI ve MAL gerçekleştirinDI işlemi, her bir kütle spektrumu alım sonrası iç kütle kalibrasyonları için &quot;ES Tuning Mix&quot; çözümün referans kütlesi tepeleri içerir böylece. Bu MALDI MS boyunca en doğru kütle ölçüm neden olur. Bunu yapmak için, önce ESI kalibrant sinyaller iç kütle kalibrasyonları için hala yeterince yüksek iken MALDI sinyalleri tayfını hakim kadar kılcal gerilimini azaltarak ESI sinyalini zayıflatmak. </li><li> Sonraki, lazer ışınları için bir otomatik rasterleme yöntemini kurmak. Yansıması için doku bölgeleri tanımlamak ve uygun lazer tarama adım boyutunu ayarlayın. Küçük raster adım boyutları yüksek çözünürlüklü doku görüntüleri sağlayabilir unutmayın, ama önemli ölçüde daha uzun kütle spektral edinimi süresi ve daha fazla veri depolama alanı gerektirir. Görüntü piksel sayısı kurmak için lazer tarama adım boyutu ve doku büyüklüğüne bağlıdır. 1 cm2 doku boyutuna sahip, tipik bir sığır lens, bir doku görüntü tipik haliyle yaklaşık oluşmaktadır. </em&gt; 5.000 piksel 200 mikron bir lazer tarama adım boyutu bir FTICR alet kullanılır eğer. Bu deney sırasında nedeniyle kademeli sinyal zayıflaması konum tabanlı önyargı engeller gibi, bir &quot;tesadüfi&quot; analizi kullanın. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> İlk karşılaştırma için dahili kalibrasyonunu kullanarak MALDI kütle spektrumları kalibre ve MS / MS için doruklarına seçin. De-izotop ve özelleştirilmiş bir VBA komut 38 kullanılarak, daha önce tarif edildiği gibi monoizotopik tepe seçin. </li><li> İhracat monoizotopik zirve listeleri ve METLIN 39 ve / veya kütüphane girişleri ile kitle eşleştirme için HMDB 40 metabolome veritabanlarına girdi ölçülen m / z değerleri sonuçlanır. ± 1 ppm kabul edilebilir bir toplu hata ile, veritabanı arama sırasında (M + H) +, (M + Na) + ve (M + K) + iyonları göz önünde bulundurun. </li><li> Imag kullanarak tüm doku kesiti tespit lipid tüm varlıkların için MALDI görüntüleri oluşturmaktepe tepe 1 ppm&#39;lik bir kitle filtre genişliğe sahip e-analiz yazılımı,. </li><li> Görüntüler veritabanı girdileri eşleşen tüm m / z değerleri oluşturulduktan sonra, daha sonra araştırılmalıdır benzersiz dağıtım desenleri aramak için yanı sıra diğer tüm zirveleri için görüntüleri oluşturabilirsiniz. </li></ol> 5. Imaged Lipidlerinin Kimliklerin Onayı <ol><li> MALDI-MS/MS ile FTICR aleti (fosfolipidler örneğin 184,073) kullanılarak tespit edilebilen karakteristik bir fragman iyonu sahip yüksek bolluk lipidler, kimliklerini teyit edin. Doğrudan doku üzerinde çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanılarak MALDI-MS/MS yapın. </li><li> Doğrudan MALDI-MS/MS tarafından teyit edilemeyen lipid türler için, bir q-TOF kütle spektrometresi 34 birleştirilmiş UPLC sistemi kullanın. <ol><li> El ilgilenilen türleri lokalize alan bir doku ~ 10 mg içeren alikotları keser. 2 içine bu doku hacimde yerleştirinml santrifüj tüpleri. </li><li> Iki 5 mm paslanmaz çelik metal toplar ile bir mikser değirmeni kullanılarak, su, 250 ul bir kısım, her doku homojenize. </li><li> Kloroform-metanol çözeltisi (01:03, v / v) ve girdap boruları 1 ml ilave edilir. Daha sonra, 10 dakika boyunca 12,000 xg&#39;de bir mikro santrifüj kullanılarak santrifüj tüpleri. </li><li> Süpernatantlar toplayın ve Devir-vakumlu konsantratörü onları kurutun. </li><li> Su: 30:70 izopropanol 100 ul artıkları çözülür. Gradyan elüsyonu kullanılarak ayrılması için UPLC kolonuna 10 ul kısım enjekte edilir. </li><li> 34, daha önce yayınlanmıştır on-line lipid LC-MS/MS için kromatografik şartlar kullanın. </li><li> Oluşturmak ekstre iyon akımı (XIC) teorik kitleler etrafında ± 50 ppm&#39;lik bir pencere ile, teorik m / z değerleri kullanılarak kromatogramları. </li><li> Bu lipidler için özgün bileşikler varsa, karşılık olanlar ile otantik bileşiklerin tutma süreleri eşleşendoku örneklerinden XIC tepe kesilmelidir. Bileşikler, aynı ise, tutma süreleri ve MS / MS spektrumları ile eşleşmelidir. </li></ol></li><li> Otantik bir bileşik mevcut değilse, bu tür METLIN veya HMDB gibi bir metabolome veritabanından bir standart MS / MS spektrum maç için saptanan lipid parçalanma desen kullanın. Lipid için olası bir yapısını belirlemek için de novo kütle spektrum yorumu kullanın. </li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Başarılı MALDI MSI için en önemli hususlar vardır: 1) doku hazırlanması; 2) matris seçim; 3) matris uygulaması ve 4) veri yorumlama ve analizi. Numune ve matris uygun şekilde hazırlandığı zaman, MS verileri elde etme otomatiktir. Deneyin bu tür veri analizi oldukça emek yoğundur. Uygun doku hazırlanması başarılı MALDI MSI deneyler için çok önemlidir. Doku kaynağı ve işleme son analizde üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Numuneler bir metabolitler ° C. -80 ° C&#39;de bile kararsız oldu...

Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) bir doku bölümü 1,2 yüzeyinde bileşiklerin uzamsal lokalizasyonu ve dağıtım modellerini belirlemek için bir analitik tekniktir. Peptitler ve proteinlerin analizi için matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) MSI bir on yıl için kullanılır olmuştur ve numune hazırlama, algılama hassasiyeti, uzaysal çözünürlüğü, tekrarlanabilirlik ve veri işleme 3,4 yöntemleri büyük gelişmeler olmuştur. Histolojik boyanan kesitler ve MSI deneylerden bilgileri birleştirerek, patologlar patafizyolojik ilginç özellikleri 5 spesifik bileşiklerin dağılımları ilişkilendirmek mümkün. Eksojen uyuşturucu 6,7 ve metabolitleri 8-10 gibi küçük moleküllerin dağılımları da MALDI-MS doku görüntüleme 11 tarafından sorguya edilmiştir. Lipidler belki de en çok çalışılan cla vardırMS 12-17 ve MS / MS 18 modlarında MALDI görüntüleme ile bileşiklerin ss. Küçük molekül görüntüleme için MALDI MSI kullanılması çeşitli faktörler tarafından kısıtlı olmuştur: 1) MALDI matrislerin kendileri bol iyon sinyalleri üretmek küçük moleküller (tipik m / z &lt;500) vardır. Bu bol sinyaller küçük moleküllü analitlerin iyonizasyonu bastırmak ve algılama ,19,20 engelleyebilir. Solvent içermeyen kaplama matris 21, matrix süblime 22 ve MALDI MS 23 önceden kaplanmış matris, diğerleri arasında, küçük moleküllerin MSI geliştirmek için geliştirilmiştir. Düşük MW bileşiklerin analizini artırabilir yeni matrisler küçük molekül MSI büyük ilgi vardır. Bu matrisler azalma matris sinyalleri ile artan bir analit sinyaller sağlamalıdır. Pozitif iyon modunda, 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA) MSI 24 için yaygın olarak kullanılan iki MALDI MS matrisleridir </sup&gt;. Analitlerin uzamsal lokalizasyonu korumak üzere ideal bir matris, küçük kristaller oluşturmak olacaktır. DHB nedenle süblimasyon ile matris kısmen bu sorunun üstesinden gelmek için geliştirilmiştir ve fosfolipid 22,25 hassas görüntüleme için bu matrisin kullanımı sağladı uygulanması daha büyük kristaller oluşturma eğilimindedir. 9-aminoakridin&#39;in pozitif-iyon modunda 26 ve negatif iyon modunda 26-29 nükleotid ve fosfolipid protik analitlerin MSI için kullanılmıştır. 2-merkaptobenzotiazol lipid 30 verimli MALDI algılama vermek bulunmuştur ve fare beyin görüntüleme 31, gangliosidler için kullanılmıştır. Fourier, ultra yüksek çözünürlüklü iyonsiklotron rezonans (FTICR) dönüşümü kütle spektrometre biraz matris sinyallerine 32 analit sinyalleri çözerek bu sorunu hafifletmek olabilir. FTICR-MS kullanımının bir başka avantajı, metastabil öbeklerden yoğunluğu azaltma olmasıdırAyrıca, bu parazitlerin 27 azaltır ed 33. Ditranol kullanılması (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) doku görüntüleme için bir MALDI matris 34, daha önce rapor edildiği gibi. Bu mevcut çalışmaları olarak, ayrıntılı bir protokol pozitif-iyon modunda, sığır lens doku bölümlerinin yüzeylerine endojen lipidlerin MSI DT kullanımı için sağlanır.

<table><tbody><tr><td>Sıçan Karaciğeri</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56023-2</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Buzağı Lensi</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>57114-2</td><td>Numune kullanımdan önce dekapsüle edilmelidir29</td></tr><tr><td>Dithranol (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10608</td><td>MALDI Matrisi</td></tr> <tr><td>ve alfa;-Siyano-4-hidroksi-sinnamik Asit (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70990</td><td>MALDI Matrisi</td></tr><tr><td>2,5-Dihidroksibenzoik Asit (DHB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td>MALDI Matriks</td></tr><tr><td>Reserpin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td></td></tr><tr><td>Terfenadin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9652</td><td></td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Format</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14266</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>320145</tr><tr><td>Trifloroasetik Asit (TFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Etil Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34972</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ticari Alkoller</td><td></td><td>%95</td></tr> <tr><td>ES Ayar Karışımı</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2431A</td><td></td></tr><tr><td>ITO Kaplamalı Cam Slaytlar</td><td>Hudson Yüzey Teknolojisi</td><td>PSI1207000</td><td>Numunelerin elektriksel olarak iletken tarafa yerleştirildiğinden emin olun</td></tr><tr><td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Düzeltme Kalemi</td><td>Bic</td><td>WOSQP11</td><td></td></tr><tr><td>Airbrush Püskürtücü</td><td>Iwata</td><td>Eclipse HP-CS</td><td></td></tr><tr><td>ImagePrep</td><td>Bruker</td><td>249500-LS</td><td></td></tr><tr><td>MALDI adaptörü</td><td>Bruker</td><td>235380</td><td></td></tr></tbody></table>

bir fourier matrix yardımlı lazer dezorpsivon / İyonizasyon görüntüleme için bir matrix olarak ditranol İyon cyclotron rezonans kütle spektrometresi dönüşümü

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) esas olarak MALDI (matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon) dayalı analitik teknikler kullanılarak, bir doku bölümü yüzeyinde bileşiklerin uzamsal lokalizasyonu ve dağılım özellikleri tespit eder. Düşük moleküler ağırlıklı (MW) bileşiklerinin analizini geliştirmek küçük moleküllü MSI için yeni matrisler, ihtiyaç vardır. MALDI arka plan sinyallerini düşürürken Bu matrisler artan analit sinyalleri vermelidir. Ayrıca, Fourier gibi ultra yüksek çözünürlüklü araçların kullanımı iyonsiklotron rezonans (FTICR) kütle spektrometre, dönüşümü matris sinyallerinden analit sinyallerini çözmek için yeteneğine sahiptir, ve bu kısmen plan MALDI kaynaklanan ile ilgili birçok sorunları aşabiliriz matrisi. FTICR MS ile metastabl öbeklerden yoğunluklarındaki azalma da diğer araçlar ile ilgili matris zirveleri ile ilgili etkileşimler bazılarının üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Yüksek çözünürlüklühala kimyasal tespitlerle güven sağlarken aynı anda birçok bileşiklerin dağılımı desen üretebilir gibi FTICR kütle spektrometre gibi enstrümanlar avantajlıdır. Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on), daha önce doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir. Bu çalışmada, pozitif-iyon MALDI-MS ile memeli doku bölümlerinin yüzeylerinden endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için, DT kullanımı için bir protokol, bir ultra yüksek çözünürlüklü bir hibrid bir dört kat üzerinde FTICR araç temin edilmiştir.

<html> ITO kaplı cam slaytlar üzerine kesitli ve çözülme monte edilmiş doku örnekleri görünür yırtılma olmadan, sağlam olmalıdır. Birçok doku için, bir ITO kaplı cam slayt üzerine monte doğrudan doku çözülme kabul edilebilir. Doğrudan montaj çözülme (Şekil 1a) kullanıldığı zaman, örneğin sığır lens gibi bazı spesifik dokular için, doku geniş yırtılma sık görülür. Etanol veya formik asit ile İTO cam slayt ön kaplamaya tabi tutulması (Şekil 1b), montaj sırasında doku doku bölümleri bütünlü...

Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) daha küçük moleküllerin doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir; üzerinde endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için DT kullanımı için protokoller Bir ultra çözünürlüklü kuadrupol-FTICR alet üzerinde pozitif iyon MALDI-MS tarafından doku kesitlerinin yüzey burada verilmektedir.

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Bu prosedür, matriks destekli lazer DESORPSİYON iyonizasyonu kütle spektrometrik görüntüleme tekniğini kullanarak sığır lensi içindeki çoklu endojen lipidleri mekânsal olarak lokalize eder. İlk olarak, ince bir sığır lensi doku kesiti hazırlayıp çoklu matriks uygulayın, ardından bir MALDI kütle spektral veri seti elde edin.Veri setini, lens doku kesitinde saptanan lipidlerin görsel bir temsiline dönüştürün. Bu sonuçlar birlikte, sığır lensi içindeki lipidlerin konumunu ve bağıl bolluğunu belirleyebilir ve bu dağılımın görsel bir temsilini oluşturabilir. Lipid ekstraksiyonunun ardından uygulanan LCMS analizi gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, MALDI kütle spektrometrisi görüntüleme, lipidlerin uzaysal lokalizasyonları kaybolmadan birden fazla lipidin eş zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır. Şok dondurulmuş doku örneklerini -80 °C depolama alanından çıkarın.Tüm bir sığır buzağısı lens kesitini sabitlemek için kapsülü lens yüzeyinden çıkarın. Bir kriyostatın doku kesme tablasına bir veya iki damla su damlatın. Kriyostat optimal sıcaklığa ulaştığında, lens donmadan önce hızlıca suyun içine yerleştirin.Dokuyu ekvatoral olarak 20 mikron kalınlığında kesitlere ayırın. İlk doku kesitlerini atın ve oküler lens dokusunun görüntülenmesi için yalnızca ekvatoral düzleme yakın olan veya ekvatoral düzlemi içeren dilimleri kullanın. ITO kaplı bir cam lamın yüzeyini önceden ıslatmak için 1.5 mikrolitre formik asit ekleyin.Ardından doku kesitlerini kriyostat içerisindeki lamın üzerine dikkatlice aktarın. Daha sonra, MALDI matris uygulaması öncesinde lamları 15 dakika boyunca liyofilize edin. Bir daksil kalemi kullanarak, ITO kaplı cam lamın iletken olmayan yüzeyine üç adet işaretleme yapın.Şimdi, düz yataklı bir tarayıcı kullanarak doku lamının optik görüntüsünü alın ve bunu TIFF veya jpeg gibi uygun bir formatta kaydedin. İlk olarak, matrisin lam kenarlarına kaplanmaması için ITO kaplı cam lamların ön yüzeyindeki kenarları bantla kapatın. Kullanılacak matrisi uygun bir çözücü içinde hazırlayın.Ardından, doku kesitlerinin yüzeylerine matriks çözeltilerini uygulayın. Cam lamı 20 matriks kaplama döngüsü kullanarak kaplayın. Eğer bir çözücü elektronik matriks püskürtücü ile uyumlu değilse, matrikslerin uygulanması için pnömatik destekli bir airbrush püskürtücü kullanılabilir.Kütle kalibrasyon çözeltisi için, ES tuning mix standart çözeltisini %60 Isopropanol içerisinde 1:200 oranında seyreltin; seyreltilmiş ES tuning mix çözeltisinden dakikada iki µL'yi, bir Fourier transform iyon siklotron rezonans ms cihazındaki çift modlu elektrospray iyonizasyon iyon kaynağına aktarın. F-T-I-C-R cihazını, geniş bantlı deteksiyon ve saniyede 1024 kilobytes veri toplama boyutu ile pozitif iyon ESI modunda çalıştırın. ESI parametrelerini tipik olarak 3.900 V kapiler elektrospray voltajına ayarlayın.Sprey kalkanı voltajı 3.600 volt, nebulizör nitrojen gaz akışı dakikada iki litre olarak ayarlanır. Kuru nitrojen gaz akışı dakikada dört litre ve sıcaklık 200 °C olarak belirlenir. Ayrıca, skimmer 1 voltajı 15 volt olarak ayarlanır.Uçuş süresi 0,01 saniye, çarpışma argon gazı akışı 0,4 litre/saniye, kaynak iyon biriktirme süresi 0,1 saniye ve çarpışma hücresi iyon biriktirme süresi 0,2 saniye olarak ayarlanır. Şimdi, iyi zaman alanı serbest indüksiyon sönümleme sinyallerini korurken, kütle/yük oranı 200 ile 1400 arasındaki kütle aralığında analitik hassasiyeti maksimize etmek için F-T-I-C-R çalışma parametrelerini optimize edin. Ardından ESI kütle spektrumlarını elde edin ve cihazı E es tuning mix çözeltisindeki standart bileşiklerin referans kütlelerini kullanarak kalibre edin.Enstrümanı MALDI çalışması için ayarlamak amacıyla, her biri 1 µM konsantrasyonda olan karışık turin ve INE standart çözeltisinden birkaç 1 µL'lik alikotu matris çözeltisi içinde çözün ve bu çözeltileri doğrudan örnek doku kesitlerinden birinin üzerine damlatın. Lamı bir doku lamı adaptörüne yerleştirin ve adaptörü MALDI tarafı olacak şekilde çift ESI MALDI iyon kaynağına yükleyin. Ardından, her kütle taraması için MALDI sinyal birikimi sağlayacak lazer gücü ve lazer atış sayısı için uygun MALDI çalışma parametrelerini optimize edin.Enstrüman, MALDI MSI deneyleri için ayarlandıktan, kalibre edildikten ve optimize edildikten sonra, görüntülenecek doku kesitinin fiziksel konumu ile görüntüleme yazılımı içindeki kaydedilmiş optik görüntüsünü hizalayın. Üç nokta triangülasyon yöntemini kullanarak üç düzeltme sıvısı işaretini hizalayın. Ardından, veri toplama sonrası dahili kütle kalibrasyonu için her kütle spektrumunun E ES tuning mix çözeltisinin referans kütle piklerini içermesini sağlayacak şekilde eş zamanlı bir ESI MALDI işlemi başlatın.İlk olarak, ESI kalibre sinyalleri dahili kütle kalibrasyonu için yeterince yüksek kalacak şekilde, MALDI sinyalleri spektrumlara baskın gelene kadar kapiler voltajı düşürerek ESI sinyalini zayıflatın. Ardından, radyasyon lazeri için otomatik bir tarama yöntemi kurun. Rastgele nokta analizi kullanın.Görüntülenecek doku bölgelerini tanımlayın ve uygun lazer RA adım boyutunu ayarlayın. İlk karşılaştırma için MALDI kütle spektrumlarını dahili kalibrasyon kullanarak kalibre edin; MSMS için izotopları ayıklamak ve monoizotopik pikleri seçmek için özelleştirilmiş bir VBA betiği kullanın ve elde edilen monoizotopik pik listelerini dışa aktarın. Kütüphane girişleriyle kütle eşleştirmesi yapmak için ölçülen kütle/yük oranı değerlerini Melin nine ve/veya HMDB metabolom veri tabanlarına girin.Ardından, pik tepesindeki kütle filtresi genişliği bir milyonda bir olacak şekilde görüntüleme yazılımı kullanarak, tüm doku kesitinde tespit edilen tüm lipid varlıkları için maldi görüntüleri oluşturun. Veritabanı girişleriyle eşleşen tüm kütle/yük oranı değerleri için görüntüler oluşturulduktan sonra, sığır lensi gibi bazı spesifik dokular için daha sonra incelenebilecek benzersiz dağılım modellerini araştırmak amacıyla diğer tüm pikler için de görüntüler oluşturun. Doğrudan çözdirme ile montajlama kullanıldığında dokuda sıklıkla yaygın yırtılmalar gözlemlenir.IT OAS lamının etanol veya formik asit ile ön işlemi, doku montajı sırasında doku kesitlerinin bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Hem matris seçimi hem de solvent seçimi, MALDI spektrumlarının kalitesini etkileyen önemli faktörlerdir. Bu örnekler, diol için etkili bir matris solventi ile kötü bir matris solventi seçimiyle üretilen bir spektrumu karşılaştırmaktadır.Bir MALDI MSI deneyinden elde edilen kütle spektrumları seti alındıktan sonra, saptanan iyonların her biri için görüntü oluşturulabilir. Her bir piksel, bir doku kesitinin yüzeyindeki bir lazer ışınlama noktasını temsil eder. Analitlerin göreceli konsantrasyonları, doku kesitinin farklı bölgelerinde detaylandırılabilir.Çoğu deneyde veriler, her bir spektrumdaki toplam iyon akımına göre normalize edilir. Bu normalizasyon yapılmadığında, analit matrisinin daha iyi olduğu bölgeler veya COC kristallenmesi analitler için daha güçlü sinyallere neden olabilir ve bu durum verileri saptırabilir. Doku hazırlama işlemi de oluşturulan görüntüyü önemli ölçüde değiştirebilir.Örnek çok ıslak olursa, analitler doku üzerinde yer değiştirir ve uzamsal bilgilerin çoğu kaybolur. Oküler lens üzerindeki bir doku görüntüleme deneyinin bu gösteriminde, lipidlerin uzamsal dağılımını F-T-I-C-R-M-S ile belirlemek için çoklu Matrixx olarak diol kullanılmıştır. Farklı doku türlerindeki lipidlerin görüntülemesi, benzer bir şekilde diol veya başka bir matriks kullanılarak gerçekleştirilebilir.

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi kullanılarak gangliosidlerin tespiti için DAN matrisinin sıçan beyin dokusu üzerine süblimleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Sentetik polimerler karakterizasyonu kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) numune hazırlama, spektral toplama ve veri analizi getirilmesi de dahil olmak üzere anlatılan uçuş matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma süresi için bir protokol.

Matris ile sentetik polimerler karakterizasyonu Lazer Desorpsiyon iyonlaşma zaman uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi destekli

Moleküler görüntüleme matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) ile birden çok analitler eş zamanlı haritalama biyolojik örnekleri sağlar. Burada, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid angiopathy örnekleri maldı-IMS kullanarak beyin dokuları algılama ve görselleştirme amiloid β protein için bir iletişim kuralı mevcut.

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

Karbonhidrat iyon sinyalleri maldı kütle spektrometresi reform kristal yapılar tarafından örnek hazırlama sürecinde güçlendirmeye yönelik bir protokol gösterilmiştir.

Matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi karbonhidrat iyon sinyalleri geliştirmek için bir verimli örnek hazırlama yöntemi

Bu protokolün amacı, matris yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi görüntülemesini kullanarak Drosophila beyni gibi küçük dokularda lipit ve metabolit analizi için uygun numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Görüntüleme Kullanarak Drosophila Beyinde Hızlı Lipid Analizi için Örnek Hazırlama

Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi ile agara bazlı, bakteriyel makrokolonilerin analizi için yeni bir numune hazırlama yöntemi gösterilmiştir.

Enfeksiyon Sırasında Agar ve Dokuda Yetişen Bakteri Kolonilerinin Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi Yoluyla Mikrobiyal İşbirliğinin İncelenmesi

Bu protokol, matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi kullanarak değişen dağılım ve uç gruplara sahip sentetik polimerleri karakterize etmek için numune hazırlama, veri toplama ve veri analizi için ayrıntılı talimatlar ve örnekler sağlar.

Değişen Dispersite ve Uç Gruplara Sahip Sentetik Polimerlerin Karakterizasyonu için MALDI-ToF MS Yöntemi

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Maya genetik çalışmalar, hücresel DNA metabolizması insan genlerinin moleküler ve hücresel fonksiyonları araştırmak için istihdam edilebilir. Yöntem, insan genetik karakterizasyonu için...

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Keşfedin, MALDI görüntüleme ile sığır lens dokusunda endojen lipitlerin uzamsal dağılımını nasıl analiz edebilirsiniz. Ditranol matrisi kullanılan bu yöntem, lipitlerin konumunu ve göreceli bolluğunu koruyarak görselleştirir.

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü (Video) | JoVE Journal

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Daha fazla video keşfet