Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Bu prosedürün genel amacı, kütle spektrometresi ile birleştirilmiş hidrojen döteryum değişimi ve yan zincir litik etiketleme kullanarak bir proteinin yapısını yüksek çözünürlükte izlemektir. Bu, farklı yardımcı maddelerin varlığında protein olan ilk liyofilize edilerek gerçekleştirilir. Katı hal hidrojen döteryum değişiminde, liyofilize protein, kontrollü bağıl nem ve sıcaklık altında kapalı bir kurusu içinde döteryum oksit buharına maruz bırakılır.

Litik etiketleme için protein, eksipiyanlar ve bir fotoreaktif ajan ile liyofilize edilir. Flakon daha sonra ajanı proteine kovalent olarak bağlamak için UV ışığı ile ışınlanır. Her yöntem için numuneler, hem bozulmamış protein hem de peptit düzeyinde çözünürlükte bir kütle spektrometresi kullanılarak yeniden oluşturulur ve analiz edilir.

Bu iki yöntem birbirini tamamlayan bilgiler sağlar. Protein yapısının yüksek oranda korunduğu formülasyonlar, döteryum alımının azaldığını ve litik etiketlemenin arttığını gösterirken, bozulmuş yapıya sahip olanlar, döteryum alımının arttığını ve litik etiketlemenin azaldığını gösterir. Kütle spektrometrik analizi ile birleştirilmiş hidrojen döteryum değişimi ve foto çapraz bağlama gibi kimyasal etiketleme, canlı desteklerdeki protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için yakın zamanda uyarlanmıştır.

Bu tekniklerin CD ve FDIR spektroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, protein yapısının ve ortamının katı halde yüksek çözünürlükle incelenebilmesidir. Başlamak için, bir kurutucunun alt bölmesine 200 mililitre döteryum oksit yerleştirin ve 400 gram potasyum karbonat ekleyin Doymuş bir çözelti yapmak için porselen kurutma plakasını içine yerleştirin ve kurutucuyu hava geçirmez şekilde kapatın. % 43'e yakın sabit bir bağıl neme ulaşmak için beş santigrat derecede dengelenmesine izin verin,Ardından, liyofilize protein içeren kapaksız şişeleri kuruluğun üst bölmesine yerleştirin, kuruyu kapatın ve beş santigrat derecede inkübe edin.

Bir numune toplamak üzere hidrojen döteryum değişim reaksiyonunu başlatmak için, şişeyi kurutucudan çıkardıktan hemen sonra kapatın ve ardından şişeyi ve sıvı nitrojeni hızlı dondurma ile reaksiyonu söndürün. Kütle spektrometrik analizine kadar şişeyi eksi 80 santigrat derecede saklayın. Geri değişimi en aza indirmek için numuneleri analiz etmek için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanın.

Soğutmalı bir kutunun içindeki sıvı kromatografik sistem nasıldır? Önce cihazı kurmak için, numune alma döngüsünü ve protein kapanını, tuzdan arındırma ve elüsyon işlemlerini kontrol eden valfe bağlayın. Ardından, düşük konsantrasyonlu ayar karışımını kütle spektrometresine enjekte ederek ve kütle / şarj oranı aralığını 200 ila 3, 200 arasında ayarlayarak sistemi kalibre edin.

Ardından, soğutulmuş sistemi yaklaşık sıfır santigrat derece sabit bir çalışma sıcaklığına soğutun. Suda %0.2 formik asit ve %5 metanol içeren söndürme tamponunu hazırlayın ve buz üzerinde soğutun. Numuneleri sıvı nitrojene aktardıktan sonra, bir şişeyi dikkatlice çıkarın ve iki mililitre söndürme tamponu ekleyerek numuneyi yeniden sulandırın.

Daha sonra uygun bir HPLC ve kütle spektrometresi yöntemi yükleyin. Buradaki numuneyi analiz etmek için, protein tuzağında 20 pikomol miyoglobini %5 asetil nitril ve %0.1 formik asit ile 1.7 dakika tuzdan arındırın. Daha sonra proteini 3.3 dakikalık bir gradyan üzerinde elüte edin, %80 aseto nitril ve %0.1 formik aside yükseltin.

Numuneyi enjekte edin ve kütle spektrumlarını 200 ila 3.200 kütle / şarj oranı aralığında toplayın. Referans olarak bozulmamış proteinin kütlesini belirlemek için, aşırı derecelendirilmiş bir protein numunesi ile aynı yöntemi kullanın. Veri analiz yazılımı kullanarak ham spektrumları evrişimini çözerek protein kütlesini elde edin Miyoglobin numune analizi için, kütle aralığını 15 ila 18 arasında, kilodalton kütle çözünürlüğünü bir Dalton ve tepe uçurtmayı %90'a ayarlayınPeptit analizi için, bozulmamış proteinlerle aynı protokolü kullanarak numuneleri hazırlayın.

Numuneler analiz edilmeye hazır olduğunda, hareketsiz hale getirilmiş bir pepin kolonu ve bir analitik kolon valfe bağlayın ve protein tuzağını bir peptit tuzağı ile değiştirin. Peptitler için sistemi kalibre edin, bozulmamış proteinler için performans göstermiş, ancak kütle / şarj oranı aralığını 100 ila 1700 arasında ayarlayarak, daha sonra soğutulmuş sistemi yaklaşık sıfır derecelik sabit bir çalışma sıcaklığına soğutun. Sistem kalibre edildikten sonra uygun HPLC ve kütle spektrometresi yöntemini programlayın.

Burada, su içinde% 0.1 formik asit ile Pepin sütunu üzerinde 20 pikomol miyoglobin sindirin, peptitleri peptit tuzağında 1.7 dakika boyunca %10 asetil nitril ve %0.1 formik asit ile yakalama ve tuzdan arındırma yöntemini programlayın ve peptitleri %60 asetil nitril ve %0.1 formik aside yükselen bir gradyan ile dört dakika içinde elüte edin. Daha sonra, numuneyi enjekte edin ve kütle spektrumlarını 100 ila 1700 arasında bir kütle / şarj oranı aralığında toplayın. Peptik fragmanları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi ile tarihsiz bir peptit örneğini analiz edin.

Daha sonra deneysel olarak belirlenen parçayı, yazılım tarafından oluşturulan tahmini kütlelerle çapraz kontrol edin. Daha sonra, kibritli peptitler için yüksek hataya sahip kütleleri ortadan kaldırmak için kütle kesimini milyonda 10 parçaya ayarlayın. Peptit dizisi şarj durumuna ve tutma süresine dikkat edin.

Peptik fragman başına dahil edilen ortalama deuteros sayısını hesaplamak için derlenmiş peptit verilerini kullanın Veri analiz yazılımını kullanma İlk olarak, proteini metin protokolünde belirtildiği gibi eksipiyan ve lucine ile liyofilize edin. Numuneleri hazırladıktan sonra, 365 nanometre UV lambaları içeren bir UV çapraz bağlayıcıyı açın. Lambaların beş dakika ısınmasına izin verin.

Lambalar ısındıktan sonra, onları kapatın ve formülasyonu içeren kapaksız şişeleri çapraz bağlayıcı haznesinin içine yerleştirin. Numuneleri 40 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın ve kapağı ışınladıktan sonra kontrol olarak foto lösin içermeyen numuneleri dahil edin ve şişeleri kütle spektrometrik analizine kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. İki mikromolar nihai protein konsantrasyonu elde etmek için kütle spektrometresi dereceli damıtılmış su ekleyerek numuneleri analiz için hazırlayın.

Daha sonra, bozulmamış döteryumlu proteinler için olduğu gibi aynı kütle spektrometresi yöntemini kullanarak numuneleri analiz edin. Ancak soğutmalı lc sistemini kullanmayın. Proteinin doğal kütlesini belirlemek için etiketlenmemiş bir protein numunesi için kütle spektrometresi verileri elde edin.

Peptit seviyesi analizi için DERECELENDİRİLMİŞ numunelerde olduğu gibi veri analizini gerçekleştirin. İlk olarak, bozulmamış proteinlerle katı hal fotolitik etiketleme yapın ve bunları eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 10 mikromolar nihai protein konsantrasyonu elde etmek için numuneyi 100 milimolar amonyum bikarbonat tamponu ile sulandırın.

Numuneyi tripsin ile 10 ila bir molar protein / tripsin oranında karıştırın ve bu karışımı 60 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Bu arada, numune döngüsünü, peptit tuzağını ve analitik sütunu HPLC sistem valfine bağlayın. Proteini sindirdikten sonra, iki mikromolar nihai protein konsantrasyonu elde etmek için suya% 0.1 formik asit ekleyerek reaksiyonu söndürün.

Daha sonra sistemi HPLC ve kütle spektrometresi yöntemleri ile programlayın. Burada, peptit tuzağına 20 pikomolün sindirilmiş miyokomolünü peptit tuzağına 1.5 dakika boyunca %5 aseto nitril ve %0.1 Formik asit ile enjekte edin ve tuzdan arındırın, gradyanı 22 dakika boyunca %55 asetil nitrile yükselterek peptitleri elüte edin ve kütle spektrumlarını 100 ila 1700 kütle / yük oranı arasında toplayın. Peptitin teorik kütlesini hesaplamak için çevrimiçi aracı kullanın.

Daha önce bozulmamış protein analizinden elde edilen foto lösin sayıları ile foto lösin eklentisi. En az dört kaçırılmış dekolte ekleyin. Peptit foto lösin eklentisi için Excel'de bir kitle listesi oluşturun.

Ardından, düşük hataya sahip kütleleri belirlemek için bir kesme noktası ayarlayarak teorik kütle listesini deneysel olarak gözlemlenen kütlelerle eşleştirin. Hidrojen döteryum değişimi sırasında, proteinin açılması, hidrojenin yapılarını koruyan döteryum proteinleri ile değiştirilmesine izin verir, bu proteinler döteryum değişimine daha az eğilimlidir. Taloz içeren ve sorbitol içeren miyoglobin formülasyonları üzerinde katı hal hidrojen döteryum değişim kütle spektrometresi gerçekleştirildiğinde, sorbitol içeren formülasyon %46 daha fazla döteryum alımı gösterdi, bu da sorbitoldeki miyoglobinin yapısının litik süreç sırasında daha fazla bozulduğunu düşündürdü.

Foto lösin, erişilebilir amino asitler yan zincirlerine çapraz bağlanır. Miyoglobin formülasyonları içeren sorbitol ve TLO'ların katı hal fotolitik kütle spektrometresi analizi, TLO formülasyonunda muadilinden daha fazla fotoeine tutulumu gösterdi. Bu, yan zincirlerin TLO formülasyonunda erişilebilir kaldığını göstermektedir.

Hem hidrojen döteryum değişimi hem de litik etiketleme, herhangi bir formülasyon için katı haldeki proteinleri karakterize etmek için ticari olarak mevcut bölgeleri ve hazır MS enstrümantasyonunu kullanır. Numune hazırlamadan tam veri analizine kadar geçen toplam süre kaydı iki haftadan azdır. Bu videoyu izledikten sonra, protein yapısı hakkında yüksek çözünürlüklü bilgilerin nasıl elde edileceğini ve stabil liyofilize protein formülasyonlarının tasarımındaki önemini iyi anlamış olmalısınız.