Name: Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Öğrenin, liyofilize protein tozlarında yüksek çözünürlüklü yapı analizi için katı hal hidrojen/deuterium değişim ve fotolitik etiketleme kütle spektrometrisi yöntemlerini. Formülasyon tasarımında yapısal bütünlüğü değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) ve Purdue Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'nden gelen mali desteği minnetle kabul ederler.

1. Numune Hazırlama ve Liyofilizasyon <ol><li> 0.22 um&#39;lik steril bir filtre ile uygun bir tampon ve filtre karşı Mb stok çözeltisi gerekli hacmi Dialyze. </li><li> (; PLeu L-2-amino-4,4-azi-pentanoik asit), uygun bir tampon içinde stok çözelti katkı maddeleri ve foto-lösin gerekli hacmi hazırlayın. 0.22 um steril filtre ile stok çözelti filtre. </li><li> Protein, eksipiyanlar pLeu ve tampon solüsyonları kullanılarak Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, formülasyonları hazırlamak. </li><li> 0.22 um steril filtre içinden filtre örnekleri adım 1.3 ile oluşan herhangi bir yağ çıkarılır. 2 ml&#39;lik cam şişelere 0.2 ml olarak ayrı ayrı örnekleri doldurun. Sspl-MS çalışmalarında pLeu etkinleştirmek için UV (365 nm) ışık şeffaf cam şişeleri kullanın. </li><li> Bir liyofilizerde yük flakon ve uygun bir liyofilizasyon döngüsü tasarlayarak liyofilizasyon başlatmak. <ol><li> Burada, -40 ° C &#39;de örnekleri dondurma ve ardından12 saat süre ile 25 ° C&#39;de 12 saat ve ikincil kurutma 35 ° C&#39;de vakum altında (70 mTorr) altında esas kurutma yapılır. Liyofilizasyon döngüleri ve kurutma yöntemleri Diğer (örneğin, sprey kurutma) de kullanılabilir. </li></ol></li><li> Kapatma önce azot ile liyofilize örneklerini içeren şişeleri Dolgu. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Formülasyonlar </td><td colspan="5"> Bileşim (mg / ml), liyofilizasyon öncesinde </td></tr><tr><td> Mb </td><td> Trehaloz </td><td> Sorbitol </td><td> pLeu c </td><td> Potasyum fosfat, pH 7.4 </td></tr><tr><td> MBT bir </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> MBS, bir </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> MBT + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 14.3 x 10 -3 1.43 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> MBS + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> 14.3 x 10 -3 1.43 </td><td> 0,4 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:..., Liyofilize Mb formülasyonları Bileşim ssHDX-MS çalışma için kullanılan formülasyonlar, Sspl-MS çalışma için kullanılan b formülasyonlar C, L-2-amino-4,4-azipentanoic asit ya da foto-lösin (pLeu). pLeu 1x tekabül eden beş farklı konsantrasyonda (14.3 x 10 -3 1.43 mg / ml), Mb 10x, 20x, 50x ve ​​100x mol fazlası MBT ve MBS formülasyonları ile birlikte liyofilize edildi. Sağlam protein 2. ssHDX-MS <ol><li> K 2CO D 2 O previousl bir 3-200 mi doymuş bir miktarda (~ 440 g) ilave edilirY bir desikatör alt bölme içine yerleştirilmiştir. Hava geçirmez bir desikatörde mühür ve% 43 ulaşıldığında ~ kararlı bir bağıl nem (BN) kadar 5 ° C&#39;de dengelenmeye gelmeye bırakın. Çevrede bulunan nem değerleri farklı doymuş tuz çözeltileri 23,24 seçilerek elde edilebilir. </li><li> Desikatör üst bölme içinde liyofilize proteini içeren kapaksız şişeleri yerleştirerek ssHDX tepkileri başlatın. Kurutucu hava geçirmez mühür ve HDX (Şekil 2A) yapılmasına izin vermek için 5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. </li><li> Üçlü olarak çeşitli zamanlarda ssHDX örnekleri toplamak. Mb formülasyonlar için, dokuz zaman noktalarında, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 ve 144 saat bir numune toplayın. </li><li> Hemen desikatöre çekilerek sonra şişeleri Cap ve sıvı azot içinde şişeleri dondurma flaş tepkileri gidermek. Kütle spektrometrik analiz edilinceye kadar -80 ° C&#39;de saklayın şişesi kullanılmıştır. </li><li> Uygun yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografisi-kütle Spectrom kullanarak örnekleri analiztrisi (LC-MS) bir yöntem. Tasarım veya numune analizi sırasında geri-alışverişini en aza indirmek için uygun bir soğutmalı LC sistemi satın. Sütun soğutma ünitesinin kurulumu kullanarak ve LC-MS yöntemi daha önce 25 bildirilmiştir. NOT: amid proton değişim oranı pH ve sıcaklığa bağlıdır yana, protein dahil döteronlar, mobil faz hidrojen mevcut (&quot;arka değişim&quot;) ile alışverişi bilgi kaybına neden olabilir. Söndürme tamponu ve HPLC çözücülerin bir asidik pH değeri (pH 2.5), sıcaklığı düşürmek için, büyük ölçüde geri-dönüşüm en aza indirmek mümkün olmakla birlikte (≤0 ° C) daha fazla geri değişimi proteini korumak uygun bir kolon soğutma sistemi ile . </li><li> Otomatik tuz giderme ve yıkama işlemini kontrol vana örnek döngü ve protein tuzak bağlayın. 200-3,200 m / z aralığı içinde kütle spektrometreye bir TOF düşük bir konsantrasyonu ayarlama karışımı enjekte edilerek kütle spektrometresi kalibre edin. immobilizePepsin kolonu ve analitik kolon Sağlam protein analizi için gerekli değildir. </li><li> ° C ≤0 ve ~ 0 ° C arasında bir sabit çalışma sıcaklığına ulaşmak için sistem beklemek soğutulmuş sistemde sıcaklığı ayarlanır. </li><li> Hızlı kütle spektrometrik analizi için sıvı azot içine -80 ° C ile ilgili örnekleri aktarın. Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde sıvı azot her şişe çekme ve şişeye su içinde% 0.2 formik asit (FA) (pH 2.5) ve% 5 metanol içeren buz gibi soğuk söndürme tamponu belirli bir hacminin ilave edilmesiyle hazırlandı örnek sulandırın. </li><li> Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, bir gradyan kullanılarak,% 5 asetonitril,% 95 su ve% 0.1 formik asit (FA) ve elute 1.7 dakika boyunca, protein tuzağı olarak 20 pmol Mb içeren desalt numune% 80 asetonitril,% 20 su ve 0.1 yükselmiştir 3.3 dakika içinde% FA. M / z aralığında 200-3,200 üzerinde kütle spektrumları toplayın. </li><li> Sağlam kütlesini belirlemek içinProtein, Aşama 2.9 yöntemi kullanılarak bir sulu çözelti içinde bir Dötere edilmemiş protein örnek (değil ssHDX tabi yani protein) için veri elde. </li><li> Veri analiz yazılımı kullanılarak ham spektrumları karmaşıklığını aydınlatmak suretiyle Dötere edilmemiş ve döteryumlu numune kütleleri elde edilir. Burada, 15,000-18,000 Da, 1.0 Da&#39;lık kütle çözünürlüğü ve Mb kütlesinin hesaplanması için% 90 pik yüksekliğine göre kütle aralığı ayarlamak. </li><li> Her değişim bir zaman noktasında döteryumlu protein kitle Dötere edilmemiş proteinin kütlesini çıkarılarak sağlam protein (burada, Mb) dahil döteronların sayısını hesaplayın. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak teorik maksimum yüzde döteryum alım göreli hesaplayın (Denklem 1) <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq1.jpg" width="500px" /> Değiştirilebilir amidler = amino asit toplam sayısının burada toplam sayısı - prolin artıkları sayısı - N- 2 (&quot;2&quot; hesaplarhızlı geri değişimini tabi terminal amino grubu ve amid hidrojen). </li><li> Uygun bir üstel denklem kullanılarak ssHDX kinetik verileri takın. Bir bieksponensiyaldir denklem (Denklem 2), genellikle ssHDX verilerine makul bir uyum sağlar basit olduğunu. Bu çalışmada, MBT ve MBS için, &quot;hızlı&quot; ve &quot;yavaş&quot; havuzları alışverişi döteronlar atar bir bieksponensiyaldir model verileri uygun. <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq2.jpg" width="487px" /> burada N, hızlı ve N yavaş olarak değiştirilebilir amidlerin sayıda &quot;hızlı&quot; ve sırasıyla, havuzları alışverişi &quot;yavaş&quot;, ve hızlı k ve yavaş k iki havuzları ile ilişkili birinci dereceden hız sabitleri vardır. </li></ol> Peptit Düzeyde Protein 3. ssHDX-MS <ol><li> Aşama 2.6 şu değişiklikler ile kullanılmıştır adımları 2,1-2,8 izleyerek ssHDX gerçekleştirin. Hareketsiz pepsin col bağlayınvanaya UMN ve analitik kolon önce 25 rapor ve bir peptid tuzağı ile vanaya bağlı protein tuzağı değiştirme gibi. 100 1700 arasında değişen oranı şarj etmek kitle ayarlayarak kütle spektrometresi kalibre. Not: çözme işlemi (adım 2.8) sırasında, bir indirgeme maddesi ve denatüre edici madde, disülfür bağları (örneğin, monoklonal antikorlar) proteinlerin pepsin sindirimi kolaylaştırmak için söndürme tamponu içinde içerilebilir. </li><li> Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, bir peptid kapanında 1.7,% 10 asetonitril ile dakika,% 90 su ve% 0.1 FA% 0.1 FA, tuzağı ve desalt peptidlerle Online 20 pmol Mb içeren numuneler özet. 4.0 dakika içinde% 60 asetonitril gradyan artışı,% 40 su ve% 0.1 FA ile analitik sütun üzerine parçaları tasfiye edilir. M / z aralığında 100-1,700 üzerinde kütle spektrumları edinin. </li><li> Bir MS / MS analizi ile peptik parçaları tanımlamakDötere edilmemiş protein örneği. Özel bir veritabanında peptit parçalarının tahmin kitlelere peptid fragmanı iyonlarının deneysel kitleleri karşılaştırmak için kütle spektrometresi yazılımını kullanın. Düşük hata ile kitleleri tanımlamak için bir kalabalıktan kesme noktası (örneğin 10 ppm) olarak ayarlayın. Peptidler uyumlu olarak, (i) bir peptid dizisi, (ii) şarj durumu, ve (iii) tutma süresi oluşan bir listesini hazırlamak. </li><li> Fragmanını sindirmek Her pepsin için dahil döteronların ortalama sayısını harita ve belirlemek için adım 3.3 oluşturulan listeyi kullanın. Bu, uygun HDX-MS verileri analiz yazılımı 24 kullanılarak elde edilebilir. </li><li> Yüzde döteryum alımını hesaplamak için ve peptik parçalarının her biri için ssHDX kinetik verileri uygun adımları 2.13 ve 2.14 izleyin. MBT ve MBS formülasyonlar bir bieksponensiyaldir dernek modeli (Denklem 2) monte edildi Bu çalışmada, altı olmayan gereksiz pepsin her biri için HDX kinetik veri parçaları sindirmek. </li></ol> Bozulmamış Pro 4. Sspl-MSproteindir <ol><li> UV çapraz bağlayıcı üzerinde Fotolitik etiketleme reaksiyonu, ilk anahtarı başlayacak ve lambalar 5 dakika ısınmasını bekleyin. UV kaynağı pLeu ve diazirine grubu etkinleştirmek için dalga boyu 365 nm lambaları ile donatılmış olduğundan emin olun. DİKKAT: lambaları açık olduğunda UV çapraz bağlayıcı kapısını açmayın. Kaynak UV koruyucu cam kapı ile kapalı değilse, UV ışığına maruz gözleri ve cildi koruyun. </li><li> Kapıyı açmadan önce UV çapraz bağlayıcı kapatın. Lambaları kapalıdır sonra, liyofilize edilmiş formülasyonu içeren şişeler şapkasını çıkarmak ve Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, UV çapraz bağlayıcı odasının içine yerleştirin. 40 dakika boyunca UV ışığı ile örnekleri ışın tedavisi. </li><li> PLeu ve (ii) pLeu ile liyofilize örnekler içinde yeniden susuz liyofilize: (i) örnekleri için 4.3&#39;e adım 4.1 izleyerek kontrol deneyleri yapın. </li><li> Kapak kütle spektrometrik analiz zamanına kadar -20 ° C de küçük şişeler depolamak ve. </li><li> Reconstit2 uM konsantrasyonu getirmek için kütle spektrometresi dereceli damıtılmış su, uygun bir hacim ilave edilerek bir katı madde örnekleri katkı sağlayacaktır. </li><li> Örnek analizi başlamak için, adımları 2.6 ve 2.9 izleyin. NOT: Arka-değişim kovalent etiketleme ile ilgili bir sorun olmadığından, Sspl-MS özel soğutmalı LC sistemi gerektirmez. </li><li> Proteinin basit bir kütle belirlemek için, adım 2.9 izleyerek Sspl tabi tutulmamış olan bir protein numunesi için veri elde. Adım 2.11 açıklandığı gibi ham spektrumları çözümlenmesiyle ile etiketsiz ve etiketli örnekleri kitleleri edinin. </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak Incorporated pLeu sayısını hesaplayın: <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq3.jpg" width="438px" /> M L işaretlenmiş proteinin kütlesi burada, E, N, doğal proteinin, kütlesi ve 115 (Da), tek pLeu dahil aşağıdaki doğal proteine ​​ilave ortalama kütlesidir. İşaretleme reaksiyonu th oluşur NotN 2 e kaybı (28 Da). pLeu bölgesinin monoizotopik kütle 143,07 olup. </li><li> Ekstre iyon kromatogramlardan pik yükseklikleri kullanılarak etiket farklı sayıda protein popülasyonlarının yüzdelerini hesaplayınız. <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq4.jpg" width="401px" /> &quot;i&quot; etiket sayısını ifade etmektedir, pH ı kütle spektrometresi ile görüldüğü gibi, etiketlenmiş bir protein L i ve pH için, pik yüksekliği u işaretlenmemiş protein pik yüksekliği anlamlarına gelmektedir. </li></ol> Peptit Düzeyde Protein 5. Sspl-MS <ol><li> Adımları 4,1-4,4 takip ederek Sspl gerçekleştirin. </li><li> Peptid seviyesi analizi için, amonyum bikarbonat tampon maddesi (100 mM, pH 8.0) içinde bir katı madde örnekleri sulandırın. </li><li> Sulandırıldıktan sonra 10 de tripsin ile etiketlenmiş protein çözeltisi karıştırın tripsin proteinin 1 mol oranında ve 16 saat süre ile 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> FA% 0.1 ekleyerek reaksiyonu söndürmekörnek su içinde 2 uM protein nihai konsantrasyon elde edilir. </li><li> HPLC sistemine bağlı vanaya örnek döngü, peptid tuzak ve analitik sütun bağlayın. </li><li> Uygun bir HPLC ve kontrol yazılımı kullanarak kütle spektrometresi yöntemi Program. Mb formülasyonlar için, gradyan ile analitik sütunda bir elüsyon ile,% 5 asetonitril,% 95 su ve% 0.1 FA ile 1.5 dakika boyunca, bir peptit kapanında peptidler örnek döngüsünün içine sindirilmiş protein 20 pmol enjekte ve tuzunun giderilmesi 22 dakika içinde% 55 asetonitril,% 45 su ve% 0.1 FA artar. M / z aralığında 100-1,700 üzerinde kütle spektrumları toplayın. </li><li> Böyle daha önceden sağlam protein analizi hesaplanan pLeu numaraları ile EXPASY 26 gibi bir çevrimiçi araç kullanarak adüktlerinin peptid-pLeu için bir teorik kitle listesi hazırlayın. En az 4 bölünmelere cevapsız ekleyin. İşaretleme reaksiyonu N2 kaybı ile ortaya çıkar unutmayın. Etiketsiz deneyin Bu nedenle, peptid-pLeu aduktu kütlesi = kütleptic peptid + N (pLeu kütlesi) - N &quot;N&quot; dahil pLeu sayısını, (N2 kütlesi). NOT: sağlam proteinin kitle analizi, protein üç etiketli nüfusa kadar gösterseniz, peptid başına üç olası pLeu etiket kadar düşünün. 1 (28) = 1115 Da - 1000 Da&#39;lık kütle ile bir peptid için, 1 pLeu dahil edilmesi ile peptid pLeu adüktün teorik kütle 1000 + 1 (143) &#39;dir. Benzer bir şekilde, peptid-pLeu teorik kütleleri sırasıyla vb 1230 Da, 1345 Da olacak vb 2 pLeu, 3 pLeu, ekleri de içerir. </li><li> Deneysel gözlenen kitleler ile adım 5.7 oluşturulan teorik kitle listesini maç kitle analiz yazılımı kullanın. Düşük hata ile kitleleri tanımlamak için bir kalabalıktan kesme noktası (örneğin, 50 ppm) olarak ayarlayın. </li><li> Peptidler eşleşti için, pLeu gerçek sayısının M L ve M N etiketli kitleler vardır aşama 4,8 (Denklem 3), altında formül kullanılarak dahil belirlemeksırasıyla yerli peptit. </li></ol>

<ol><li>Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Billion+dollar+babies--biotech+drugs+as+blockbusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.</a> Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+Markets+and+Manufacturing+Technologies+for+Protein+Drugs%22">Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs</a>. , BCC Research. BIO021D(2013).</li>
<li>Lai, M. C., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+chemical+stability+of+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid-state chemical stability of proteins and peptides.</a> J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).</li>
<li>Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+some+practical+advice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice.</a> Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).</li>
<li>Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice.</a> Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+in+solution+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).</li>
<li>Ilari, A., Savino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+by+x-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination by x-ray crystallography.</a> Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+and+NMR+reveal+complementary+views+of+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics.</a> Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).</li>
<li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+pharmaceutical+solids%3A+preparation%2C+characterization+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization.</a> Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).</li>
<li>Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+infrared+spectroscopy+to+monitor+protein+structure+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability.</a> Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).</li>
<li>Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+solid-state+analysis+of+freeze-dried+protein+formulations+using+NIR+and+Raman+spectroscopies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).</li>
<li>Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+determination+of+protein+conformation+in+the+solid+state+using+near+infrared+%28NIR%29+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy.</a> J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).</li>
<li>Pikal, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+state+chemistry+of+proteins%3A+II.+The+correlation+of+storage+stability+of+freeze-dried+human+growth+hormone+%28hGH%29+with+structure+and+dynamics+in+the+glassy+solid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid.</a> J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).</li>
<li>Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sucrose+level+on+storage+stability+of+proteins+in+freeze-dried+solids%3A+II.+Correlation+of+aggregation+rate+with+protein+structure+and+molecular+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility.</a> J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).</li>
<li>Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+protein+secondary+structure+during+spray-drying+of+antibody%2Fmannitol+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+monoclonal+antibody+against+human+thrombin+by+H%2FD-exchange+mass+spectrometry+reveals+selection+of+a+diverse+sequence+in+a+highly+conserved+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein.</a> Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).</li>
<li>Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+coupled+with+immobilization+of+antibody%2C+on-line+proteolysis%2C+liquid+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid.+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).</li>
<li>Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+based+tools+to+investigate+protein-ligand+interactions+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).</li>
<li>Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+differentially+affect+IgG1+conformation+and+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photolabile+ligands+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Using photolabile ligands in drug discovery and development.</a> Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).</li>
<li>Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+combined+with+mass+spectrometric+approaches+as+a+tool+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li>
<li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Research+of+the+National+Bureau+of+Standards%22%5BJournal%5D)">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8(1977).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li>
<li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+inexpensive+refrigerated+LC+system+for+H%2FD+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li>
<li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen%2FDeuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+%28ssHDX-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li>
<li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li>
<li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839(2013).</li>
<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2FD+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics%3A+is+there+a+need+for+a+top-down+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li>
<li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Çeşitli çalışmalar liyofilize örneklerinde yerel çevre proteini bozulmasını 5,29,30 etkilediğini düşündürmektedir. Ancak, katı halde protein yapısı ve istikrar arasında doğrudan bir ilişki kurarak, yüksek çözünürlüklü analitik yöntemlerin eksikliği mümkün olmamıştır. liyofilize tozlar böyle HDX ve PL gibi mevcut yüksek çözünürlüklü yöntemlerinin uygulama çözümü protokolleri ve dikkatli veri yorumlama değişiklik gerektirir. HDX-MS ve PL-MS arda katı halde protein konformasyonlar izlemek için kabul edilmiştir. Sonuçlar Burada sunulan ve başka 27,28,31-33 katı ortamda yüksek çözünürlüklü protein yapısını izlemek için bu yöntemlerin yeteneğini göstermiştir. Veri analizinde kritik adımlar çözelti 34-36 etiketleme farklılık olmasa da, deney düzeneği ve veri yorumlama sırasında önemli hususlar katı-hal kemi için gereklidircal etiketleme. Etiketleme reaktif seçimi boyutu ve etiketleme mekanizmasına dayalı olmalıdır. döteryum küçük boyutlu pLeu görece büyük boyutlu yan zincirlere etiketleme sınırlar ise peptid omurgası, kolaylıkla araştırılabilir sağlar. Bu etiketleme sadece matris omurgada hem de yan zincir maruz bağlıdır, böylece ssHDX ve Sspl ikisi de herhangi bir amino asidi için tercih gösterir. Etkin bir solid-state protein konformasyonlar prob, etiketleme sürecini etkileyen dış faktörler dikkatle kontrol edilmelidir. toplam miktarı ve liyofilize katı olarak işaretleme maddesi alansal dağılımı, sulu çözeltiler farklıdır. SsHDX olarak, katı bir matris içinde D 2 O miktarı açılma protein oranı (veya kısmi açılması), yeniden katlama ve döteryum değişimi etkileyebilir. Bu protein, örneği, normal olarak, D 2 O geniş bir hacmi ile seyreltilmiş halde bir çözelti HDX, durum böyle değildirSsHDX oranı hidrasyon etkilerinin dikkatli bir şekilde tarama doğru RH koşullarının seçimi bilgilendirebilir. Nem sorpsiyon hızını kontrol ve higroskopik yardımcı maddeler (örneğin, sakaroz ve trehaloz) ihtiva eden formülasyonlar tozun çökmesini önlemek için, ssHDX soğutulmuş koşullar altında gerçekleştirilebilir (2-8 ° C). Beklendiği gibi hidrasyon etkileri üzerine önceki çalışmamızda, nem içeriğinin artması ile döviz kurunu ve kapsamını artış gösterdi. Çalışmalarımız, 5 ° C sıcaklıkta% 43 oranında bir ara RH &#39;nın büyük bir bölümünde, makul bir süre 24 formülasyonlan ayırt ideal olduğu kanıtlanmıştır. bir plato elde edilene kadar reaksiyon genellikle gerçekleştirilir. Bu katı madde halinde nem emiş ve difüzyon HDX hızını kontrol yok olmasını sağlar. ≤2 ml önceden liyofilizasyon hacmi küçük katı numune boyutları kullanımı da, D 2 O buharı emilmesi, erken dönemde değişimi esas itibarıyla tamamlandığında sağlamaya yardımcı olur. Olsa ssHDX-MS içerirKatı-devlet proteinin yapısındaki kantitatif bilgiler, verilerin yorumlanması tamamen yalnız ssHDX çalışmaya dayanarak olamaz belirli koşullar vardır. Bu azalma döteryum alımı nedeniyle, protein yapısının en yüksek tutma ve numune içinde mevcut bulunan protein unsurlarının önemli miktarda olabilir (kontrol ile karşılaştırıldığında) bir numunede gözlemlenen mümkündür. Böyle bir durumda, ssHDX verilerin yorumlanması diğer tamamlayıcı yöntemler sonuçları gerektirir. Döteryumlu kütle spektrumları zirve genişleme birkaç Mb formülasyonlar 27,28 gözlenmiştir. Bu D 2 O konsantrasyonu numune kısmen katlanmamış protein nüfus, mekansal heterojenlik varlığı veya mekansal geçişlerini gibi çeşitli faktörlere bağlı olabilir. Ancak, bu faktörler ssHDX-MS ayırt ve daha fazla araştırma ihtiyacı değildi. Sspl-MS nispeten yeni olduğu gibi diğer yöntemlerle, sürekli öğrenme ab göreuygulamaları ve sınırlamaları dışında gerekmektedir. Sspl olarak, foto-çapraz-bağlayıcı protein ile liyofilize edilir. nem eksikliği katı matris içindeki bileşenlerin hareketliliğini kısıtlar ve ssHDX nem emilimi ile oluşabilecek kısmi yapısal gevşeme Sspl bir fenomen değildir. Bu foto-çapraz bağlayıcı hemen yakınında için Sspl olarak etiketleme sınırlar. Bununla birlikte, HDX-MS, tortu seviyesi yapısal bilgiler elde edilebilir kovalent olarak işaretlenmiş proteinin, MS / MS analizi farklı. Sspl etiketleme kovalent ve geri dönüşü olmayan bir olduğu için, geri değişimi meydana gelmez ve numuneler hazırlanmış ve etiketin kaybı göz önüne alınmadan analiz edilebilir. Işaretleme maddesi difüzyonunu kolaylaştırmak ve katı matris içinde etiketleme verimliliğini artırmak için, Sspl artan% RH ile gerçekleştirilebilir. pLeu alınmasından da fotoreaktif ajanın artan konsantrasyonu ile geliştirilebilir. istenildiği gibi pLeu proteinin mol oran isteğe göre ayarlanabilir. Genel olarak, pro pLeu bir 100x mol fazlasıproteindir yeterli etiketleme sağlayacaktır. Bununla birlikte, yüksek pLeu konsantrasyonu katı matris protein üçüncül yapısının kaybına neden olabilir. Bu nedenle, etiket kinetik ve formülasyon bileşimine ek olarak, pLeu konsantrasyonu seçimi aynı zamanda, protein, yapısal bütünlüğünü muhafaza dayanmalıdır. PLeu seçilmeden XH etiketler gibi grup, bu mümkün (X = C, N, O nerede) benzer etiketleme siteleri ile yardımcı maddeler büyük ölçüde protein etiketleme düzeyini etkileyebilir. Protein etiketleme için pLeu mevcudiyetindeki eksipiyan parazit henüz karakterize hale getirilecektir. Bu diazirine aktivasyonu üretilen karben tortu özgü olmadığı bilinmektedir, ancak bir çalışma Asp ve Glu 36 doğru önyargı bildirir. Bu tortu, spesifik etkileşimleri hakkında bilgi edinmek için iyi olsa da, peptid seviyesi bilgiler de yararlıdır ve katı halde, yüksek matris maruz bölgeleri bloke etme yardımcı maddeleri tasarlamak için de kullanılabilir. Sspl-MS Ancak, detaylı niteliksel bilgi sağlarnicel veriler elde edilmesi gerekiyor ve sağlam ölçütler liyofilize sistemleri çeşitli genelinde formülasyon farklılıklarını analiz etmek geliştirilmesi gerekmektedir. MS / MS analizi ile birlikte, bir tortu, spesifik etiketin kullanımı, ayrıca aşağıdaki amino asit seviyesine çözünürlüğünü artırabilir. Örneğin 2,3-bütandion olarak etiketleme ayıraçları, Arg, Cys Lys ve N -alkylmaleimide türevleri, N-hidroksisukinimid türevleri tam da liyofilize toz moleküler etkileşimlerini eşleştirmek üzere kullanılabilir etiket. Bununla birlikte, bu reaktifler pH değerine bağımlı ve reaksiyon katı-halde fotolitik etiketleme gibi iyi kontrol olmayabilir. Bir alternatif yaklaşım, oksotrofik hücre çizgileri, mevkiye yönelik mutagenez ya da yan zincir türetme kullanımı ile protein dizisi olarak foto-çapraz bağlayıcı dahil etmektir. Daha önceki ssHDX-MS, Sspl-MS çalışmalar proteinin etiketlenmesi eksipiyan doğasına ve miktarına bağlı olduğunu göstermiştir24,27,28,31-33,37,38 kullanılır. Mb düşük molekül ağırlığı 32 şeker ile-liyofilize ko daha Mb ssHDX-MS guanidin hidroklorür (Gdn.HCl) ile birlikte liyofilize eş daha döteryum alımını göstermektedir. Gdn.HCl sakaroz 33 ile Mb&#39;den fotolitik etiketleme karşı daha fazla koruma gösterdi ayrı bir Sspl-MS çalışmasında, Mb-liyofilize eş. Bundan başka, ssHDX-MS sayısal ölçümler yüksek uzun süreli depolama sırasında 28 protein stabilitesi ile ilişkilendirilmiştir. Bu çalışmalar, protein ssHDX veya Sspl liyofilize toz bulunan proteininin yapısal tutma derecesini yansıtır düşündürmektedir. Biz liyofilize tozlar ikincil yapının tutma yan zinciri pLeu ile etiketleme ve döteryum değişiminden amid hidrojen korunması için elverişli bir ortam oluşturduğuna inanıyoruz. Bununla birlikte, bu yöntem ile ilgili bilgi içeriğinin detaylı karşılaştırma gelecekte yapılması gerekmektedir. SsHDX-MS ve Sspl-MS programı kuran rağmenBir formülasyon tarama aracı olarak birçok proteinler uygulanabilir sonuçta gerektirir, son çalışmaların sonuçları daha geniş benimsenmesini desteklemektedir. Daha da geliştirilmesi, bu yöntem, ilaç endüstrisinin katı-hal protein formülasyonlan karakterize etmek için yaygın olarak faydalı olması beklenmektedir.

Protein ilaçlar biofarmasötik endüstrisinin en hızlı büyüyen sektör olan ve hormonal bozukluklar, kanser ve otoimmün hastalıklar 1 olmak üzere daha önce inatçı hastalıklar için umut verici yeni tedaviler sunuyoruz. 2012 yılında, küresel Biyoterapötikler pazarı 138.000.000.000 $ ulaştı ve yıl 179.000.000.000 $ ulaşması bekleniyor 2018 2. Proteinler büyük ve geleneksel küçük molekül ilaçların daha kırılgan ve böylece bozulması 3 birçok türleri daha hassastır. (Örneğin, dondurularak kurutulmuş) bir katı madde tozlar liyofilize yeterli raf ömrü ve stabilitesini sağlamak için, protein ilaçlar genellikle formüle edilir. Bununla birlikte, bir protein yine doğal yapısı Liyofilizasyon işlemi esnasında 4,5 &#39;korunmaz, özellikle katı halde bozulma tabi olabilir. Bu yapı muhafaza edilmiştir sağlanması sufficien ile katı halde protein yapısını sondalamak analitik yöntem bulunmaktadır geçerli olabilmesit çözünürlüğü. NMR spektroskopisi 6 ve X-ışını kristalografisi 7 çözüm ve kristallerin 8 protein yapısını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan yüksek çözünürlüklü yöntemleri vardır. Için yardımcı maddeler ve kullanılan işleme yöntemlerinin doğası, iyofilleştirilmiş protein, formülasyonlar, genellikle amorf yerine 9 kristaldir. homojenlik ve mikroskopik seviyede olmaması şekilsiz katılar proteinler için, yukarıda belirtilen teknikler kullanışsız hale getirir. Fourier kızılötesi spektroskopi (FTIR) 10 dönüşümü, Raman spektroskopisi 11 ve yakın kızılötesi spektroskopi (NIR) 12 düzenli yerli çözüm devlet yapısının buna liyofilize tozlar protein ikincil yapısını karşılaştırmak için biofarmasötik endüstrisi tarafından kullanılmaktadır. Ancak, bu yöntemlerin düşük çözünürlüklü ve sadece ikincil yapı küresel değişimler hakkında bilgi verebilir. FTIR kullanılarak katı-hal yapısal karakterizasyonuUzun vadeli depolama stabilitesi zayıf 13,14 veya kötü 15 korelasyon ya göstermiştir. Bu sınırlamalar uygun yüksek çözünürlüklü yöntemleri solid-state protein yapısal tedirginlikler tanımlamak için ihtiyaç vurgulayın. Proteoliz ve kütle spektrometrik analiziyle birlikte kimyasal etiketleme, sulu çözelti içinde, protein yapısı ve molekül etkileşimleri izlenmesi için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. İlaç gelişmede, HDX-MS protein ilaçların 19 uyum post-translasyonel modifikasyonlar etkilerini izlemek için, reseptör-ilaç etkileşimleri 18 harita ve karşılaştırmak için, antijen-antikor etkileşimleri 16,17 epitop haritalama için kullanılır olmuştur biyobenzerlerin 20 gelişmekte olan partiden partiye varyasyonu. Benzer şekilde, foto-aktifleştirilebilen ligandlar ilaç hedeflerini tanımlamak ve bağlanma afinitesini ve ilaç-reseptör etkileşimleri 21,22 özgüllüğünü belirlemek için kullanılmıştır. Extend liyofilize formülasyonlar bu yöntemlerin uygulanması, bizim grup geliştirdi katı-hal hidrojen döteryum değişim kütle spektrometresi (ssHDX-MS) ve katı-hal fotolitik etiketleme kütle spektrometresi (Sspl-MS) liyofilize örneklerinde protein konformasyonlar ve yardımcı madde etkileşimleri çalışmak için Yüksek çözünürlükte. SsHDX-MS ve Sspl-MS Her iki protein, liyofilize katı madde ideal tepkime koşulları altında işaretlenir, ve numuneler daha sonra tekrar oluşturulmuş ve veya proteolitik sindirim olmayan kütle spektrometresi ile analiz edilir. Sspl-MS yan zincirlerinin çevre bilgileri (Şekil 1) içerir ise ssHDX-MS, döteryum buhar ana zincir maruz hakkında bilgi sağlar. iki yöntem böylece katı halde protein yapısındaki hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir. Burada, biz Mb, (Şekil 2) ssHDX-MS ve Sspl-MS kullanılarak liyofilize katı proteinleri okuyan kullanımı için genel bir protokol sağlamakbir model, bir protein. Iki farklı yardımcı maddeler ile formülasyonlar farkını ayırt etme iki yöntemden kabiliyetini gösterir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> Şekil 1:., Farklı etiket mekanizmalarla liyofilize katılar ssHDX ve Sspl ölçer protein yapı (A) &#39;HDX olarak, omurga amid, bir protein yapısı ve fonksiyonu ve D 2 O erişim olarak döteryum ile değişimi hidrojenlerin. Katı halde, hızı ve döteryum değişimi derecesi D 2 O sorpsiyon protein hareketlilik (yayılan ve olayları tekrar katlama) ve katı bir matris içinde mevcut katkı maddelerinin doğası düzeyine bağlıdır. PLeu bölgesinin diazirine işlevsel grup ara ürün, bir reaktif karben oluşumunu başlatır ve bir XH bağı (X, herhangi bir atomu olması durumunda) veya reklama spesifik olmayan sokulur mil PL (B), 365 UV ışınlamayakın çevresinde bir C = C bağı boyunca pro-. Katı halde ise bu oran ve etiketleme ölçüde lokal işaretleme maddesi konsantrasyonu, uygulama süresi, protein yapısı ve katı bir matris içinde mevcut katkı maddelerinin doğasına bağlıdır. Paneller A ve B proteininin, sırasıyla omurga ve yan zincirler üzerinde oluşabilecek maksimum teorik etiketleme göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> Şekil 2: şematik gösterimi katı hal HDX-MS (A) ve liyofilize edilmiş bir formülasyona protein PL-MS (B) gerçekleştirildi.

<table><tbody><tr><td>At miyoglobini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0630-5G</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - Trehaloz dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T9531</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># 240850</td><td></td></tr><tr><td>L-Foto-lösin</td><td>Thermo Scientific</td> <td># 22610</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P0662</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3786</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum Oksit</td><td>Cambridge İzotop Laboratuvarları</td><td>#DLM-4-PK</td><td>Alternatif (Kat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>İmmobilize pepsin</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td> <td># 2-3132-00</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Promega</td><td>#V511A</td><td>Kimotripsin (Kat. Hayır .: #V1062, Promega) ek olarak kullanılabilir</td></tr><tr><td>Su, Optima LC / MS sınıfı</td><td>Fisher Chemical</td> <td># 7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 34998</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Thermo Scientific</td> <td># 28905</td><td></td></tr><tr><td>ESI-TOF Kalibrant</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>#G1969-85000</td><td>Son derece yanıcı sıvı</td></tr><tr><td>Protein mikrotrap</td><td>Michrom Biyolojik kaynaklar</td><td>TR1/25108/03</td><td></td></tr><tr><td>Peptit mikrotrap</td><td>Michrom Biyokaynaklar</td><td>TR1/25109/02</td><td></td></tr><tr><td>Analitik sütun</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td></td></tr><tr><td>Dondurarak kurutucu</td><td>VirTis AdVantage Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker beş adet 365 nm lamba ile donatılmıştır</td><td>Stratagene Corp.</td><td>Stratalinker 2400</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>1200 serisi</td><td>HDX-MS</td></tr><tr><td>ESI-qTOF MS</td> için LC Soğutmalı LC sistemi <td>Agilent Technologies</td><td>6520 qTOF</td><td></td></tr><tr><td>HDExaminer (HDX-MS veri analiz yazılımı)</td><td>Sierra Analytics</td><td></td><td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td></tr></tbody></table>

kitle spektrometrik liyofilize toz protein yapısı ve etkileşimler eğitim yaklaşımları

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Kütle spektrometrik analizi ve ardından amid hidrojen / döteryum değişimi (ssHDX-MS) ve yan zincir fotolitik etiketleme (Sspl-MS), protein terapötiklerinin liyofilize formülasyonlan karakterize edilmesi için yararlı olabilir. Uygun proteolitik sindirme ile, ardından etiketleme protein yapısı ve etkileşimleri peptid seviyesi çözünürlüğü ile eşlenmesi sağlar. Protein yana yapı elemanları, ana zincirleri ve amino asitler, amino asit rezidüleri atomu spesifik etiketleme proteininin yapısı ve biçimi görmemizi sağlar yan zincirleri kimyasal bağların bir ağ tarafından stabilize edilir. Liyofilize katıların (örneğin, FTIR), ssHDX-MS-MS ve Sspl nicel ve site özgü bilgi proteinleri incelemek için kullanılan rutin yöntemlerin aksine. döteryum Kuruluş ve kinetik parametrelerin ölçüde hızlı ve yavaş amid havuzları alışverişi ile ilgili olabilir (N hızlı, N yavaş) ve doğrudan C yansıtırLiyofilize formülasyonlar protein katlanması ve yapısı ree. Kararlı fotolitik etiketleme arka değişimi, ssHDX-MS üzerinde bir avantaj uğramaz. Burada, trehaloz ya da sorbitol ya içeren liyofilize formülasyonlarda bir model protein olarak miyoglobin (Mb) kullanılarak ssHDX-MS ve Sspl-MS hem de ayrıntılı protokolleri sağlar.

Burada, ssHDX-MS-MS ve Sspl liyofilize Mb formasyonların uygunluğu ve katı-hal etkileşimlerine yardımcı maddelerin etkisini incelemek için kullanılmıştır. protein ve bu çalışmada kullanılan katkı maddelerinin konsantrasyonları, Tablo 1 &#39;de verilmiştir. yukarıdaki protokollerin sunulmuştur izleyerek elde edilen liyofilize Mb ssHDX-MS, Sspl-MS analizi ile ilgili Örnek oluşur. Sağlam protein düzeyinde döteryum alımı ssHDX-MS sağlam düzeyde Mb formülasyonlar ayırt edebilmektedir. Formülasyon MBS ssHDX 144 saat müteakiben intakt Mb deconvoluted kütle spektrumları formülasyon MBT (Şekil 3A) daha büyük döteryum alımını göstermektedir. Ortalama olarak, MBS MBT (Tablo 2) den% 46 daha fazla döteryum alımı gösterdi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; Şekil 3: ssHDX-MS sağlam Mb için: formülasyonlar gelen döteryumlu sağlam Mb (A) deconvoluted kütle spektrumları MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi) ssHDX 144 saat takip. Dötere edilmemiş sağlam Mb deconvoluted kütle spektrumu da (noktalı çizgi) gösterilir. (B) formülasyonlarda olduğu gibi Mb için ssHDX kinetiği MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi). ssHDX zaman ders (SD ± n = 3) Grafik Pad Prism yazılımı sürüm 5 ile iki fazlı üstel dernek için bir denkleme takıldı. sağlam MBS ve MBT için dötertumlanma kinetik erken zaman noktalarında (1-4 saat) benzer, fakat MBS zaman (8-144 saat) (Şekil 3B) artış ile döteryum değişimi artış gösterdi. Bu düşük nem ve sıcaklık koşullarında ssHDX için uzun zaman noktaları seçerek önemini göstermektedir. Ayrıca, D 2 O emme ve difüzyon süreci erken zaman po ssHDX hızını etkileyebilirint. Daha önceki çalışmalar, ssHDX nem sorpsiyon saatlik bir süre içinde tamamlanır ve bu sure geçtikten sonra kinetik alışverişi için en az bir katkı sağladığı göstermiştir. gözlenen hızı ve değişim ölçüde bu nedenle sadece D 2 O adsorpsiyon 27,28 ölçütleri değildir. Üç bağımsız ssHDX-MS örnekleri standart sapma gösteren Şekil 3B&#39;de küçük hata çubukları, deney yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Döteryum Alım (%) b </td><td> N hızlı c </td><td> Hızlı c k </td><td> N yavaş c </td><td> Yavaş c k </td></tr><tr><td> MBT bir </td><td> 15.9 ± 0.5 </td><td> 13.1 (0.8) </td><td> 0.43 (0.03) </td><td> 11.0 (0.9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> MBS, bir </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15.4 (0.7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> % Değişim d </td><td> % 46 </td><td> % 18 </td><td> % 14 </td><td> % 75 </td><td> % 26 </td></tr></tbody></table> Tablo 2:. Mb formülasyonların ssHDX çalışmalarında döteryum alımının niceliksel ölçümleri bileşimi için Tablo 1&#39;e bakınız kuramsal maksimum b yüzde döteryum alım görece sağlam Mb göre HDX 144 saat sonra, 5 ° C,% 43 bağıl nem (n = 3 ile. , ssHDX-MS kinetik verilerin doğrusal olmayan regresyon tarafından belirlenen ortalama ± SD). c Parametreleri. Sağlam Mb için döteryum değişimi zamanı ders bieksponensiyaldir dernek modeli (Denklem. 2) takıldı. Parantez içindeki değerler. Regresyon parametrelerinin standart hataları ölçümlerde yüzde değişim calcul vardı dated 100 x [(MBS değeri - MBT değer) / (MBT gelen değer)]. MBT ve MBS için döteryum alım kinetik için regresyon parametreleri (N hızlı, N yavaş, hızlı, k ve yavaş k) Tablo 2&#39;de verilmiştir. N, hızlı ve N yavaş değerler MBT daha MBS, N yavaş farklılıkları daha olmasına rağmen değerleri N hızlı değerlerde farklılıklar daha fazla idi. N yavaş değer MBT daha MBS% 75 daha fazla iken Özellikle, N, hızlı değer, MBT daha MBS sadece% 18 daha fazladır. Bu MBT küçük K yavaş değerlerinin herhangi MBS D 2 O maruz kalan katkı maddeleri ile MB yapısı ya da amid gruplarının korunması daha yüksek tutma olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, detaylı mekanizmaları açıkça anlaşılamamıştır. Her iki formülasyonun için oran sabitleri (hızlı k ve yavaş k) çok benzerdir. peptid seviyesinde Döteryum alımı Pepsin sindirimi takiben 52 peptidlerin bir toplam tespit edilmiştir. MB dizisinin% 100&#39;e karşılık gelen altı artıklı olmayan fragmanlar burada rapor analizi için kullanıldı. Daha önce 24 eden grup tarafından rapor edilen bilgiye, üst üste binen parçaları kullanılarak elde edilebilir. Herbir peptid için toplam yüzde döteryum alımı hesaplandı ve 144 saat numunelerden elde edilen sonuçlar (Şekil 4A) çizilmiştir. Altı peptik parçaları için HDX kinetik &quot;yavaş&quot;, &quot;hızlı&quot; ve değişimi geçiren amid hidrojenin alt popülasyonlar ile tutarlı bieksponensiyaldir davranış (Şekil 4B), gösterdi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> Şekil 4: peptid seviyesinde Mb için ssHDX-MS: 6 olmayan Redu (A) yüzde döteryum alımıformülasyonlarda Mb gelen ndant peptik fragmanlar (gri) MBT ve MBS (beyaz) HDX 144 saat takip. Formülasyonlarda Mb altı olmayan gereksiz peptik parçaları için (B) ssHDX kinetik MBT (düz çizgi) ve MBS (kesikli çizgi). ssHDX zaman ders (SD ± n = 3) Grafik Pad Prism yazılımı sürüm 5 ile iki fazlı üstel dernek için bir denkleme takıldı. Olmayan şekilde peptitler için regresyon parametreleri Şekil 5&#39;te sunulmaktadır. Peptid kısımları için donatılmış hız sabitleri tek amidler, ortalama oranı sabit değildir gibi, peptik parçaları için gözlenen hız sabitleri doğrusal sağlam protein için olan ile ilişkili değildir. Formülasyonlar MBS (fragman 56-69 hariç) peptik parçalarının çoğu N hızlı değerler MBT (Şekil 5A) bu biraz daha fazlaydı. Benzer şekilde, k hızlı değerler genellikle formulatio arasında çok az bir fark gösterdiMb molekülünün (Şekil 5B) farklı bölgelerde ve ns. Ancak MBS N yavaş ve k yavaş değerler MBT (Şekil 5C ve 5D) için daha tüm parçaları önemli ölçüde büyüktür. anakartlardan yavaş yavaş N ve k önemli artış &quot;yavaş&quot; alışverişi havuzlarında amid gruplarının büyük hareketlilik yansıtabilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> Şekil 5: Mb peptik peptidler için ssHDX kinetik parametreleri: Yok hızlı (A), MBT (gri) ve MBS (N yavaş (C), hızlı (B) k ve formülasyonları Mb altı olmayan gereksiz peptik peptidler için ssHDX-MS kinetik verilerin doğrusal olmayan regresyon elde edilen yavaş (D) değerleri k beyaz) (n = 3, ± standart hata). &lt;/ P&gt; Sağlam protein düzeyinde fotolitik etiketleme LC-MS (Şekil 6A) ile tespit edildiği üzere Mb birden fazla MB-pLeu ilave maddelerin oluşturduğu 20x fazla pLeu varlığında ışınlandı. 20x pLeu etiketsiz Mb kütlesine 115, 230 ve 345 Da ilavesi ile 3 etiketlere geldi ile MBT için açılmış spektrumları 40 dakika için ışınlanmış. 20x ile benzer ışınlanmış MBS pLeu LC-MS ile tespit kadar 2 etiketli nüfusa sahip sağlam düzeyde az pLeu alımı gösterdi. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> Şekil 6: Sspl-MS sağlam MB: MBT (düz çizgi) ve 20x fazlası ile etiketlenmiş MBS (kesikli çizgi) için, (A) açılmış kütle spektrumları pLeu (% 5 w / w). Doğal Mb (Mb liyofilize edildi ve pLeu yokluğunda ışınlanmış) olarak açılmış kütle spektrumu noktalı çizgi olarak gösterilmektedir. U </em&gt; Radyasyona maruz bırakıldıktan sonra, etiketlenmemiş kalan proteinin bir popülasyonunu temsil eder. 1, 2 ve 3 pLeu etiket taşıyan protein popülasyonları, sırasıyla 1 litre, 2L ve 3L olarak temsil edilir. Formülasyonlarda olduğu gibi Mb (B) Sspl-MS kinetik MBT (kapalı daireler) ve pLeu konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak MBS (açık daireler). Bütün numuneler 40 dakika süre ile ışınlanmıştır. Hata çubukları, semboller içindedir. (C), formülasyonlar içinde sağlam Mb için Sspl-MS kinetik MBT (kapalı daireler) ve radyasyon, zamanın bir fonksiyonu olarak MBS (açık daireler) (ağ /% 20.7 a) liyofilize edildi ve 100x fazla pLeu varlığında ışınlandı. Hata çubukları, semboller içindedir. Kinetik çalışmalarda, etiketli proteinin yüzde artan ışınlama zamanında (Şekil 6B) ile MBT ve MBS hem katlanarak arttı. MBS her ışınlama zamanında MBT daha az pLeu alımı gösterdi. Her iki formülasyon da 40 dakikada bir düzlüğe ulaşmamıştır ortaya çıktı. Böylece, bir kinetik çalışma bize olabilir<html> eful tam pLeu aktivasyonunu elde etmek için gerekli olan ışınlama süresi belirlemek için. Etiketleme kinetiği pLeu konsantrasyonunun bir fonksiyonu (Şekil 6C) olarak alındı. etiketli proteinin yüzde MBT ve MBS hem pLeu konsantrasyonu artmıştır. Bununla birlikte, pLeu ağ / ağ 20.7% &#39;sinde, MBT pLeu alımında bir azalma olduğunu gösterdi. Bu, yüksek pLeu konsantrasyonda protein yüzeyinden pLeu hariç olmak üzere olabilir. Bu nedenle, pLeu arasında değişen konsantrasyonlarda bir çalışma yüzeyi hariç, protein yüzeyi üzerinde yeterli bir etiketleme sağlayan uygun pLeu konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Bu çalışmada, 20x fazla pLeu fazla peptid seviyesi çalışmalar için seçildi. Genel anakartlardan için gözlemlenen etiketleme pLeu içeren matris kötü yan zincir erişilebilirlik göstermektedir azalmıştır. Bu azaltılmış etiketleme ile sonuçlanır sorbitol mevcudiyetinde, konformasyonel bir değişim ile tutarlıdır. İçerik &quot;&gt; peptid düzeyinde Fotolitik etiketleme Sağlam protein etiketleme çalışmalara dayanarak, 20x aşırı pLeu peptid düzeyinde MBT ve MBS karşılaştırmak için seçildi. İşaretlenmiş örnekler tripsin ile sindirildi ve LC-MS ile analiz edilmiştir. MB dizisinin% 100&#39;e karşılık gelen 40 peptitlerin toplam MBT ve MBS örneklerde tespit edildi. Lys ve / veya Arg kalıntılarını büyük ölçüde etiketlenir, bazı durumlarda, triptik sindirme sınırlı protein sekansı kaplayabilir. Dizisi kapsamını iyileştirmek için, tripsin ve kemotripsin bir karışımı, etiketlenmiş bir protein sindirimi için kullanılabilir. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> Şekil 7: Mb için Sspl-MS peptid seviyesinde: Mb Çizgi temsil trehaloz (A) ve sorbitol (B) &#39;nin mevcudiyetinde, 20x fazla pLeu (ağ / ağ% 5) ile etiketlenir. İşaretlenmiş protein trypsi ile sindirildin ve etiketli peptidler Mb kristal yapısı (PDB Kimliği 1WLA) üzerine eşleştirilmiş. etiketli ve etiketsiz bölgeler sırasıyla, kırmızı ve yeşil renklidir. tripsin sindirimi ile Sspl-MS peptidler etiketli olma konusunda nitel bilgi sağlar. Sağlam düzeyde farklı etiketlenmiş popülasyonlar göz önüne alındığında, pLeu etiketlenmesi ve etiketlenmiş ve etiketlenmemiş peptidlerin iyonizasyon verimleri farklar rasgele mekanizması, sindirim sonrası Sspl-MS için niceliksel ölçümlerini elde etmek zordur. Ancak, nitel bilgiler hala peptid düzeyinde protein yapısal değişiklikler içgörü sağlayabilir. Bu çalışmada, MBT ve MBS hem formülasyonlar protein yüzey en genelinde pLeu alımı gösterdi. Mbs karşılaştırıldığında, peptid fragmanları 32-42, 134-139 ve 146-153 MBT gelen pLeu etiketleme (Şekil 7) gösterdi. Bu durum, bu amino asitlerin yan zincirleri aşağıdaki regio helislerin olarak pLeu maruz olduğunu göstermektedirns MBT matris içinde sağlam. Bunun aksine, MBS matris içinde pLeu etiketleme koruma, bu bölgelerde yapısal değişimleri ile tutarlıdır. Genel olarak, ssHDX-MS ve Sspl-MS sonuçları yöntemler omurgasına (ssHDX-MS) ve yan zincir (Sspl-MS), liyofilize edilmiş protein formülasyonlan içinde maruz kalma ve yardımcı madde etkisi ile ilgili tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü peptid seviyesi bilgi düşündürmektedir .

Burada, katı tozlardaki proteinler için katı hal amid hidrojen/döteryum değişim kütle spektrometrisi (ssHDX-MS) ve katı hal fotolitik etiketleme kütle spektrometrisi (ssPL-MS) için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Yöntemler, formülasyon tasarımında yararlı olabilecek amorf katı haldeki protein konformasyonu ve etkileşimleri hakkında yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlar.

Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Bu prosedürün genel amacı, kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş hidrojen döteryum değişimi ve yan zincir litik etiketleme kullanarak bir proteinin yapısını yüksek çözünürlükte izlemektir. Bu işlem, öncelikle proteinin farklı eksipiyanlar varlığında liyofilize edilmesiyle gerçekleştirilir. Katı hal hidrojen döteryum değişiminde, liyofilize protein, kontrollü bağıl nem ve sıcaklık altında, kapalı bir desikatörde döteryum oksit buharına maruz bırakılır.Litik etiketleme için protein, eksipiyanlar ve fotoreaktif bir ajan ile liyofilize edilir. Daha sonra, ajanı proteine kovalent olarak bağlamak için flakon UV ışığı ile ışınlanır. Her bir yöntem için örnekler yeniden çözündürülür ve kütle spektrometresi kullanılarak hem sağlam protein hem de peptid düzeyindeki çözünürlükte analiz edilir.Bu iki yöntem birbirini tamamlayan bilgiler sağlar. Protein yapısının yüksek düzeyde korunduğu formülasyonlar, azalmış döteryum alımı ve artmış litik işaretleme gösterirken; yapısı bozulmuş olanlar artmış döteryum alımı ve azalmış litik işaretleme gösterir. Hidrojen döteryum değişimi ve foto-çapraz bağlama gibi, kütle spektrometrik analizle eşleştirilmiş kimyasal işaretleme yöntemleri, son zamanlarda canlı desteklerdeki protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için uyarlanmıştır.Bu tekniklerin CD ve FDIR spektroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein yapısının ve ortamının katı halde yüksek çözünürlükle incelenebilmesidir. Başlamak için, bir desikatörün alt bölmesine 200 milliliters deuterium oxide koyun ve doygun bir çözelti oluşturmak için 400 grams potassium carbonate ekleyin; ardından porselen desikatör tablasını içine yerleştirin ve desikatörü hava sızdırmaz şekilde kapatın. %43'e yakın kararlı bir bağıl neme ulaşmak için beş degrees Celsius'ta dengelenmeye bırakın. Sonrasında, liyofilize protein içeren kapağı açık vial'leri desikatörün üst bölmesine yerleştirin, desikatörü kapatın ve beş degrees Celsius'ta inkübe edin.Bir örnek toplamak için hidrojen döteryum değişim reaksiyonunu başlatmak amacıyla, flakonu desikatörden çıkardıktan hemen sonra kapağını kapatın ve ardından flakonu sıvı azotla hızlı dondurarak reaksiyonu durdurun. Kütle spektrometrik analiz aşamasına kadar flakonu -80 °C'de saklayın. Geri değişimi en aza indirmek için örneklerin analizinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi kullanın.Sıvı kromatografi sistemi soğutmalı bir kutu içerisinde nasıl yerleştirilir? Cihazı kurmak için öncelikle, örnek döngüsünü (sample loop) ve protein tuzağını, tuz giderme ve elüsyon süreçlerini kontrol eden valfe bağlayın. Ardından, düşük konsantrasyonlu ayar karışımını kütle spektrometresine enjekte ederek ve kütle-yük oranı aralığını 200 ile 3,200 arasında ayarlayarak sistemi kalibre edin.Ardından, soğutmalı sistemi yaklaşık 0 °C'lik sabit bir çalışma sıcaklığına kadar soğutun. Su içerisinde %0,2 formik asit ve %5 metanol içeren sönümleme tamponunu hazırlayın ve buz üzerinde soğutun. Örnekleri sıvı azota aktardıktan sonra, bir viyali dikkatlice çıkarın ve iki mL sönümleme tamponu ekleyerek örneği yeniden çözün.Ardından uygun bir HPLC ve kütle spektrometrisi yöntemi yükleyin. Buradaki örneği analiz etmek için, protein tuzağındaki 20 picomole miyoglobini %5 asetonitril ve %0,1 formik asit ile 1,7 dakika boyunca tuzdan arındırın. Daha sonra proteini, %80 asetonitril ve %0,1 formik asit seviyesine yükselen 3,3 dakikalık bir gradyan ile elüe edin.Numuneyi enjekte edin ve 200 ile 3.200 kütle-yük oranı aralığında kütle spektrumlarını toplayın. Referans olarak bozulmamış proteinin kütlesini belirlemek için aynı yöntemi, standart protein numunesi ile kullanın. Veri analiz yazılımını kullanarak ham spektrumları dekonvolüsyon işlemine tabi tutarak protein kütlesini elde edin. Miyoglobin numunesi analizi için kütle aralığını 15 ile 18 kilodalton, kütle çözünürlüğünü 1 Dalton ve pik eşiğini %90 olarak ayarlayın. Peptit analizi için numuneleri, bozulmamış proteinler için kullanılan protokolün aynısını kullanarak hazırlayın.Numuneler analize hazır olduğunda, valfe immobilize bir pepsin kolonu ve bir analitik kolon bağlayın ve protein tuzağını bir peptit tuzağı ile değiştirin. Sistemin peptitler için kalibrasyonunu, tam proteinler için yapıldığı şekilde, ancak kütle/yük oranı aralığını 100 ile 1700 arasında ayarlayarak gerçekleştirin; ardından soğutmalı sistemi yaklaşık sıfır derece olan stabil bir çalışma sıcaklığına soğutun. Sistem kalibre edildikten sonra, uygun HPLC ve kütle spektrometrisi yöntemini programlayın.Burada, su içinde %0,1 formik asit ile Pepin kolonunda 20 pikomol miyoglobini sindirin; yöntemi, peptitleri peptit tuzağında %10 asetonitril ve %0,1 formik asit ile 1,7 dakika boyunca tutacak ve tuzdan arındıracak, ardından peptitleri %60 asetonitril ve %0,1 formik asitle artan bir gradyanla dört dakikada elüe edecek şekilde programlayın. Daha sonra, numuneyi enjekte edin ve 100 ile 1700 arasındaki kütle-yük oranı aralığında kütle spektrumlarını toplayın. Peptik fragmanları tanımlamak için tarihsiz bir peptit numunesini tandem kütle spektrometrisi ile analiz edin.Ardından, deneysel olarak belirlenen fragmanı, yazılım tarafından üretilen öngörülen kütlelerle karşılaştırın. Sonra, eşleşen peptitler için yüksek hata payı olan kütleleri elemek amacıyla kütle kesme değerini 10 part per million olarak ayarlayın. Peptit dizisinin yük durumunu ve alıkonma süresini not edin.Peptik fragman başına eklenen ortalama döteryum sayısını hesaplamak için derlenmiş peptit verilerini ve veri analiz yazılımını kullanın. Öncelikle, proteini metin protokolünde belirtildiği şekilde eksipiyan ve lusin ile liyofilize edin. Numuneleri hazırladıktan sonra, 365 nanometrelik UV lambaları içeren bir UV çapraz bağlayıcıyı çalıştırın. Lambaların beş dakika boyunca ısınmasını bekleyin.Lambalar ısındıktan sonra, lambaları kapatın ve formülasyonu içeren kapağı açık vialleri crosslinker haznesine yerleştirin. Örnekleri 40 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın ve kontrol olarak foto lösin içermeyen örnekler ekleyin. Işınlamanın ardından viallerin kapaklarını kapatın ve kütle spektrometrik analize kadar -20 °C'de saklayın. Nihai protein konsantrasyonu 2 µM olacak şekilde kütle spektrometrisi derecesinde distile su ekleyerek örnekleri analiz için hazırlayın.Ardından, örnekleri bozulmamış döteryumlanmış proteinlerde olduğu gibi aynı kütle spektrometrisi yöntemiyle analiz edin. Ancak soğutmalı lc sistemini kullanmayın. Proteinin doğal kütlesini belirlemek için işaretlenmemiş bir protein örneği için kütle spektrometrisi verileri elde edin.Veri analizini, peptit seviyesi analizi için DERATED örneklerinde olduğu gibi gerçekleştirin. İlk olarak, sağlam proteinlerle katı faz fotolitik etiketleme yapın ve bunları -20 °C'de saklayın. Ardından, nihai protein konsantrasyonu 10 µM olacak şekilde örneği 100 mM amonyum bikarbonat tamponu ile yeniden çözün.Numuneyi, protein ile tripsin arasında 10'a 1 molar oranda olacak şekilde tripsin ile karıştırın ve bu karışımı 60 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Bu sırada numune döngüsünü, peptid tuzağını ve analitik kolonu HPLC sistem valfine bağlayın. Proteini sindirdikten sonra, final protein konsantrasyonu 2 µM olacak şekilde suda 0,1% formik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun.Ardından sistemi HPLC ve kütle spektrometrisi yöntemleriyle programlayın. Burada, sindirilmiş miyoglobinden 20 picomoles'i, %5 aceto nitrile ve %0,1 Formic acid ile 1,5 dakika boyunca peptit tuzağına enjekte edin ve tuzdan arındırın; gradyanı 22 dakika boyunca %55 acetyl nitrile seviyesine çıkararak peptitleri elüe edin ve 100 ile 1700 kütle-yük oranı aralığında kütle spektrumlarını toplayın. Peptidin teorik kütlesini hesaplamak için çevrimiçi araç kullanın.Tam protein analizinden daha önce elde edilen foto lisein sayılarıyla birlikte foto lisein addüktü. En az dört kaçırılmış kesim (missed cleavage) ekleyin. Peptit foto lisein addüktü için Excel'de bir kütle listesi oluşturun.Ardından, düşük hata payına sahip kütleleri belirlemek için bir kesme noktası ayarlayarak teorik kütle listesini deneysel olarak gözlemlenen kütlelerle eşleştirin. Hidrojen döteryum değişiminde, proteinin açılması hidrojenin döteryum ile yer değiştirmesine olanak tanır; yapılarını koruyan proteinler ise döteryum değişimine daha az eğilimlidir. Taloz içeren ve sorbitol içeren miyoglobin formülasyonları üzerinde katı hal hidrojen döteryum değişimi kütle spektrometrisi gerçekleştirildiğinde, sorbitol içeren formülasyon %46 daha fazla döteryum alımı göstermiştir; bu durum, sorbitol içindeki miyoglobin yapısının litik süreç sırasında daha fazla bozulduğunu göstermektedir.Foto-lösin, erişilebilir amino asit yan zincirlerine çapraz bağlanır. Sorbitol ve TLO'lar içeren miyoglobin formülasyonlarının katı hal fotolitik kütle spektrometrisi analizi, TLO'lar formülasyonunda karşıt formülasyona göre daha fazla foto-lösin alımı olduğunu göstermiştir. Bu durum, TLO'lar formülasyonunda yan zincirlerin erişilebilir kaldığını göstermektedir.Hem hidrojen döteryum değişimi hem de litik etiketleme, herhangi bir formülasyon için katı haldeki proteinleri karakterize etmek amacıyla ticari olarak mevcut bölgeleri ve kolayca erişilebilen MS cihazlarını kullanır. Numune hazırlığından veri analizinin tamamlanmasına kadar geçen toplam süre iki haftadan azdır. Bu videoyu izledikten sonra, protein yapısı hakkında yüksek çözünürlüklü bilgilerin nasıl elde edileceği ve bunun stabil liyofilize protein formülasyonlarının tasarımındaki önemi hakkında kapsamlı bir anlayış kazanmış olacaksınız.

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Kütle spektrometresi (MS) yapısı incelenmesi ve makromoleküllerin derlemeler dinamikleri için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, protein kompleksi oluşumu ve ligand sorgulamaya MS tabanlı yaklaşımlar entegre.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Burada, nasıl küçük açı X-Ray saçılma (SAXS) düşük çözünürlüklü zarflar makromoleküllerin yapıları temsil eden hakkında bilgi edinmek için kullanılması gereken mevcut. X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikleri ile birlikte kullanıldığında, SAXS detaylı yorumlara çok etki alanlı proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri çözüm sağlayabilir.

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Lanthipeptide sentezleri peptit doğal ürünlerin biyosentezi sırasında katalizör multistep reaksiyonları. Burada, lanteptid sentezlerinin konformasyonel dinamiklerini ve peptit doğal ürün biyosentezinde yer alan diğer benzer enzimleri incelemek için bunların kullanılabileceği sürekli, aşağıdan yukarıya, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS) iş akışını açıklıyoruz.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Öğrenin, liyofilize protein tozlarında yüksek çözünürlüklü yapı analizi için katı hal hidrojen/deuterium değişim ve fotolitik etiketleme kütle spektrometrisi yöntemlerini. Formülasyon tasarımında yapısal bütünlüğü değerlendirin.

Kitle Spektrometrik Liyofilize Toz Protein Yapısı ve Etkileşimler Eğitim Yaklaşımları

Daha fazla video keşfet